Summary
Cet article décrit un protocole pour la détection d’un ou plusieurs plasma et/ou des protéines de la membrane intracellulaire Super-résolution par appauvrissement de l’état fondamental (GSD) microscopie en cellules mammifères. Ici, nous discutons des avantages et des considérations d’utiliser ces approches pour la visualisation et la quantification des protéines cellulaires.
Abstract
Avances en fluorescente microscopie et biologie cellulaire sont intimement corrélées, avec la meilleure possibilité de visualiser les événements cellulaires qui conduit souvent à des sauts spectaculaires dans notre compréhension de la façon dont les cellules fonction. Le développement et la disponibilité de microscopie de Super-résolution a considérablement étendu les limites de la résolution optique de ~ 250-20 nm. Les biologistes ne sont plus limités à décrire des interactions moléculaires en termes de colocalisation dans une zone de diffraction limitée, plutôt il est maintenant possible de visualiser les interactions dynamiques des molécules individuelles. Ici, nous exposons un protocole pour la visualisation et la quantification des protéines cellulaires par microscopie appauvrissement fondamental pour l’imagerie cellulaire fixe. Nous fournissons des exemples tirés de deux protéines membranaires différents, un élément de la translocon réticulum endoplasmique, sec61β et un membrane plasmique localisée voltage-dépendant type L2 + canal Ca (CaV1.2). Discutés sont les paramètres spécifiques de microscope, méthodes de fixation, photo-commutation formulation de tampon et pièges et défis du traitement de l’image.
Introduction
Réactions de signalisation cellulaires traduisent des environnements internes et externes pour amorcer une réaction cellulaire. Ils réglementent tous les aspects de la physiologie humaine, servant de la Fondation pour l’hormone et la libération des neurotransmetteurs, le rythme cardiaque, vision, de fertilisation et la fonction cognitive. Perturbation de ces cascades de signalisation peut avoir des conséquences graves dans la forme de conditions physiopathologiques, y compris le cancer, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. Pendant des décennies, les enquêteurs biologiques et médicales ont utilisé avec succès protéines fluorescentes, sondes et biocapteurs couplées avec la microscopie en fluorescence comme les principaux outils pour comprendre l’organisation spatiale et temporelle précise de ces cellulaires les signaux.
Les points forts de techniques optiques tels qu’épifluorescence, confocale, ou la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne sont leur sensibilité, la vitesse et la compatibilité avec l’imagerie de cellules vivantes, alors que la limitation majeure est leur résolution diffraction-limited, structures de sens ou complexes de protéines inférieures à 200-250 nm ne peut pas être résolus. Avec le développement théorique et pratique de Super-résolution déterministe (par exemple, émission stimulée appauvrissement microscopie STED1, structuré microscopie d’illumination (SIM2) ou stochastique Super-résolution (par exemple , appauvrissement de microscopie (PALM3), ou état fondamental localisation photoactivation (GSD4,,5)), la résolution latérale et axiale en microscopie de fluorescence a été étendue au-delà de la barrière de la diffraction, à l’ordre de dizaines de nanomètres. Ainsi, les enquêteurs ont maintenant la capacité inégalée de visualiser et de comprendre comment les organisation et dynamique des protéines se traduit en fonction au niveau moléculaire près.
État fondamental microscopie appauvrissement suivie de chaque molécule de retour (GSDIM), ou simplement de GSD comme on le sait, contourne la limite de diffraction en réduisant le nombre d’émettre simultanément des fluorophores4,5. Lumière laser de haute énergie est utilisée pour exciter l’échantillon marqué au fluorophore, bombardement d’électrons avec des photons et augmentation de la probabilité, ils subissent un « renversement de spin » et entrez le triplet ou « dark-état » de l' état excité4. Cela épuise efficacement l’état fondamental, d'où le nom « au sol appauvrissement de l’Etat ». Dans l’état de triplet, fluorophores n’émettent pas de photons et l’échantillon apparaît gradateur. Toutefois, ces fluorophores stochastique retournent à l’état fondamental et peut passer par plusieurs photons émettant des transitions d’état excité-sol avant de retourner à l’état de triplet. Avec moins générant des fluorophores à un moment donné, éclats de photon émis par fluorophores individuelles devenus distincts dans le temps et l’espace des voisins des fluorophores. L’éclatement des photons peut être adapté avec une fonction gaussienne, le centre de gravité calculé qui correspond à la position du fluorophore avec une précision de localisation qui est tributaire de l’ouverture numérique (NA) de la lentille, la longueur d’onde de la lumière utilisée pour excitation et surtout, le nombre de photons émis par un fluorophore. Une des limitations de GSD est que, étant donné que seul un sous-ensemble des fluorophores émet activement à tout moment, des milliers d’images doivent être prélevés sur plusieurs minutes à mettre en place une carte de localisation complète. Le temps d’acquisition longue combiné à l’exigence de puissance laser haute, signifie que GSD est mieux adaptée pour fixe plutôt que des échantillons vivants.
Cet article décrit la préparation d’échantillons fixes pour l’imagerie microscopie Super-résolution de membrane et le réticulum endoplasmique (re)-protéines résidentes (pour une liste des consommables et réactifs pour voir la Table des matières). Exemples de comment ce protocole peut être facilement adapté pour quantifier la taille et le degré de regroupement de voltage-dépendants Ca2 + canaux de type L (Cav1.2) dans le sarcolemme des myocytes cardiaques, ou utilisé pour visualiser la distribution cellulaire de l’ER, sont illustrés. Comprendre la répartition et l’organisation de ces composants cellulaires est extrêmement important dans la compréhension de l’initiation, la traduction et en fin de compte la fonction de nombreux Ca2 +-dépendantes cascades de signalisation. Par exemple, Cav1.2 canaux sont fondamentalement important pour couplage excitation contraction, tandis que libération2 + Ca médiée par les récepteurs de l’ER est peut-être la cascade de signalisation plus omniprésente dans les cellules de mammifères.
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Protocol
1. lavage des lamelles de verre
- la veille du traitement des échantillons, nettoyer les lamelles de verre #1.5 par sonification dans une solution de 1 M de KOH pendant 1 h. Cette commande supprime tous les contaminants fluorescents qui peuvent être présents sur les lamelles.
- Rincer abondamment le KOH depuis les lamelles couvre-objet avec de l’eau déionisée.
- Une fois nettoyé dans KOH, stocker les lamelles dans l’éthanol à 70 % jusqu'à utilisation.
2. Lamelles de verre enduit
Remarque : étapes de cette section doivent être effectuées sous une hotte de culture cellulaire pour éviter la contamination.
- Utiliser des pinces pour enlever une lamelle couvre-objet individuel de la solution d’éthanol à 70 % et la flamme rapidement pour enlever l’excédent. Placer les lamelles dans une assiette de 6 puits. Si les flammes sous une hotte de culture n’est pas une option, envisager autoclavage les lamelles après le rinçage avec de l’eau déminéralisée ou de stérilisation sous les ultraviolets dans le capot de la culture pendant au moins 30 min.
- Pour faciliter l’adhérence des cellules, enrober les lamelles couvre-objet avec 0,01 % poly-L-lysine stérile pendant 1 h à température ambiante.
- Aspirer la poly-L-lysine et rincer les lamelles couvre-objet avec du sérum physiologique stérile tamponnée au phosphate (PBS). Sécher à l’air et placer au réfrigérateur pendant la nuit.
- Le lendemain matin, enlever les lamelles du réfrigérateur et ajouter 300 µL de laminine, à une concentration de 50 µg/mL, pendant au moins 30 min à température ambiante. S’assurer que la laminine est soigneusement placée directement sur la lamelle couvre-objet.
Remarque : Cette étape de la laminine n’est pas nécessaire pour les cellules COS-7 ou cellules HEK293 mais est nécessaire pour des myocytes ventriculaires isolées. Autres cellules primaires telles que les cellules musculaires lisses vasculaires ou des neurones peuvent adhérer mieux au collagène ou la fibronectine enduit lamelles.
3. Préparation des cellules
- les cellules cultivées se développer COS-7 cellules (ou lignée cellulaire préféré) sur une boîte de Petri de 10 cm sur 10 mL Dulbecco ' s Eagles modifié (DMEM) milieu de culture additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % solution de pénicilline/streptomycine (PS). Cultiver les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO 2.
- Lorsque les cellules atteignent 90 % confluence, récolter de la capsule de 10 cm en aspirant les médias DMEM et en ajoutant 5 mL de solution de trypsine-EGTA 0,05 %. Une fois que les cellules commencent à rassembler et à se détacher, immédiatement neutraliser la trypsine avec DMEM supplémenté.
- Utiliser 5 mL pipette sérologique pour enlever les cellules de la capsule. Pipeter le support contre la base du plat plusieurs fois pour enlever toutes les cellules qui restent adhérentes et de façon homogène distribuer les cellules dans tout le milieu de culture.
- Sur les récipients de culture de 35 mm pour atteindre 70 % confluence pour la transfection des cellules de la plaque. Rendre le volume de liquide dans le plat à 2 mL avec une solution fraîche DMEM/FBS/ch. Constructions de
- cellules de transfecter COS-7 avec l’ADN de plasmide souhaitée (par exemple, sec61β-mCherry plasmide), utilisant un réactif approprié de transfection et selon le fabricant ' instructions de s.
Remarque : Il peut prendre 24-48 h pour la protéine d’exprimer, selon le plasmide et/ou le réactif de transfection utilisé.
- Souris adulte myocytes ventriculaires
- isoler les myocytes ventriculaires de souris adultes à l’aide de la méthode de perfusion bien établie Langendorff 6. Resuspendre le culot résultant des myocytes en milieu 199 (M199) additionné de 2,5 % de SVF et 1 % PS.
4. Placage de cellules
- des cellules COS-7 transfectées aspirer 2 mL de solution DMEM/FBS/PS du plat de 35 mm et ajouter 1 mL Ca 2 +-gratuit PBS. Remettez le plat dans l’incubateur pendant 2 min. cellules de récolte du plat en aspirant premier du Ca 2 +-gratuit PBS et puis en ajoutant 1 mL de solution de trypsine-EGTA 0,05 %.
- Une fois que les cellules commencent à arrondir et de détacher, de neutraliser immédiatement la trypsine avec 1 mL de DMEM supplémenté. Pipetez doucement et descendre plusieurs fois pour s’assurer que les cellules transfectées sont répartis uniformément sur la suspension de la trypsine-EGTA-DMEM mL 2.
- Plaque transfecté des cellules COS-7 sur lamelles enduits poly-L-lysine à une densité appropriée afin que les cellules individuelles peuvent être visualisées et remplissent le volume plat à 2 mL avec DMEM/FBS/PS (par exemple, ajouter 90 µL de la suspension cellulaire à la lamelle puis ajoutez 1 910 µL complétée DMEM, swirl plat pour répartir les cellules).
Remarque : Les cellules ne doivent pas être comptées mais le volume des cellules à ajouter à chaque assiette variera selon la confluence des cellules. - Retour plaqué l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit pour permettre à des cellules d’adhérer et de récupérer des cellules.
- des cellules COS-7 transfectées aspirer 2 mL de solution DMEM/FBS/PS du plat de 35 mm et ajouter 1 mL Ca 2 +-gratuit PBS. Remettez le plat dans l’incubateur pendant 2 min. cellules de récolte du plat en aspirant premier du Ca 2 +-gratuit PBS et puis en ajoutant 1 mL de solution de trypsine-EGTA 0,05 %.
- Souris adulte myocytes ventriculaires
- aspirer des myocytes laminine et plaque directement sur les lamelles couché à une densité appropriée afin que les cellules individuelles peuvent être visualisées. Cela dépendra de la densité de cellules viables obtenus de l’isolement.
- Équilibrer la suspension cellulaire dans un dôme sur la lamelle couvre-objet et le place dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO 2 pour ~ 45 min permettre l’adhérence.
5. Fixation des cellules
- éliminer les cellules de l’incubateur et aspirer soigneusement le support de.
- Rincer les cellules adhérentes une fois avec du PBS.
- Fix cellules avec un fixateur optimisé à la demande individuelle et anticorps.
Remarque : Un critère important à garder à l’esprit lorsque vous sélectionnez un fixateur est la préservation de la structure cellulaire de l’échantillon, tout en s’assurant qu’il n’y a aucun changement de conformation de l’antigène d’intérêt. Aux fins de la fixation de ce protocole avec 3 % paraformaldehyde/0.1% glutaraldéhyde (PFA/GA) et fixation avec 100 % méthanol est discutée.
- PFA/GA fixation de COS-7 transfectées cellules exprimant Sec61β-mCherry
- mélanger 1,9 mL 16 % PFA et 20 µL 50 % GA et ajouter PBS pour rendre un volume final de 10 mL.
- Ajouter 1 mL fraîchement préparés solution PFA/GA à chaque plat des cellules et fix pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer les cellules PFA/GA et rincer 3 fois avec du PBS.
- Laver les cellules adhérentes avec PBS, 5 fois pendant 5 min chaque. Effectuez toutes les étapes de lavage sur un rotateur défini à une vitesse modérée (par exemple, 50 cycles par minute).
- Ensuite, réduire les groupes aldéhyde libre avec 1 mL fraîchement préparés 0,1 % masse/volume le borohydrure de sodium dans de l’eau déionisée.
- Rinçage cellules deux fois puis laver 3 fois pendant 5 min dans du PBS pour éliminer toute trace de borohydrure de sodium et de l’alcool qu’elle produit lorsqu’il réagit avec les aldéhydes libres chacun.
- Fixation de méthanol des myocytes ventriculaires de souris adulte
- soigneusement ajouter 1 mL de méthanol glacé de 100 % aux cellules. Inclinaison de la plaque 6 puits et Pipeter le méthanol contre la paroi latérale et non directement sur la lamelle couvre-objet. Puis inclinez la plaque 6 puits, retour à l’horizontale pour permettre le méthanol se laver régulièrement sur les cellules. Difficulté pendant 5 min à-20 ° C.
- Aspirer les cellules fixateur et rincer 3 fois avec du PBS.
- Laver les cellules adhérentes avec PBS, 5 fois pour 5 min chacun sur un rotateur.
6. Liaison Non spécifique de blocage
- bloc pendant 1 h à température ambiante dans la solution de blocage (voir la Table des matières).
NOTE : Différentes solutions peuvent être utilisées pour bloquer la liaison anticorps non spécifiques, y compris 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) ou non immuns sérum de la même espèce que l’anticorps primaire.
7. Détection
- aspirer la solution de saturation de l' incubation de l’anticorps primaire. Ne pas laver ou rincer.
- Préparer la solution d’anticorps primaire comme suit (Voir l’étape 7.1.5) : diluer l’anticorps primaire à une concentration de 10 µg/mL (ou le fabricant ' s a suggéré de concentration) dans la solution d’incubation anticorps (voir la Table des matières ). L’équilibre de ce petit volume sur la lamelle couvre-objet et soigneusement définir un carré de film plastique paraffine sur le dessus. Cela aide à étaler le faible volume des anticorps sur la lamelle couvre-objet et protège contre l’évaporation.
- Placer la plaque de 6 puits dans une chambre humide et incuber pendant la nuit dans le réfrigérateur.
- Le matin, retirez les cellules de la chambre de l’humidité, soigneusement retirer le film de paraffine carré de la surface de la lamelle et aspirer la solution de l’anticorps primaire.
- Rinçage 3 fois avec du PBS, puis se laver 5 fois pendant 5 min avec bloc solution de lavage (voir Table des matières) sur le rotateur.
Remarque : Ce protocole utilise les anticorps suivants, anti-DP anticorps monoclonal de souris pour les images affichées à la Figure 2 et lapin polyclonal FP1 7 anti-Ca V 1.2 anticorps (un cadeau de Prof. L’enfer de Johannes, UC Davis) pour les images affichées à la Figure 3. En ce qui concerne la chambre humide, une boîte à lunch en plastique avec un couvercle bien ajusté, garni de serviettes en papier humides travaux. PBS peuvent être utilisés pour le lavage des étapes, mais ce protocole améliore la spécificité étiquetage et réduit l’arrière-plan à l’aide d’une solution diluée de blocage pour le lavage des étapes.
- Incubation anticorps secondaire
- aspirer la solution de lavage et ajouter 200 µL conjugués anticorps secondaire solution diluée 1 : 1 000 dans la solution d’incubation anticorps. Placez un carré de film de paraffine sur le dessus de la lamelle couvre-objet (voir étape 7.1.2).
- Laisser incuber pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Anticorps secondaire aspirer et rincer 3 fois avec du PBS.
- Laver les cellules avec une solution diluée de blocage 5 fois pendant 5 min sur la bascule.
- Lavage 3 fois pendant 5 min avec du PBS.
Remarque : Ce protocole décrit l’utilisation de l’anticorps secondaire conjugué d’anti-souris Alexa 647 et anticorps secondaire conjugué de anti-lapin Alexa 647 Figure 2 et Figure 3, respectivement. Pour la seule protéine étiquetage, Alexa 647 est le fluorophore préféré en raison de son nombre de photons haute (améliore la précision de localisation) et faible rapport cyclique (améliore la résolution temporelle) 8. Il existe beaucoup d’autres options anticorps secondaire conjugué à un fluorophore, comme Cy-colorants, ou Atto. Reportez-vous à Dempsey et al. 8 et Chozinski et al. 9 pour des évaluations globales de la pertinence de plusieurs fluorophores/colorants pour l’imagerie de Super-résolution.
8. Après fixation (étape facultative)
- diluer 50 µL 50 % GA dans 10 mL de PBS pour obtenir une solution de GA de 0,25 %. Fixer les cellules pendant 10 min dans cette solution à température ambiante.
- Laver avec du PBS 3 fois pendant 5 min sur un rotateur.
9. Conservation des échantillons
- conserver les échantillons au réfrigérateur (4 ° C) dans un récipient en aluminium doublé pour protéger de la lumière jusqu'à imagerie.
- Pour le stockage à long terme des échantillons (jusqu'à plusieurs mois), stocker dans du PBS contenant de l’azide de sodium 3 mM pour empêcher la croissance bactérienne.
10. GSD Super-resolution Imaging Photoswitching tampon préparation
- préparer l’oxygène balayage ' GLOX ' solution comme suit :
- dans un tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 12,5 catalase µL (stock 34 mg/mL), 3,5 mg glucose oxydase et 0,5 µl 1 M Tris (pH = 8) à 49,5 µL PBS.
- Vortex brièvement pour dissoudre les composants dans la solution puis centrifuger à 20 800 g pendant 3 min à 4 ° C.
Remarque : les solutions oxygène-nettoyage comme GLOX, ont été trouvés pour s’opposer à photoblanchiment. GLOX doit être conservé au réfrigérateur jusqu'à une semaine. Répétez l’étape de centrifugation chaque fois qu’il est utilisé.
- Solution de thiol Prepare le photoswitching induisant comme suit :
- préparer la solution de β-mercaptoethylamine (MEA) de 100 mM dans du PBS et modifier le pH pH 8 ou, subsidiairement, utilisation de β-mercaptoéthanol (βME). Conserver aliquotés MEA solution dans le congélateur (-20 ° C) pendant 1 semaine.
- Immédiatement avant l’imagerie, préparer le dernier tampon de commutation sur la glace en ajoutant le thiol et oxygène-nettoyage composants ensemble. Pour 500 µL GLOX-MEA, ajouter 5 µL GLOX dans 50 µL MEA (pH = 8) et 445 µL de tampon salin (2,5 mL 1 M Tris pH = 8, 29,22 mg NaCl (concentration finale de 10 mM), 5 g de glucose et 47,5 mL d’eau). Sinon, pour la solution de GLOX-βME ajouter 5 µL GLOX à 5 µL βME et 490 µL de tampon salin.
- Conserver les solutions sur la glace et utiliser au besoin pour monter des échantillons sur lames de verre dépression.
NOTE : Thiol contenant des solutions telles que βME ou MEA induisent photoswitching des colorants à base de cyanine comme Alexa 647 10 ou colorants xanthène base comme Alexa 568. ΒME produit des résultats meilleurs avec Alexa 647 tandis que MEA est préféré pour Alexa 568 ou lorsque les 2 protéines doivent être photographié avec une double approche étiquetage utilisant les Alexa 568 et 647. Le tampon se détériore pendant des heures à cause de l’acidification. Cela conduira à une réduction dans le nombre moyen de photons de l’échantillon. Pour éviter cela, il est conseillé de faire des frais photoswitching tampon après 2-3 h ou si une baisse dans le nombre moyen de photons ou une extension notable du temps pris pour photoswitching induite est observée. Un récent article décrit un nouveau tampon d’imagerie Ox-EA, dont nous n’avons pas encore testé, mais aurait été expositions pH stable niveaux pendant plusieurs jours et exécute mieux que GLOX multicolore imagerie demandes 11.
- Conserver les solutions sur la glace et utiliser au besoin pour monter des échantillons sur lames de verre dépression.
11. Exemples de montage
- Glisse Mont lamelles couvre-objet avec des cellules marquées (voir les sections 1 à 9) sur la dépression, à l’aide de 100 µL tampon imagerie.
- Sceller les bords de la lamelle avec une colle silicone pour éviter l’oxydation rapide de la mémoire tampon d’imagerie. Attendre plusieurs minutes jusqu'à ce que la colle silicone a complètement durci dans le cas contraire la lamelle va dériver quand imaging.
Remarque : Si elle entre en contact avec βME, colle Silicone ne durcira pas. N’oubliez pas de sécher les bords de la lamelle couvre-objet pour éviter la colle silicone en contact avec le tampon d’imagerie.
12. Acquisition d’images
- voir tableau 1 pour une liste des paramètres utilisés dans la Figure 2 et Figure 3 d’imagerie.
- Pour commencer, sélectionnez le laser approprié pour éclairer l’échantillon selon le fluorophore sélectionné. Le système SR-GSD utilisé dans le présent protocole est équipé de lasers de haute puissance (488 nm, de 1,4 KW/cm 2 ; 532 nm, de 2,1 KW/cm 2 ; 561 nm, 2,1 KW/cm 2 642 nm, 2,1 KW/cm 2). figure 2 utilise le laser nm 642.
- Utiliser un objectif à immersion dans l’huile avec une haute na Le système SR-GSD utilisé ici est équipé d’un HC PL APO 160 X / 1,43 objectif NA.
- a choisi le cube d’imagerie dichroïque approprié. Le système SR-GSD dans le présent protocole est équipé d’un HP 488-T, 532 HP-T, HP 568-T, 642 HP-T avec des filtres passe-bande d’émission de 505-605 nm, 550-650 nm et 660-760 nm.
- Sélectionner le mode d’acquisition 2D. Réglez le temps de mode et exposition de trame-transfert à 10 ms (100 Hz). La valeur du gain EM 300. Sélectionner le seuil de détection.
Remarque : Seuils bas produisent des images avec fond élevé. Des seuils élevés peuvent filtrer le signal d’intérêt. Déterminer le seuil fondé sur les témoins négatifs tels que l’imagerie des lamelles de cellules non transfectées ou cellules incubées avec l’anticorps secondaire seulement. - Allumez les préréglages de l’événement et d’événements définies par images 8.
- Entrez la taille en pixels dans l’onglet GSD-acquisition (commencer avec 10 nm ou taille de pixel 20 nm). Veiller à ce que " Mode histogramme " est sélectionné dans l’onglet Outils GSD sous les options de calcul d’image haute résolution avant l’acquisition d’images.
- De protéines à la membrane plasmique de l’image, sélectionnez le mode de la FRBR et modifier l’angle d’incidence pour déterminer la profondeur de pénétration.
- Pour envoyer des électrons à l’État foncé (appelé pompage), régler l’intensité du laser à 100 %.
- Sélectionnez détection seule molécule pendant le pompage et la valeur d’acquérir automatiquement quand la corrélation de la trame est de 0,20.
- Pour l’acquisition, définir l’intensité du laser à 50 %.
- Définir le nombre de trames de l’acquisition à 60 000.
Remarque : L’enquêteur peut trouver qu’un échantillon nécessite plus ou moins cadres que cela. Modifier le nombre d’images basé sur des observations du fluorophore photobleaching et arrêt acquisition lorsque aucun autre événement n’est détectables. - Acquisition de démarrage.
Remarque : Au début de l’acquisition, toutes les molécules de colorant sont dans l’État fluorescent et ensuite passer à l’État foncé. Quand la corrélation d’image atteint 0,20, images commenceront à être acquis. Lorsque moins de 8 événements sont détectés par image, le laser 405 s’allument, encourageant les fluorophores à la transition de l’État sombre à l’état fondamental. Lors de l’acquisition d’images pour un dataset de n = x cellules de n = y animaux, paramètres, tels que la profondeur de pénétration FRBR, seuil de détection et nombre d’images acquises doivent être maintenus constantes.
13. Analyse d’image
- afin de quantifier la taille de cluster de protéine, utiliser la ' analyser les particules ' caractéristique de ImageJ.
Remarque : Une analyse plus approfondie peut être effectuée à l’aide de l’analyse stochastique optique reconstruction localisation relative basée sur la microscopie (STORM-RLA) ou similaire 13.- Effectuer des analyses de cluster ( Figure 3) à l’aide d’ImageJ comme suit :
- ouvrir le fichier image à analyser. Ce doit être une carte localisation 10 nm en molécules simples histogramme que générée dans le logiciel d’imagerie décrit ci-dessus (section 12).
- Régler la luminosité et le contraste afin de visualiser l’image : cliquez sur le menu image, sélectionnez Ajuster, puis la luminosité et le contraste. Cliquez sur l’option auto.
- Changer le type d’image en 8 bits : sélectionnez le menu image, puis sélectionnez type et choisissez 8bits.
- Définir l’échelle de l’image : Ouvrez le menu analyser, cliquez sur échelle réglée et entrez les paramètres suivants : distance = 1, la distance connue = 10, 1 pixel = 10 nm.
- Pour sélectionner les mesures à obtenir, ouvrez le menu analyser, sélectionnez définir les mesures et cochez la case située à côté de l’option zone.
- Régler le seuil de l’image. Ouvrez le menu image, sélectionnez ajuster et sélectionnez seuil, sélectionnez dessus/dessous. Vers la valeur maximale de 255 et déplacer la valeur minimale de 1, puis cliquez sur appliquer.
- Pour analyser les particules, ouvrez le menu analyser, sélectionnez analyser les particules. Cochez pour sélectionner les unités de pixel, afficher les résultats et résumer. Définir la taille à l’infini 4 (puisque la résolution est d’environ 20 nm), sélectionnez l’option contours nu, puis cliquez sur OK. Un fichier de synthèse sera créé qui contiendra les détails d’analyse tels que la taille moyenne et le nombre de clusters dans l’image.
Remarque : Il faut être prudent quand faire des conclusions sur le nombre de protéines au sein d’un cluster particulier, comme le nombre de points localisés n’est pas linéairement corrélée avec le nombre de protéines. GSD localise les colorants qui sont conjugués d’anticorps, aboutissant à une erreur de linkage qui déplace l’étiquette fluorescente de l’épitope par > 10 nm dans n’importe quelle direction. En outre, si des anticorps polyclonaux sont utilisés, plus d’un anticorps peut se lier à un antigène unique et confondre la question encore plus loin, commercial secondaire anticorps sont conjugués, en moyenne, 3-6 molécules de colorant donc un fluorophore n’est pas toujours égale une protéine. Erreur de liaison peut être réduite en conjuguant un colorant directement à l’anticorps primaire (éliminant l’image secondaire) ou en utilisant un schéma étiquetage basé sur nanobody 14.
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Representative Results
Comme indiqué dans l’introduction, il y a nombreux microscopie de Super-résolution différentes modalités d’imagerie. Ce protocole, met l’accent sur l’imagerie de Super-résolution GSD. Images représentatives et des cartes de localisation sont indiquées dans la Figure 2 et Figure 3.
La figure 2 montre une cellule COS-7 transfectée avec le ER de protéines, mCherry-Sec61β et transformés à l’aide de la méthode décrite ci-dessus. Figure 2 a -2 b permettent la comparaison des images du re prise en utilisant un microscope de Super-résolution en mode FRBR (A) et mode d’acquisition de GSD (B). Les images montrent une amélioration dans la résolution axiale lors de l’acquisition en mode GSD. Ceci est encore démontré dans le profil de terrain qui l’accompagne, qui peut être généré à l’aide de ImageJ, qui montre la différence dans la distribution des courbes intensité normalisée dans les zones d’intérêt (ligne jaune). Ces courbes représentent le diamètre des tubules ER qui semblent être beaucoup plus étroite lorsque examinés en mode GSD. Microscopie GSD a une précision de localisation latérale d’environ 20 nm et donc représente une augmentation d’environ dix fois dans la résolution au-delà de la limite de diffraction. Cette amélioration de la résolution se traduit par une représentation plus précise de la structure des tubules ER.
L’amélioration de la résolution proposée par Super-résolution imagerie GSD est encore démontré dans la Figure 3, montrant un myocyte cardiaque étiquetée avec un anticorps anti-Cav1.2, traité de la manière décrite ci-dessus. L’image dans la Figure 3 a a été prise en utilisant un microscope de Super-résolution GSD dans cadre de la FRBR. Grappes de CaV1.2 canaux peut être vu à organiser le long du réseau de tubules t. Figure 3 b indique la même cellule, mais cette image a été acquise en utilisant le mode GSD. L’amélioration de la résolution axiale est plus importante dans les panneaux qui s’intéressent aux simples amas de chaînes (Figure 3 b), lorsqu’une comparaison est faite entre le ROI même photographié à l’aide de la FRBR et GSD, groupes séparés des canaux sont plus faciles à identifier comme le résultat de l’amélioration de la résolution proposée par imagerie de GSD. Ces panneaux également compare la différence de la détection du seuil défini comme le nombre de photons par pixel. Ce paramètre doit être choisi avec soin et adapté aux besoins de l’expérience. Panneau 3D montre les contours de cluster lorsque l’image GSD a été traitée à l’aide de logiciels ImageJ, d'où la zone du cluster pour chaque cluster individuel dans l’image peut être déterminée (voir la section « Discussion » pour des considérations importantes et note 13.1.8 ci-dessus Lorsque vous effectuez une telle quantification). Cette information peut alors servir pour générer l’histogramme des fréquences situé dans panneau 3C. Cette analyse permet d’analyser les changements dans la taille de cluster, ou le nombre de clusters entre les échantillons sous contrôle par rapport aux conditions de l’essai (p. ex., WT vs mutant canaux ou les cellules traitées drogue vs non traitée). En utilisant les approches décrites dans le présent protocole aux côtés des expériences complémentaires photoblanchiment par étapes, les enquêteurs ont déterminé que CaV1.2 programmes sont répartis en groupes, en moyenne, 8 canaux dans les myocytes cardiaques15 .
Figure 1 : représentation schématique de la chronologie des événements pour l’imagerie des protéines membranaires Super-résolution. Jour 0 désigne le premier jour de traitement pour l’étiquetage des anticorps. La section Protocole se réfère à la section du protocole où il se trouve des informations détaillées sur chaque étape. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : microscopie Super-résolution offre améliorée de signal-bruit et a augmenté la résolution spatiale. Gauche (A) COS-7 cellules exprimant mCherry-Sec61β, fixe et étiquetés comme décrit dans le protocole et photographié à l’aide de la microscopie conventionnelle de la FRBR. Panneau de droite, en haut : unique tubule ER. Panneau de droite, en bas : tracer le profil tiré sur toute la largeur du tubule ER (ligne jaune). (B), à la même cellule que (A) sauf la localisation carte a été générée à l’aide de Super-résolution GSD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie de Super-résolution des canauxv1.2 Ca dans les myocytes cardiaques. Empreinte FRBR (A) d’un myocyte cardiaque isolé, fixées et colorées avec anti-CaV1.2 anticorps (FP1). (B) gauche : empreinte de Super-résolution FRBR depuis le myocyte cardiaque même comme dans (A). À droite : agrandie de la carte de localisation des parties qui ont été soumis à des seuils de détection différentes. Notez que plus on augmente le seuil de détection, la taille apparente de CaV1.2 canal grappes diminuent. (C) histogramme de la fréquence des tailles de cluster obtenu à partir de la carte de localisation (b). Gauche (D) : contours de l’autorité de certificationV1.2 clusters de (B). A droite : élargie des parties de l’image ont été soumis à des seuils de détection différentes. Note, semblable à (B), que le seuil de détection augmente, la surface occupée par les baisses de grappes CaV1.2 canal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Fluorophore utilisé | Alexa-647 |
| Laser | 642 nm |
| Filtres d’émission | HP-T 623 |
| Objectif | 160 X 1,43 NA |
| Temps d’exposition | 10 ms |
| Seuil de détection | 65 |
| Angle d’incidence (profondeur de pénétration) | 65,04 ° (150 nm) |
| Gain de EM | 300 |
| #frames acquis | 30 000 à 60 000 |
| Intensité du laser pour le pompage | 100 % |
Tableau 1 : Liste des paramètres d’imagerie.
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Discussion
L’explosion récente des technologies qui permettent l’imagerie au-delà de la limite de diffraction ont offert de nouvelles fenêtres dans les complexités de la signalisation dans l’espace et le temps des cellules de mammifères. Ces technologies comprennent STORM, STED, PALM, GSD, SIM et leurs variantes (p. ex., dSTORM, FPALM). L’ingéniosité des scientifiques derrière ces techniques nous a permis de contourner les limitations imposées par les lois de la physique qui régissent la diffraction de la lumière. En dépit de cet énorme accomplissement, chacune de ces techniques fait une sorte de compromis pour atteindre Super-résolution et, comme tel, a ses limites. La situation idéale qui biophysiciens et biologistes cellulaires ambitionnez est une sensibilité optimale, haute résolution et l’acquisition rapide, avec aucune photoblanchiment. En outre, on devrait rester conscient qu’en enlevant les cellules des animaux, nous intrinsèquement changez-les puis à potentiellement modifier la dynamique moléculaire. Donc la quête pour développer une technologie de Super-résolution dynamique, permettant en direct cellulaire, imagerie de la molécule unique dans une vie, la respiration des animaux s’allume. Pour l’instant, nous avons des outils à notre disposition qui peut générer des images avec des améliorations 10 fois sur la résolution diffraction limitée. Dans cet article, nous discutons préparation des échantillons, acquisition d’images et analyse pour GSD qui permettent des résolutions jusqu'à 20 et 50 nm dans les dimensions latérales et axiales, respectivement.
Bien que l’objectif de ce protocole est sur Sec61β et CaV1,2 canaux de type L Ca2 + , le protocole décrit ci-dessus peut servir de modèle pour les chercheurs qui souhaitent des protéines différentes images dans leurs propres laboratoires sur un microscope GSD. Les attributs positifs de ce type de protocole sont qu’il est relativement simple, peut être modifié et appliqué à un certain nombre de différents types de cellules et peut être facilement adapté à l’imagerie multicolore. Les limites évidentes sont que Super-résolution systèmes, équipés d’un appareil EM-CCD sensible capable de détection de molécules simples, tendent toujours à être prohibitif pour de nombreux laboratoires.
Comme le nombre de laboratoires qui utilisent la microscopie Super-résolution que leur technique d’imagerie de choix se développer, plus uniforme et une entente est nécessaire sur l’interprétation, du traitement et acquisition d’images. Comment, par exemple, quantifie le niveau de la proximité de deux protéines qui apparaissent colocalized à un pixel de diffraction limitée mais transpirer pour réellement afficher peu de chevauchement du tout dans une super-resolution image/carte ? En effet, ce scénario est déjà apparue pour plusieurs auparavant assumé épididymaire protéines, telles que l’adhérence des protéines complexes paxillin et zyxin. Que la résolution que les microscopes atteignent invariablement des augmentations, peut-être protéines seront n’est plus signalées aux « sont colocalisées » mais plutôt pour avoir distribué non aléatoirement patterns of préféré-localisation autour de l’autre. Après tout, il est impossible pour deux protéines d’occuper physiquement exactement le même espace en 3 dimensions. Des solutions à cette énigme analyse commencent à émerger dans la littérature, y compris l’analyse de localisation relative basée sur la microscopie stochastique reconstruction optique (STORM-RLA), qui aurait été permet de quantifier la fréquence et le degré de chevauchement entre deux co étiqueté protéines et également fournir des mesures quantitatives de la distance entre les protéines de non-cumul13. Quand on compare un canal à l’autre de Super-résolution, c’est bien sûr essentiel pour vous assurer de qu'avoir un registre correcte entre les deux canaux. Ceci peut être évalué à l’aide de microsphères multicolore perles fluorescentes et imagerie dans chaque canal individuellement puis superposer les images. En outre, étant donné que le SR-DLG microscope 3D peut également fonctionner comme un microscope TIRF et générer la localisation de Super-résolution mappe dans FRBR, il est important de correspond à la profondeur de pénétration entre les chaînes de deux couleurs, comme FRBR angles changement selon la longueur d’onde de la lumière utilisée pour exciter l’échantillon.
En outre, comme illustré à la Figure 3 b et 3D de la Figure, une carte de localisation peut apparaître très différente selon le degré de « seuil ». Si le seuil de détection est réglé trop bas, structures semble être plus grande qu’ils sont vraiment comme la probabilité que l'on inclut non-spécifiques faux étiquetage de « bruit » augmente. À l’inverse, si le seuil de détection est réglé trop haut, structures peuvent apparaître plus petits qu’ils sont vraiment comme des événements « réels » sont exclus. Ainsi, seuillage doit être appliqué avec prudence et de raison. Alors, comment un seuil de détection raisonnable pour un échantillon donné peut être déterminé ? Les contrôles sont essentiels. Comme avec toute approche immuno-marquage, contrôles positifs et négatifs doivent être effectuées pour démontrer la spécificité des anticorps. Avec des contrôles appropriés, il est possible d’établir un seuil de détection au-dessus de laquelle seulement un étiquetage spécifique doit être observé. Des contrôles appropriés comprennent des échantillons dont l’incubation de l’anticorps primaire a été omise pour un échantillon exposé seulement à l’anticorps secondaire peut être observé. D’un tel contrôle, on peut discerner la liaison non spécifique d’un anticorps secondaire. Dans un échantillon bien préparé, il devrait en résulter en un plus petit nombre d’événements par image et un plus faible nombre moyen des photons par pixel par rapport à l’échantillon à incuber primaire et secondaire. Le seuil de détection de l’image puis est réglable afin que l’étiquetage non spécifique peut être éliminé. Le même seuil de détection puis doit être utilisé que lorsque l’échantillon primaire et secondaire à incuber à renforcer la confiance d’imagerie ce « bruit » est éliminé. Contrôles supplémentaires comprennent les tests de la spécificité de l’anticorps primaire. Dans les cellules transfectées, si la protéine marquée n’est pas nativement exprimée dans la lignée de cellules, puis un test simple de la spécificité de l’anticorps primaire est d’effectuer la procédure d’étiquetage sur les cellules celllulaire. Pour démontrer la spécificité de l’anticorps primaire dans les cellules primaires, un knock-out génétique de la protéine marquée est l’étalon-or. Les seuils de détection peuvent également être définies à l’aide de ces expériences de contrôle de l’anticorps primaire. En l’absence de l’antigène cible, toute émission de fluorescence est non spécifique. Comme avec les seuls contrôles secondaires, avec un bon anticorps primaire, moins épreuves par image doivent être observées et donc, sur le même nombre d’images, une plus faible nombre moyen de photons par pixel devrait être évident. Le seuil de détection est réglable donc à un niveau qui permettra d’éliminer non-spécifiques fond de coloration en raison de la liaison de l’anticorps primaire hors cible. Pour une transparence complète, il est suggéré que les auteurs devraient présenter des images avec leurs paramètres de seuillage clairement indiquées et peut-être avec un lien vers les données brutes en une version en lignedépositaire de e.
L’enquêteur doit aussi rester conscient que plusieurs Anticorps secondaires peuvent lier à un seul anticorps primaire donc un rapport 1:1 primaire : secondaire de liaison ne doit pas présumer. En outre, des anticorps secondaires commerciales sont souvent conjugués à plusieurs fluorophores, par exemple, les anticorps secondaires utilisés dans le présent protocole sont indiqués par le fabricant à être conjugués à 2-8 fluorophores. Comme un work-around pour cela, un fluorophore peut être directement conjugué à un anticorps primaire. Spectrophotométrie permet ensuite de déterminer le nombre moyen de fluorophores par l’anticorps primaire. Plusieurs kits disponibles dans le commerce sont disponibles pour réaliser ce processus de conjugaison. Toutefois, même si une stoechiométrie 1:1 est atteint, la molécule de fluorophore lui-même peut créer des problèmes encore surévalués en raison du clignotant et commutation réversible des fluorophores. En pratique, cela signifie qu’un fluorophore peut cycler plusieurs fois entre le sol et l’état excité émettant des grappes de photons comme il le fait. Ces photons peuvent être détectés chez plusieurs pixels voisins et conduisent à une surestimation de la taille de cluster. Autres chercheurs ont abordé cette question en choisissant d’allier fluorescentes émissions regroupées sur de courtes périodes de temps et l’espace de16,17. Il s’agit d’une approche un peu empirique qui toujours n’élimine pas la possibilité que le fluorophore même pourrait cycle retour à l’État foncé pour une longue période, puis retour à un état de cyclisme/émettant une fois de plus et être jugé comme une seconde molécule. Donc, le nombre de molécules dans un cluster ne peut pas être calculé uniquement sur la taille de cluster. Pour l’instant, il n’y a aucune solution parfaite pour ces questions et, par conséquent, l’utilisation de l’imagerie de Super-résolution en conjonction avec une autre technique comme le photoblanchiment par étapes peut donner une estimation approximative du nombre de molécules par grappe. Les contrôles pertinents pour accroître la confiance dans les mesures de surface cluster comprennent en comparant les tailles de cluster de protéines monomériques connues (par exemple, CD86) et protéine dimérique connue (par exemple, CTLA-4) à celles de la protéine d’intérêt, comme l’a suggéré Fricke et al. 18.
En résumé, dans le présent article, un protocole simple immunomarquage a la valeur énoncés décrivant la préparation d’échantillons fixes pour l’imagerie de Super-résolution. En outre, certains pièges communs en image acquisition et d’analyse sont discutés. Comme l’imagerie Super-résolution devient plus banal, il peut s’avérer nécessaire pour les revues d’énoncer un nouvel ensemble de lignes directrices afin d’éviter une manipulation inappropriée de ces cartes de localisation/images complexes. Microscopie de Super-résolution a ajouté un nouvel outil puissant pour la boîte à outils des biologistes cellulaires et des biophysiciens et a déjà eu un impact extraordinaire sur notre compréhension de l’architecture cellulaire et organisation moléculaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrentes de divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de l’AHA à R.E.D. (15SDG25560035). Auteurs tient à remercier Dr. Fernando Santana pour utilisation de son microscope 3D Leica SR GSD et Dr. Johannes Hell pour aimablement l’anticorps FP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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