I detta protokoll, fluorescently märkt T. cruzi skulle injiceras i genomskinliga zebrafiskar larver och parasit motilitet observerades i vivo med lätta blad fluorescensmikroskopi.
Chagas sjukdom är en parasitinfektion som orsakas av Trypanosoma cruzi, vars motilitet inte är bara viktigt för lokalisering, men också för cellulära bindande och invasion. Nuvarande djurmodeller för att studera T. cruzi tillåta begränsad granskning av parasiter in vivo representerar en utmaning för förståelse parasit beteende under det inledande skedet av infektionen hos människor. Detta protozo har ett flagellar skede i både vektor- och däggdjur värdar, men det finns inga studier som beskriver dess motilitet i vivo. Syftet med detta projekt var att skapa en levande ryggradsdjur zebrafiskar modell för att utvärdera T. cruzi motilitet i kärlsystemet. Genomskinliga zebrafiskar larver injicerades med fluorescently märkt trypomastigotes och observerade använder ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM), en icke-invasiv metod att visualisera levande organismer med hög optisk upplösning. Parasiter kan visualiseras för längre tid på grund av denna teknik relativt låg risk för åldrad hud jämfört med confocal eller epifluorescence mikroskopi. T. cruzi parasiter observerades resor i cirkulationssystemet av levande zebrafiskar i olika stora blodkärl och äggulan. De kunde också ses bifogade till väggens gulesäcken och atrioventrikulärt ventilen trots de starka krafter som är associerad med hjärtat sammandragningar. LSFM av T. cruzi-inokulerade zebrafiskar larver är en värdefull metod som kan användas för att visualisera cirkulerande parasiter och utvärdera deras tropism, migrationsmönster och motilitet i dynamiska miljön av det kardiovaskulära systemet av ett levande djur.
Chagas sjukdom orsakas av en protozo parasit T. cruzi. Cirka 6 till 7 miljoner människor i världen är infekterade med T. cruzi. Sjukdomen överförs främst i Latinamerika, men har rapporterats i USA, Kanada, och många europeiska samt vissa Western Pacific länder, främst på grund av migration av infekterade individer1. Chagas är till stor del vektorburna och överförs till människor genom kontakt med avföring från hematophagic insekter i Triatominae underfamiljen, allmänt känd som ”kysser fel”. Dock kan T. cruzi också överföras via blodtransfusioner, vertikal överföring från mor till barn, eller intag av livsmedel som förorenats med parasiter2. Den akuta fasen infektionen är främst eller konstitutivt symtom och varar mellan 6 till 8 veckor, varefter engagemang av immunsystemet styr parasit belastning, men eliminerar inte helt infektion3. De flesta individer anger sedan en kronisk asymptomatisk fas; dock utvecklar nästan 30% av patienterna en symtomatisk kronisk fas, där hjärt systemet och mindre ofta till mag och nervsystem är komprometterad4. Detta scenario innebär en utmaning för sjukdomsbehandling och kontroll eftersom det finns inget vaccin finns, och det finns endast två effektiva läkemedel för Chagas: benznidazole och nifurtimox. Båda behandlingarna kräver långvarig administrering och kan ha allvarliga biverkningar2.
Ökad förståelse för beteendet för T. cruzi är beteende i vivo avgörande för att fastställa parasitiska migration, cellulära fastsättning och invasion inom mottagande; en brist i vivo modeller begränsar utvecklingen av nya terapeutiska metoder. In vitro studier för T. cruzi infektion har visat att motilitet av trypomastigotes är viktigt för bindning till värd cellmembran och efterföljande cellulära invasion5. Energi utarmning i trypomastigotes i samtidig kultur med en mottagliga cellinje har visat sig minska cellulära invasion6. Intressant, i trypanosomatids karaktäriserats flagellar rörelse också som en skatteflykt mekanism mot parasit-specifika antikroppar7.
Flagellar motilitet har varit flitigt studerade in vitro- i Trypanosoma brucei, närbesläktade parasit som orsakar afrikansk Trypanosomiasis8. In vitro studier av motiliteten av dessa innebörder visade att simulering av villkoren i blod eller kroppsvätskor, inklusive viskositet och förekomsten av hinder som är representativa av blodkroppar, är viktigt för parasit framåt rörelse9 . Som av ännu varit det inte möjligt att visualisera förflyttning av parasiter i blodet i vivo.
Zebrafiskar larverna är en kraftfull modell för att studera värd-patogen interaktioner i vivo. De är små, billig och relativt lätt att höja när jämfört med andra etablerade ryggradsdjur modeller för Chagas sjukdom. Zebrafisk har medfödd och adaptiv immunsystem liknar människor, men deras adaptiva immunsystemet börjar utvecklas på 4 dagar efter befruktning (dpf) och är inte mogen för ytterligare flera veckor10. Under tidig utveckling, när endast makrofager är närvarande, finns det ett stort fönster för att studera parasit beteende utan omedelbar immun störningar10. Den största fördelen med att utnyttja zebrafiskar larver som ryggradsdjur modell för att studera patogen beteende ligger dock i deras optisk transparens, vilket gör dem mottagliga för mikroskopiska screening och imaging11. Dessutom finns det flera verktyg för att manipulera fisk genetik. Till exempel är Casper stammen en mutant rad zebrafiskar med ingen pigmentering, gör djuret helt transparent och användbar för visualisering av enskilda organ och för realtidsspårning av injicerade cellerna12.
En viktig begränsning av längsgående observation av snabbt rörliga parasiter i levande zebrafiskar använder confocal eller epifluorescence mikroskopi ligger i omöjligheten av imaging vid hög förvärv hastigheter och stor penetration djup med bra bildkvalitet och låga risk för åldrad hud. Ljusa blad fluorescens micsroscopy (LSFM) är en framväxande bildteknik som övervinner dessa begränsningar för att tillåta dessa observationer. Med ett mål för att upptäcka fluorescens och ett andra ortogonala belysning mål som bara lyser fokalplanet upptäckt målet, är det möjligt att få högupplöst optisk sektioner som i en confocal mikroskopet, men med betydligt minskad åldrad hud, även med avseende på epifluorescence mikroskopi13. Den LSFM teknik som används här som kallas enda planet belysning mikroskopi (SPIM), där ett tunt ljus lyser upp ett enda plan inom larvaena zebrafiskar.
Syftet med denna metod är att etablera larval zebrafiskar som en livskraftig icke-infektion modell för att förstå T. cruzi motilitet och beteenden i vivo. För att åstadkomma detta, vi injicerade genomskinliga zebrafiskar larver med fluorescently märkta trypomastigotes, cellulär form ansvarar för infektion av människor, och identifierade rörligheten för T. cruzi i kardiovaskulär cirkulationen av zebrafisk använda LSFM.
Denna studie belyser fördelarna med zebrafiskar som en djurmodell för att studera patogen beteende i vivo. I synnerhet denna studie föreslår en metod för att visualisera patogenet T. cruzi i sin naturliga miljö: hematic omsättning. Miljön av den cirkulatoriska närmiljön i fisk är jämförbar med däggdjur, och trypanosomatids har utvecklats mekanismer för resor, undkomma immunförsvaret och fästa till celler för infektion i denna miljö25. Detta protokoll ger en beskrivning av ett optimalt förfarande för kultur av T. cruzi i en human cellinje och efterföljande isolering av flagellar former för fluorescerande märkning. Det visar sedan lämpliga inställningar för framgångsrika injektion av parasiterna i genomskinliga zebrafiskar för senare montering och visualisering med hjälp av LSFM. Slutligen ger detta protokoll förslag på effektiva i vivo imaging parasit läge och rörelse i omlopp med LSFM.
Flagellen av innebörder framgår dess bakre regionen, flödar från cellkroppen, och låser sig gratis på den främre delen av organismen26. T. cruzi framdriver sig genom att vifta flagellen framför kroppen, som böljer parasitens hela kroppen. Flagellar rörelse är inte bara oumbärligt för parasit motilitet, som i fallet med T. brucei27 (vilka smittämnen av afrikansk trypanosomiasis), men det används också för cellulära infektion, vilket har visats i T. cruzi5 ,28. Även om zebrafiskar inte de naturliga värdarna för T. cruzi, kan parasitens motilitet studeras i en utveckla hjärt-cirkulationssystem med de protokoll som beskrivs här. Dessutom finns det innebörder arter som infekterar mörtfiskar, klassen av zebrafiskar, såsom T. carassii och T. borreli25. Dessa parasitarter kunde användas för att studera i realtid rörelser och kvarstad mekanismer av dessa trypanosomatids; sådana studier kan ge insikt i däggdjursceller infektionsprocessen.
I denna studie injiceras motila T. cruzi parasiter var observerade reser genom kardiovaskulära cirkulationen av inokulerade fisk, flyttar tillsammans med ogenomskinlig erytrocyter och ansluter sig till strukturer i hjärt-kärlsystemet väggarna. Vi använde en hembyggda LSFM med en 10 X akromatisk långa arbetsavstånd luft mål (17,6 mm) för belysning armen med en numerisk bländare på 0,25. En 40 X apokromatiska vatten nedsänkning mål med en numerisk bländare på 0,8 och ett avstånd om 3,5 mm användes för detektion armen. Syftet upptäckt var nedsänkt i provkammaren, medan syftet belysning var utanför kammaren. En port i kammaren förseglas med ett täckglas och optiska lim tillåtet för belysning balken ange kammaren, som skildras i Lorenzo o.a. 18 för belysning, vi använde en 50 mW DPSS laser på 488 nm vars makt var moduleras av ett Acousto optiskt avstämbara Filter. Upptäckt sökvägen används filter kompatibelt med grönt fluorescerande Protein (GFP) eller FITC. Ljus ark Mikroskop utrustat med kapillär provhållare (helst med automatisk rotation) och temperaturkontroll av provkammaren bör vara lämplig för denna ansökan. Mikroskopet bör anpassas och kalibreras enligt tillverkarens anvisningar eller användarens laboratorium standardprotokoll före förvärv, om det behövs. I detta protokoll kontrollerade vi mikroskopet med SPIM programvara19.
Det är viktigt att notera att i cirkulationen av zebrafiskar, larver parasitiska fastsättning är effektiv. I kardinal anda förblev parasiter knuten för upp till flera minuter. i hjärtat höll de på att ventiler och väggar, oscillerande med hjärtat sammandragningar. Ytterligare studier återstå för att klarlägga huruvida T. cruzi interagerar med de flödande erytrocyter som drift i riktning mot blodflödet. Tidigare in vitro- studier har visat att förekomsten av fasta strukturer (dvs, blodkroppar) eller ökad viskositet vätskan att efterlikna blod in vitro-, har en betydande effekt på motilitet och hastighet av parasiten 9.
Det finns många frågor angående kursen av infektion av T. cruzi hos människa efter amastigotes fly Fagocytos celler, de initialt infekterade cellen typ29. Till exempel hur kommer de fram till sina målorgan? Vilka är mekanismerna för tropism till Rekommenderad organ, såsom hjärt-, mag- och centrala nervsystemet? Intressant i denna studie var parasiter ursprungligen avbildas i hjärtat eftersom det var platsen för högsta täthet av parasiter. Dock CFSE signalen därefter ackumuleras i utvecklingsländer tarmen av 7 dagar efter injektionen. Även fisk och däggdjur anatomi är olika, visar resultaten av denna studie en form av tropism, som observerades det att parasiter uppvisade tropism mot kända Rekommenderad målorgan trots organismers skillnader. En betydande begränsning av denna studie rör temperaturen används i experiment. Zebrafiskar larver bör hållas runt 28 °C under hela förfarandet. Även om denna temperatur kan vara liknande till vektor värden (insekter av Triatominae underfamiljen), är det helt annorlunda från de varmblodiga däggdjur som utgör de slutliga värdarna (cirka 37 ° C). T. cruzi är kända för att ha flagellar levande former i båda värdarna; Det är dock viktigt att komma ihåg att denna faktor kan ha en effekt i beteendet hos djur i vivo.
Även om det fish´s adaptiva immunsystemet inte är mogna förrän 4 veckor efter befruktningen, är det medfödda immunsystemet aktiv tidigt i utvecklingen10. Så tidigt som 48 eller 96 hpf, observerades Fagocytos celler har uppslukat märkt innebörder (inga data anges). Detta begränsar fönstret tid för visualisering av parasiten. Dock om en studie var att fokusera på utvärdering av fish´s immunsvaret, kan injektion i senare skeden rekommenderas. Injektion av parasiter i transgen fisk linjer med märkta makrofager eller andra celler i immunförsvaret kan också användbart i att studera parasit fastsättning och möjliga endocytos mekanismer. Det är viktigt att notera att om parasiter är märkta med CFSE, transgena cell etiketter bör inte GFP och en markör i den gula eller röda änden av spektrumet krävs.
För att bedöma parasit detaljerad rörelseriktning, kan det vara användbart att följa sin bana i 3 dimensioner (3D). För 3D-visualisering och återuppbyggnad av processen är ett höghastighetståg system nödvändigt. Med den utrustning som används i detta protokoll, är det endast möjligt att visualisera parasiter i ett plan. I det här fallet prioriterat vi att upprätthålla fokalplan stabilitet under parasit rörelsen och registrerar dess bana i ett plan.
Den metod som föreslås här banar väg för ytterligare undersöka parasit beteende i kardiovaskulär omlopp. Sammanfattningsvis är grundläggande stegen för imaging levande fluorescerande parasiter inuti zebrafiskar larver:(i) användning av tidiga kläckta embryon (24-48 hpf) eller larver, eller djur mellan 72-96 hpf med ingen pigmentering så att de är öppet och lätt att injicera; (ii) bild larver så snart som möjligt efter injektion för att undvika parasit clearance av Fagocytos celler; och (iii) fokusera på LSFM på platsen av intresse (t.ex., perikardiell regionen) och behålla fokus. Detta nya förfarande tillåter visualisering av trypomastigotes i en miljö jämförbar med dess naturlig infektion nisch, som ger för första gången möjligheten att studera T. cruzi i en levande organism.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den Convocatoria Interfacultades från Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes, och programmet USAID forskning och Innovation Fellowship. Vi tackar Juan Rafael Buitrago och Yeferzon Ardila för fisk underhåll och hjälp.
0.5-10 μL Micropipette | Fisherbrand | 21-377-815 | |
Agarose RA | Amresco | N605 | Regular |
Agarose SFR | Amresco | J234 | Low Melting point |
Aquarium salt | Instant ocean | SS15-10 | |
Cell Count chamber | Boeco | Neubauer | |
Cell culture flasks | Corning | 430639 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
Detection objective | Nikon 40x 0.8NA | 40x CFI APO NIR | |
DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5648 | |
Dumont #5 fine forceps | World precision Instruments | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Fetal calf serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Filter | Chroma | ET-525/50M | |
Glass capillaries for embryo mounting | Vitrez Medical | 160215 | |
Glass capillaries for pulling needles | World precision instruments | TW100-4 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
HEPES | Gibco | 156300-80 | |
Incubator | Thermo Corporation | Revco | |
Larval microinjection mold | Adaptive Science Tools | I-34 | |
Laser | Crystalaser | DL488-050 | |
L-glutamine | Gibco | 250300-81 | |
Methylene blue | Albor Químicos | 12223 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
Micromanipulator system | Sutter Instrument | MP-200 | For LSFM |
Micropipette puller device | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Olympus | CX31 | |
Microscope (inverted) | Olympus | CKX41 | |
Multipurpose microscope | Nikon | AZ100M | |
Neubauer counting chamber | Boeco Germany | ||
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-163 | |
Petri dish 94×16 | Greiner bio-one | 633181 | |
Plastic pasteur pipette | Fisherbrand | 11577722 | |
Rotation stage | Newport | CONEX-PR50CC | |
RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R4130 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Stereoscope | Nikon | C-LEDS | |
Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
TRIS | Amresco | M151 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | R-001-100 | |
Tubes 15 ml | Corning | 05-527-90 |