Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for påvisning av én eller flere plasma og/eller intracellulær membran proteiner med bakken staten nedbryting (GSD) Super-oppløsning mikroskopi i pattedyrceller. Her diskuterer vi fordeler og betraktninger ved bruk av slike metoder for visualisering og kvantifisering av mobilnettet proteiner.
Abstract
Fremskritt innen fluorescerende mikroskopi og cellebiologi er nært korrelert, med forbedret evne til å visualisere mobilnettet hendelser ofte fører til dramatiske hopper i vår forståelse av hvordan celler funksjon. Utvikling og tilgjengeligheten av super-oppløsning mikroskopi har betydelig utvidet grensene for optisk oppløsning ~ 250-20 nm. Biologer er ikke lenger begrenset å beskrive molekylære interaksjoner i colocalization i et Diffraksjon begrenset område, snarere er det nå mulig å visualisere dynamisk samhandling molekyler. Her skissere vi en protokoll for visualisering og kvantifisering av mobilnettet proteiner av bakken statuser uttømming mikroskopi for fast celle bildebehandling. Vi gir eksempler fra to forskjellige membran proteiner, et element av endoplasmatiske retikulum translocon, sec61β og en plasma membran-lokalisert spenning-gated L-type Ca2 + kanal (CaV1.2). Diskutert er bestemt mikroskop parameterne, fiksering metoder, foto-svitsjing buffer formulering, og fallgruver og utfordringene i bildebehandling.
Introduction
Mobilnettet signalnettverk reaksjoner oversette endrer internt og eksternt for å starte en cellulær respons. De regulerer alle aspekter av menneskelige fysiologi, som stiftelsen for hormon og nevrotransmitter-løslate, hjerterytme, visjon, befruktning og kognitiv funksjon. Forstyrrelser i disse signalnettverk cascades kan ha alvorlige konsekvenser i form av patofysiologiske forhold, inkludert kreft, Parkinsons og Alzheimers sykdom. I flere tiår, har biologisk og medisinsk etterforskere brukt fluorescerende proteiner, prober og biosensors kombinert med fluorescens mikroskopi som Primærverktøyene for å forstå nøyaktig romlige og tidsmessige organiseringen av disse mobilnettet signaler.
Styrken i optisk teknikker som epifluorescence, AC confocal, eller total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi er deres følsomhet, hastighet og kompatibilitet med levende celle imaging, mens de større begrensningen er deres Diffraksjon-begrenset oppløsning, betyr strukturer eller protein komplekser mindre enn 200-250 nm kan ikke løses. Med teoretisk og praktisk utviklingen av deterministisk super-oppløsning (f.ekstilsvarende uttømming mikroskopi (STED1), strukturert belysning mikroskopi (SIM2) eller Stokastisk super-oppløsning (f.eks , photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM3) eller bakken tilstand nedbryting (GSD4,5)), laterale og aksial oppløsning i fluorescens mikroskopi er utvidet utover Diffraksjon barrieren, til rekkefølgen av titalls nanometer. Dermed har etterforskere nå den enestående evne til å visualisere og forstå hvordan protein dynamikk og organisasjon oversettes til funksjonen på nær molekylært nivå.
Bakken staten uttømming mikroskopi etterfulgt av personlige molekyl tilbake (GSDIM), eller bare GSD omgår som det kalles, Diffraksjon grensen ved å redusere antall samtidig emitting fluorophores4,5. Høy energi laserlys til å opphisse fluorophore-merkede utvalget, bombardere elektroner med fotoner og øke sannsynligheten for de vil gjennomgå en 'spin-flip"og angi trilling eller"dark-tilstand"fra opphisset tilstand4. Dette reduserer effektivt bakken staten, derav navnet "bakken staten uttømming'. Fluorophores avgir ikke fotoner trilling staten, og eksemplet vises dimmer. Men disse fluorophores stochastically til bakken tilstanden og kan gå gjennom flere Foton emitting glade-til-bakke staten overganger før retur til trilling staten. Med mindre fluorophores emitting til enhver tid, Foton støt ut fra individuelle fluorophores bli romlig og timelig forskjellig fra nærliggende fluorophores. Utbrudd av fotoner kan være passe med Gaussisk funksjon, den beregnede centroid som tilsvarer plasseringen av fluorophore med en lokalisering presisjon som er avhengig av numeriske blenderåpning (NA) av linsen, bølgelengden til lyset brukes for eksitasjon og avgjørende, antall fotoner slippes ut per fluorophore. En begrensning av GSD er at siden kun et delsett av fluorophores avgir aktivt når som helst, tusenvis av bilder må samles over flere minutter å bygge opp kart fullstendig lokalisering. Den lange anskaffet kombinert med høy laser makt kravet, betyr at GSD er bedre egnet til fast enn levende eksempler.
Denne artikkelen beskriver utarbeidelse av fast prøver for super-oppløsning mikroskopi avbilding av membran og endoplasmatiske retikulum (ER)-bosatt proteiner (for en liste over nødvendig forbruksvarer og reagenser se Tabellen for materiale). Eksempler på hvordan denne protokollen kan lett tilpasses kvantifisere størrelse og grad av klynger av L-type spenning-gated Ca2 + kanaler (Cav1.2) i sarcolemma av cardiac myocytter, eller brukes til å visualisere mobilnettet fordelingen av ER, er vist. Forstå distribusjon og organiseringen av disse cellulære komponenter er kritisk viktig forstå initiering, oversettelse, og til slutt funksjonen til mange Ca2 +-avhengige signalnettverk cascades. Eksempelvis er Cav1.2 kanaler fundamentalt viktig for eksitasjon-sammentrekning kopling, mens reseptor-mediert Ca2 + utgivelse fra ER er kanskje den mest utbredte signalnettverk gjennomgripende i pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vask Glass Coverslips
- dagen før prøve behandling, feilfri #1.5 glass coverslips av sonicating i en 1 M løsning av KOH 1t. Dette fjerner eventuelle fluorescerende forurensninger som kan finnes på coverslips.
- Rense KOH fra coverslips med de-ionisert vann.
- Når renset i KOH, lagre coverslips i 70% etanol helt klar til å bruke.
2. Belegg Glass Coverslips
Merk: trinnene i dette avsnittet skal utføres i celle kultur hette å hindre forurensning.
- Bruk tang til å fjerne en personlige dekkglassvæske fra 70% etanol løsning og flamme raskt for å fjerne overflødig. Plass coverslips i en 6-vel plate. Hvis flammende i kultur hette ikke er et alternativ, vurdere autoklavering i coverslips etter skylling med de-ionisert vann og/eller sterilisering under UV-lyset i kultur panseret for minst 30 min.
- For å hjelpe vedheft av celler, pels coverslips med sterilt 0,01% poly-L-lysine 1t ved romtemperatur.
- Sug opp poly-L-lysine og skyll coverslips med sterilt fosfat bufret saltvann (PBS). Lufttørke og Legg i kjøleskapet over natten.
- Neste morgen, fjerner coverslips fra kjøleskap og legger 300 µL av laminin, i en konsentrasjon av 50 µg/mL, i minst 30 min ved romtemperatur. Sikre at laminin er nøye plassert direkte på dekkglassvæske.
Merk: Dette laminin trinnet er ikke nødvendig for COS-7 celler eller HEK293 celler, men er nødvendig for isolert ventrikulær myocytter. Andre primære celler som vaskulær glatte muskelcellene eller neurons kan overholde bedre kollagen eller fibronectin belagt coverslips.
3. Utarbeidelse av celler
- kulturperler celler
- vokse COS-7 cellene (eller foretrukket celle linje) på en 10 cm kultur parabol i 10 mL Dulbecco ' s endret Eagles Medium (DMEM) kultur medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (PS) løsning. Vokse cellene i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO 2.
- Når cellene når 90% confluency, høste dem fra 10 cm rett ved aspirating DMEM media og legge 5 mL 0,05% trypsin-EGTA løsning. Når cellene begynner å runde opp og ta, umiddelbart nøytralisere Trypsin med supplert DMEM.
- Bruk en 5 mL serologisk pipette å fjerne celler fra parabolen. Pipetter mediet mot bunnen av parabolen flere ganger for å fjerne celler som forblir tilhenger og distribuere homogenously cellene gjennom kultur mediet.
- Plate celler på 35 mm kultur retter å oppnå 70% confluency for hva. Gjøre volumet av medium i parabolen opptil 2 mL med fersk DMEM/FBS/PS løsning.
- Transfect COS-7 celler med den ønskede plasmider DNA konstruksjoner (f.eks, sec61β-mCherry plasmider) bruker en passende transfection reagens og ifølge produsenten ' s instruksjoner.
Merk: Det kan ta 24-48 h for protein uttrykke, avhengig av plasmider og/eller hva reagensen brukes.
- Voksen mus ventrikulær myocytter
- isolere voksen mus ventrikulær myocytter bruker veletablerte Langendorff perfusjon metode 6. Nytt avbryte den resulterende pellet av myocytter Medium 199 (M199) supplert med 2,5% FBS og 1% PS.
4. Kontaktflate celler
- transfekterte COS-7 celler
- Sug opp 2 mL DMEM/FBS/PS løsning fra 35 mm rett og legge 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. Tilbake retten til inkubator for 2 min. høste celler fra retten av første aspirating Ca 2 +-gratis PBS og deretter legge til 1 mL av 0,05% trypsin-EGTA løsning.
- Når cellene begynner å runde opp og koble, umiddelbart nøytralisere Trypsin med 1 mL av supplert DMEM. Pipetter forsiktig opp og ned flere ganger for å sikre transfekterte cellene fordeles jevnt i 2 mL trypsin-EGTA-DMEM suspensjon.
- Plate transfekterte COS-7 celler på poly-L-lysine belagt coverslips på en riktig tettheten slik at enkeltceller kan visualiseres, og fylle fatet volumet opptil 2 mL med DMEM/FBS/PS (f.eks legge til 90 µL celle suspensjon av dekkglassvæske deretter legger 1,910 µL supplert DMEM, swirl parabolen å distribuere celler jevnt).
Merk: Cellene trenger ikke telles, men volumet av celler som skal legges til hver rett vil variere avhengig av confluency cellene. - Tilbake belagt cellene til cellen kultur inkubator over natten til at cellene å overholde og gjenopprette.
- Sug opp 2 mL DMEM/FBS/PS løsning fra 35 mm rett og legge 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. Tilbake retten til inkubator for 2 min. høste celler fra retten av første aspirating Ca 2 +-gratis PBS og deretter legge til 1 mL av 0,05% trypsin-EGTA løsning.
- Voksen mus ventrikulær myocytter
- Sug opp laminin og plate myocytter direkte på den belagt coverslips på en riktig tettheten slik at individuelle celler kan visualiseres. Dette avhenger av tettheten av levedyktige cellers fra isolasjon.
- Balanse celle suspensjon i en kuppel på dekkglassvæske og sted i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO 2 i ~ 45 min å tillate vedheft.
5. Fiksering av celler
- fjerne celler fra inkubator og nøye Sug opp mediet.
- Skyll tilhenger cellene gang med PBS.
- Fastsette celler med et bindemiddel optimalisert til individuelle program og antistoffer.
Merk: Et viktig kriterium å huske på når du velger et bindemiddel er bevaring av mobilnettet strukturen av prøven, samtidig sørge for at det er ingen conformational endring i antigen rundt. I forbindelse med denne protokollen fiksering med 3% paraformaldehyde/0.1% glutaraldehyde (PFA/GA) og fiksering med 100% metanol er diskutert.
- PFA/GA fiksering av transfekterte COS-7 celler uttrykke Sec61β-mCherry
- blande 1,9 mL 16% PFA og 20 µL 50% GA og legge PBS for å gjøre en siste volumet av 10 mL.
- Legge til 1 mL nylagde PFA/GA løsningen på hver rett av celler og fastsette for 10 min ved romtemperatur.
- Sug opp PFA/GA og skyll cellene 3 ganger med PBS.
- Vask adhered cellene med PBS, 5 ganger i 5 minutter hver. Utfører alle vask trinnene i et rotator satt til et moderat fart (f.eks 50 kretsløpene per minutt).
- Deretter redusere gratis aldehyd gruppene med 1 mL nylagde 0,1% masse/volum natrium borohydride i de-ionisert vann.
- Skyll celler dobbelt så vask 3 ganger i 5 min hver i PBS å fjerne alle spor av natrium borohydride og alkohol produserer når det reagerer med gratis aldehyder.
- Metanol fiksering av voksen mus ventrikulær myocytter
- nøye legge til 1 mL av iskalde 100% metanol til cellene. Tilt 6-vel platen og Pipetter metanol mot sideveggen og ikke direkte på dekkglassvæske. Deretter bøye 6-vel platen tilbake til vannrett slik at metanol jevnt vaske over cellene. Fastsette for 5 min på 20 ° C.
- Sug opp bindemiddel og skyll cellene 3 ganger med PBS.
- Vask adhered cellene med PBS, 5 ganger i 5 min hver på et rotator.
6. Blokkerer Non-spesifikke bindende
- blokk 1t ved romtemperatur i blokkering løsningen (se Tabell av materialer).
Merk: Ulike løsninger kan brukes til å blokkere ikke-spesifikke antistoffer binding 3% bovin serum albumin (BSA) eller ikke-immune serum fra samme art som det primære antistoffet.
7. Gjenkjenning
- primære antistoff inkubasjon
- leveringstanken blokkerer løsningen. Ikke vask eller skyll.
- Forberede primære antistoff løsningen som følger (se trinn 7.1.5): fortynne primære antistoffer mot en konsentrasjon av 10 µg/mL (eller ' s foreslo konsentrasjon) i antistoff inkubasjon løsningen (se tabell av materialet ). Balansere dette lite volum på dekkglassvæske og nøye sette en firkant av plast parafin film på toppen. Dette bidrar til å spre den lille mengden antistoff over dekkglassvæske og beskytter mot fordampning.
- Plasserer 6-vel platen i en fuktighet kammer og ruge over natten i kjøleskapet.
- i morgen, fjerne celler fra fuktighet kammer, nøye fjerne parafin filmen kvadrat fra overflaten av dekkglassvæske og Sug opp den primære antistoff løsningen.
- Skyll 3 ganger med PBS, deretter Vask 5 ganger i 5 min med vask blokk løsning (se Tabell for materiale) på omdreiende.
Merk: Denne protokollen bruker følgende antistoffer, anti-RFP musen monoklonalt antistoff for bilder som vises i figur 2 og kanin polyklonale FP1 7 anti-Ca V 1.2 antistoff (en gave fra Prof. Johannes helvete, UC Davis) for bilder som vises i Figur 3. Med hensyn til fuktighet kammeret foret en plast matboks med et tettsittende lokk, med vått papir håndkle works. PBS kan brukes for vask trinn, men denne protokollen forbedrer merking spesifisitet og reduserer bakgrunnen ved hjelp av en utvannet blokkerer løsning for vask trinnene.
- Sekundære antistoff inkubasjon
- Sug opp vask løsningen og legge 200 µL konjugert sekundære antistoff løsning fortynnet 1:1,000 i antistoff inkubasjon løsning. Sted et kvadrat av parafin film på dekkglassvæske (se trinn 7.1.2).
- Incubate 1t ved romtemperatur i mørket.
- Leveringstanken sekundære antistoff og skyll 3 ganger med PBS.
- Vask celler med fortynnet blokkerer løsning 5 ganger for 5 min til rocker.
- Vask 3 ganger i 5 min med PBS.
Merk: Denne protokollen beskriver bruk av anti-musen Alexa 647 konjugert sekundære antistoff og anti-kanin Alexa 647 konjugert sekundære antistoff for figur 2 og Figur 3, henholdsvis. Enkelt protein merking, Alexa 647 er den foretrukne fluorophore på grunn av sin høye Foton teller (forbedrer lokalisering presisjon) og lav driftssyklus (forbedrer midlertidig løsning) 8. Mange andre fluorophore-konjugerte sekundære antistoff alternativer, for eksempel Atto eller Cy-fargestoffer, er tilgjengelige. Se Dempsey et al. 8 og Chozinski et al. 9 for omfattende evalueringer av hensiktsmessigheten av flere fluorophores/fargestoffer for super-oppløsning bildebehandling.
8. Etter fiksering (valgfritt trinn)
- fortynne 50 µL 50% GA i 10 mL PBS å få en 0.25% GA løsning. Etter fikse celler for 10 min i denne løsningen ved romtemperatur.
- Vask med PBS 3 ganger i 5 min på et rotator.
9. Lagring av prøver
- Lagre prøver i kjøleskapet (4 ° C) i en aluminiumsfolie foret beholder å beskytte fra lys til bildebehandling.
- For langsiktig lagring av prøver (opptil flere måneder), lagre i PBS med 3 mM Natriumazid å unngå bakterievekst.
10. GSD super-oppløsning Imaging Photoswitching Buffer forberedelse
- forberede oksygen-scavenging ' GLOX ' løsning som følger:
- i en 1,5 mL microcentrifuge tube, legge 12.5 µL catalase (lager 34 mg/mL), 3,5 mg gluko og 0,5 µl 1 M Tris (pH = 8) i 49,5 µL PBS.
- Vortex kort å oppløse komponenter i løsningen og deretter virvel 20,800 x g i 3 minutter på 4 ° C.
Merk: oksygen-scavenging løsninger som GLOX, har blitt funnet å motsette seg photobleaching. GLOX bør oppbevares i kjøleskap for opptil en uke. Gjenta sentrifuge trinn hver gang den brukes.
- Forberede photoswitching-inducing thiol løsning som følger:
- forberede 100 mM β-mercaptoethylamine (MEA) løsning i PBS og endre pH pH 8 eller alternativt bruke β-mercaptoethanol (βME). Lagre aliquoted MEA løsning i fryseren (20 ° C) for opp til 1 uke.
- Umiddelbart før bildebehandling, forberede siste bytte bufferen på isen ved å legge til thiol og oksygen-scavenging komponenter sammen. For 500 µL GLOX-MEA, legge til 5 µL GLOX 50 µL MEA (pH = 8) og 445 µL saltvann buffer (2.5 mL 1 M Tris pH = 8, 29.22 mg NaCl (10 mM endelige konsentrasjon), 5 g glukose og 47,5 mL vann). Alternativt GLOX-βME løsning legge 5 µL GLOX til 5 µL βME og 490 µL saltvann buffer.
- Holde løsningene på isen og bruker nødvendig for å montere eksempler på glass depresjon lysbilder.
Merk: Thiol som inneholder løsninger som βME eller MEA indusere photoswitching cyanine-baserte fargestoffer som Alexa 647 10 eller xanthene-baserte fargestoffer som Alexa 568. ΒME gir bedre resultater med Alexa 647 mens MEA foretrekkes for Alexa 568 eller når 2 proteiner er til å bli avbildet med en dobbel etikettmetoden både Alexa 568 og 647. Bufferen vil svekkes over en periode på timer på grunn av forsuring. Dette vil føre til en reduksjon i gjennomsnittlig Foton greven av prøven. For å forhindre dette, anbefales det å gjøre fersk photoswitching buffer etter 2-3 h eller hvis enten en nedgang i den gjennomsnittlige Foto tellingen eller en bemerkelsesverdig forlengelse av tiden det tar å indusert photoswitching er observert. En fersk artikkel beskrevet en ny tenkelig buffer okse-EA som vi har ennå ikke testet, men angivelig utstillinger stabil pH nivåer i flere dager og utfører bedre enn GLOX for multi-farge bildebehandling programmer 11.
- Holde løsningene på isen og bruker nødvendig for å montere eksempler på glass depresjon lysbilder.
11. Montering prøver
- Mount coverslips med merkede celler (se avsnittene 1-9) mot depresjon lysbilder, bruker 100 µL tenkelig buffer.
- Forsegle kantene på dekkglassvæske med en silikon lim å hindre rask oksidering av tenkelig bufferen. Vent flere minutter før silikon limet har fullstendig kurert ellers dekkglassvæske vil drive når imaging.
Merk: Silikon lim ikke forherder hvis det kommer i kontakt med βME. Husk å tørke kantene på dekkglassvæske å hindre at silikon limet å kontakte tenkelig bufferen.
12. Image vinningen
- se tabell 1 for en liste over parametere som brukes i figur 2 og Figur 3.
- Skal starte, velge riktig laser å belyse prøven avhengig av fluorophore som er valgt. SR-GSD systemet brukes i denne protokollen er utstyrt med kraftige lasere (488 nm, 1,4 KW/cm 2; 532 nm, 2.1 KW/cm 2; 561 nm, 2.1 KW/cm 2 642 nm, 2.1 KW/cm 2). figur 2 brukes 642 nm laser.
- Bruker en oljeneddyp linsen med en høy NA. SR-GSD systemet brukes her er utstyrt med en HC PL APO 160 X / 1.43 NA målet.
- Valgte riktig dichroic tenkelig kuben. SR-GSD systemet i denne protokollen er utstyrt med 488 HP-T, 532 HP-T, 568 HP-T, 642 HP-T med utslipp båndpass filtre 505-605 nm, 550-650 nm og 660-760 nm.
- Velg 2D kjøp. Stille inn kameraet til ramme-overføring modus og eksponering tid å 10 ms (100 Hz). Angi EM forsterkningen til 300. Velg oppdagelsen terskelen.
Merk: Lave terskler produserer bilder med høye. Høy grensene kan filtrere ut relevante signaler. Bestemme terskelen basert på negative kontroller som imaging coverslips av ikke-transfekterte celler eller celler inkubert med sekundær antistoff bare. - Slå på automatisk hendelsen kontroll og angi hendelser per bilder til 8.
- Angir pikselstørrelsen i kategorien GSD kjøp (start med 10 nm eller 20 nm pikselstørrelsen). Sikre at " histogrammet modus " er valgt i kategorien GSD verktøy under Høyoppløselig bilde Beregningsalternativer før bildeopptak.
- Bilde proteiner i plasma membranen, TIRF modus og endre forekomsten vinkelen for å fastsette gjennomtrenging.
- å sende elektroner til mørk staten (kalt pumpe), angi laser intensitet til 100%.
- Velge ett molekyl oppdaget mens pumping og sette for å erverve automatisk når rammen korrelasjonen er 0,20.
- Til oppkjøp, angi laser intensitet til 50%.
- Angir antall oppkjøpet rammer til 60.000.
Merk: Etterforskeren finner at en prøve krever mer eller mindre bilder enn dette. Endre ramme greven basert på observasjoner av fluorophore photobleaching og stoppe oppkjøpet når ingen ytterligere hendelser er detectable. - Start oppkjøpet.
Merk: I begynnelsen av oppkjøpet, alle fargestoff molekyler er tilstanden fluorescerende og deretter bytte til mørk staten. Når rammen korrelasjonen når 0,20, starter bilder anskaffes. Når mindre enn 8 hendelser oppdages hver ramme, slås 405 laser, oppmuntre fluorophores overgang fra mørk staten til bakken staten. Da anskaffe bilder for dataset n = x celler fra n = y dyr, parametere som TIRF gjennomtrenging dyp oppdagelsen terskelen og antall rammer ervervet bør holdes konstant.
13. Bildeanalyse
- for å kvantifisere protein klyngestørrelse, bruker den ' analysere partikler ' funksjon i ImageJ.
Merk: Videre analyse kan utføres med Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi-baserte relative lokalisering analyse (STORM-RLA) eller lignende 13.- Utføre klynge analyse ( Figur 3) bruke ImageJ som følger:
- åpne bildefilen som skal analyseres. Dette bør være en 10 nm histogrammet ett molekyl lokalisering kart som genereres i bildebehandlingsprogramvare beskrevet ovenfor (12).
- Justere lysstyrken og kontrasten å visualisere bildet: Klikk på bildemenyen, Velg Juster, deretter lysstyrke og kontrast. Klikk alternativet for automatisk.
- Endre bildetypen til 8-biters: Velg bildet, deretter Velg, og velg 8-biters.
- Angi skalaen for bildet: åpne analyser-menyen og klikker angi skalaen angir du følgende parametere: avstand = 1, kjent avstand = 10, 1 bildepunkt = 10 nm.
- For å velge målene innhentes, åpne analyser-menyen, velg Angi målinger og Merk av i boksen ved siden av alternativet området.
- Juster terskelen til bildet. Åpne bilde-menyen, Velg Juster, og velg deretter terskel, Velg over/under. Flytte den maksimale verdien 255, og flytte minimumsverdien 1 og klikk Bruk.
- å analysere partikler, åpne analyser-menyen, Velg analyser partikler. Sett en hake for å velge pikselenheter, vise resultater og oppsummere. Angi størrelsen til 4-uendelig (siden oppløsning er ~ 20 nm), velger du bare disposisjoner og klikk ok. En Sammendrag-fil opprettes som vil inneholde analyse detaljer som gjennomsnittlig klyngestørrelse og antallet klynger i bildet.
Merk: Forsiktighet bør utvises ved å gjøre konklusjoner om antall proteiner i en bestemt klynge, som antall lokaliserte poeng ikke er lineært korrelert med hvor mange proteiner. GSD regionaliserer fargestoffer som er konjugert til antistoffer, noe som resulterer i et koblingen-feil som fortrenger fluorescerende etiketten fra epitope av > 10 nm i alle retninger. I tillegg hvis polyklonale antistoffer, flere antistoff kan binde til en enkelt antigen og for å forvirre den sak ytterligere, kommersielle sekundære antistoffer er konjugert til, i gjennomsnitt 3-6 molekyler fargestoff slik at en fluorophore ikke er alltid lik Vigelandsparken. Sammenhengen-feil kan reduseres ved å bøye et fargestoff direkte til det primære antistoffet (eliminere sekundære) eller en nanobody-baserte merking ordningen 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som dokumentert i innledningen, er det mange forskjellige super-oppløsning mikroskopi imaging modaliteter. Denne protokollen, fokuserer på GSD super-oppløsning bildebehandling. Representant bilder og lokalisering kart er vist i figur 2 og Figur 3.
Figur 2 viser en COS-7 celle transfekterte ER protein, mCherry-Sec61β og behandles ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor. Figur 2A -2B tillate sammenligning av bildene er tatt med super-oppløsning mikroskop i TIRF modus (A) og bruker GSD vinningen måte (B). Bildene viser en forbedring i aksial oppløsning når ervervet i GSD modus. Dette er ytterligere demonstrert i tilhørende tomten profilen, som kan genereres ved hjelp av ImageJ, som viser forskjellen i distribusjon av normalisert intensitet kurvene på områder av interesse (gul linje). Disse kurvene representerer diameter på ER tubuli som synes å være mye smalere når undersøkt inne GSD måte. GSD mikroskopi har en lateral lokalisering presisjon ca 20 nm og dermed representerer omtrent en ti-fold økning i oppløsning Diffraksjon grensen. Denne forbedringen i oppløsning gir en mer nøyaktig representasjon av strukturen i ER tubuli.
Forbedring i oppløsning som Super-oppløsning GSD imaging er ytterligere demonstrert i Figur 3viser en merket cardiac myocyte med et anti-Cav1.2 antistoff, behandlet som beskrevet ovenfor. Bildet i figur 3A ble tatt ved hjelp av en GSD super-oppløsning mikroskop i TIRF omgivelser. Klynger av CaV1.2 kanaler kan sees å organisere langs t-tubule nettverket. Figur 3B viser samme celle, men dette bildet ble kjøpt med GSD modus. Forbedringen i aksial oppløsningen er mer fremtredende i panelene som fokuserer på enkelt klynger av kanaler (figur 3B), når en sammenligning mellom samme Avkastningen avbildet med TIRF og GSD, egne klynger av kanaler er lettere å identifisere som et resultat av forbedringen i oppløsning som GSD bildebehandling. Disse panelene også sammenligne forskjellen i gjenkjenning terskelverdien definert som antall fotoner per piksel. Denne parameteren må være valgt forsiktig og tilpasset kravene i eksperimentet. Panelet 3D viser klyngen skisserer når GSD bildet ble behandlet med ImageJ programvare, fra denne klyngen området for hver enkelt klynge i bildet kan bestemmes (se note 13.1.8 over og under diskusjon for viktig informasjon Når du utfører slike kvantifisering). Denne informasjonen kan deretter brukes til å generere frekvens histogrammet i 3 C-panelet. Denne analysen kan brukes til å undersøke endringer i klyngestørrelse, eller antallet klynger mellom prøvene under kontroll versus testforhold (f.eks, WT vs mutant kanaler eller ubehandlet vs narkotika-behandlet celler). Bruke metodene som er beskrevet i denne protokollen sammen med komplementære step-wise photobleaching eksperimenter, etterforskere har fastslått at CaV1.2 kanaler er distribuert i klynger, i gjennomsnitt, 8 kanaler i cardiac myocytter15 .
Figur 1: skjematisk fremstilling av tidslinjen i hendelser for super-oppløsning avbilding av membran proteiner. Dag 0 refererer til den første dagen av behandling for antistoff merking. Delen protokollen refererer til delen i protokollen hvor detaljert informasjon finnes på hvert trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Super-oppløsning mikroskopi tilbyr forbedret signal til støy og økt romlig oppløsning. (A) venstre COS-7 celler uttrykke mCherry-Sec61β, fast og merket som beskrevet i protokollen og fotografert med konvensjonelle TIRF mikroskopi. Høyre, øvre panel: enkelt ER tubule. Høyre nedre panelet: tomt profil tas over bredden på ER tubule (gul linje). (B) samme celle som (A) unntatt lokaliseringen kart ble generert ved hjelp GSD super-oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Super-oppløsning avbilding av Cav1.2 kanaler i cardiac myocytter. (A) TIRF footprint fra en isolert cardiac myocyte, fast og farget med anti-CaV1,2 antistoff (FP1). (B) venstre: Super-oppløsning TIRF footprint fra den samme hjerte myocyte som (A). Høyre: utvidet deler av lokalisering kartet som har vært utsatt for annerledes oppdagelsen terskler. Vær oppmerksom på at som en øker oppdagelsen terskelen, den synlige størrelsen på CaV1,2 kanal klynger redusere. (C) frekvensen histogram av klyngestørrelser innhentet fra lokalisering kartet i (B). (D) venstre: konturene av CaV1.2 klynger fra (B). Høyre: forstørret deler av bildet er blitt utsatt for annerledes oppdagelsen terskler. Note, lik (B) som gjenkjenning terskelen området okkupert av CaV1,2 kanal klynger fellingene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Fluorophore brukes | Alexa-647 |
| Laser | 642 nm |
| Utslipp filtre | 623 HP-T |
| Linsen | 160 X 1,43 NA |
| Eksponeringstid | 10 ms |
| Gjenkjenning terskel | 65 |
| Forekomsten vinkel (penetrasjon dybde) | 65.04° (150 nm) |
| EM gevinst | 300 |
| #frames kjøpt | 30 000 – 60 000 |
| Laser intensitet for pumping | 100% |
Tabell 1: Liste over parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Av nylige eksplosjonen av teknologi som tillater imaging Diffraksjon grensen har tilbudt ny Vinduer i kompleksiteten i pattedyr celle signalisering i rom og tid. Disse teknologiene inkludere STORM, STED, PALM, GSD, SIM og deres varianter (f.eks, dSTORM, FPALM). Oppfinnsomhet av forskerne bak disse teknikkene har tillatt oss å omgå begrensningene av lovene i fysikk styrer Diffraksjon lys. Til tross for denne store prestasjon, hver av disse teknikkene gjør en slags kompromiss å oppnå super-oppløsning og, som sådan, har sine begrensninger. Den ideelle situasjonen som celle biologer og biophysicists tilstrebe er optimal følsomhet, høy oppløsning og rask erverv, med ingen photobleaching. I tillegg bør man bli bevisste som fjerner celler fra dyr, vi iboende endre dem og potensielt endre molekylære dynamikk. Derfor forsøk på å utvikle en super-oppløsning teknologi som tillater dynamisk, live celle, ett molekyl imaging i en levende dyr går på. For nå har vi verktøy til rådighet som kan generere bilder med 10 ganger forbedringer på Diffraksjon begrenset oppløsning. I denne artikkelen diskutere vi prøve forberedelse, bildeopptak og analyse for GSD som gjør løsninger til 20 og 50 nm i laterale og aksial dimensjoner, henholdsvis.
Selv om fokus for denne protokollen er Sec61β og CaV1,2 L-type Ca2 + kanaler, kan protokollen beskrevet ovenfor tjene som en mal for forskere som ønsker å bilde ulike proteiner i egne labs på GSD mikroskop. Positiv attributtene til denne typen protokollen er at det er relativt enkelt, kan endres og brukes på en rekke forskjellige celletyper, og kan lett tilpasses multi-farge bildebehandling. De åpenbare begrensningene er at super-oppløsning systemer, utstyrt med et sensitivt EM-CCD kamera som enkelt-molekylet oppdagelsen, fremdeles en tendens til å være uoverkommelig dyrt for mange laboratorier.
Som antallet laboratorier som bruker super-oppløsning mikroskopi som deres foretrukne tenkelig teknikk vokser, kreves mer ensartet forståelse og avtale om bildeopptak, behandling og tolkning. Hvordan, for eksempel en kvantifisere nivået av nærhet av to proteiner som vises colocalized i en Diffraksjon-begrenset piksel men svette å faktisk vise lite overlapp hele i et super-oppløsning bilde/kart? Denne situasjonen har faktisk allerede oppstått i flere tidligere antatt colocalized proteiner, som vedheft komplekse proteiner paxillin og zyxin. Som oppløsning at mikroskop oppnå alltid øker, skal kanskje proteiner ikke lenger rapporteres til "colocalize" men du har ikke-tilfeldig fordelt mønstre av foretrukket-lokalisering rundt hverandre. Tross alt, er det umulig for to proteiner til fysisk oppta nøyaktig samme 3-dimensjonale plass. Noen løsninger på dette analysen problemet begynner å dukke opp i litteraturen, inkludert Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi-baserte relative lokalisering analyse (STORM-RLA), som kan angivelig kvantifisere hyppighet og grad av overlapping mellom to co merket proteiner og også gi kvantitativ måling av avstanden mellom ikke-overlappende proteiner13. Når sammenligne en kanal til en annen i super-oppløsning, er det selvfølgelig viktig å sikre du har korrekt register mellom de to kanalene. Dette kan evalueres ved hjelp av multi-farge microsphere fluorescerende perler bildebehandling i hver enkelt kanal og overliggende bilder. I tillegg siden SR-GSD 3D mikroskop kan også fungere som et TIRF mikroskop og generere super-oppløsning lokalisering kart i TIRF, er det viktig å matche gjennomtrenging dyp mellom to farger kanaler, som TIRF vinkler endring avhengig av Bølgelengden til lyset brukes å opphisse prøven.
Videre, som vist i figur 3B og figur 3D, kart lokalisering kan vises svært forskjellige avhengig av 'terskelverdi'. Hvis oppdagelsen terskelen er satt for lavt, vises strukturene er større enn de virkelig er sannsynligheten for at en inneholder falske uspesifisert merking av "støy" øker. Omvendt, hvis oppdagelsen terskelen er satt for høyt, deretter strukturer kan vises mindre enn de virkelig er som "ekte" hendelser er utelukket. Dermed bør terskelverdi brukes med fornuft og forsiktig. Så hvordan kan en rimelig oppdagelsen terskel for et gitt utvalg bestemmes? Kontrollene er nøkkelen. Som med alle immuno-merking tilnærming, skal positive og negative kontroller utføres for å demonstrere spesifisitet av antistoffer. Med egnede kontroller er det mulig å utlede en gjenkjenning terskel som bare bestemte merking observeres. Egnede kontroller inkluderer eksempler der er den primære antistoff inkubering utelatt så et eksempel utsettes bare for sekundær antistoff kan observeres. Uspesifisert binding av en sekundær antistoff kan skjelnes fra slik kontroll. I en godt forberedt prøve, bør dette resultere i en mye mindre hendelsesantallet per bilde og en lavere gjennomsnittlig antall fotoner per piksel sammenlignet med primære og sekundære inkubert prøven. Gjenkjenning terskelen bildet kan deretter settes slik at ikke-spesifikk merking kan elimineres. Samme oppdagelsen terskelen bør deretter brukes når imaging primære og sekundære inkubert prøve å forbedre tillit at "støy" elimineres. Kontroll omfatter de testing spesifisiteten av primære antistoffer. I transfekterte celler, hvis merket protein ikke er innfødt uttrykt i celle-linjen er en enkel test av primære antistoff spesifisitet å utføre merking prosedyren på untransfected celler. For å demonstrere primære antistoff spesifisitet i primære celler, er en genetisk knockout av merket protein gull standard. Gjenkjenning terskler kan også angis ved hjelp av disse primær antistoff kontroll eksperimenter. I fravær av målet antigen er noen fluorescens utslipp uspesifikke. Som med sekundær eneste kontrollene, med en god primære antistoff, mindre hendelser per bilde bør være observert og derfor over samme antall rammer, en lavere mener antall fotoner per piksel bør være tydelig. Gjenkjenning terskelen kan dermed settes til et nivå som vil eliminere ikke-spesifikke bakgrunnen flekker på grunn av off-målet primære antistoff bindende. For fullstendig åpenhet, er det foreslått at forfattere skal presentere bilder med deres terskelverdi parametere klart og kanskje en kobling til rådata i en online Depot.
Etterforskeren må også forbli bevisste at flere sekundære antistoffer kan binde til et enkelt primære antistoff så 1:1 primær: sekundær binding forholdet ikke bør antas. Videre kommersiell sekundære antistoffer er vanligvis konjugert til flere fluorophores, for eksempel er sekundær antistoffer ansatt i denne protokollen registrert av produsenten å bli bøyd til 2-8 fluorophores. Som omgår dette, kan en fluorophore være direkte konjugert til en primær antistoff. Spectrophotometry kan deretter brukes til å bestemme gjennomsnittlig antall fluorophores per primære antistoff. Flere kommersielt tilgjengelig kits er utføre Bøyning prosessen. Selv om en 1:1 støkiometri er oppnådd, kan imidlertid fluorophore molekylet selv opprette ytterligere overcounting problemer blinker og reversibel bytte av fluorophores. I praksis betyr dette at en fluorophore kan sykle flere ganger mellom bakken og opphisset tilstand emitting klynger av fotoner som det gjør så. Disse fotoner kan oppdages i flere nærliggende piksler og føre til overvurdering av klyngestørrelsen. Andre etterforskere har adressert dette problemet ved å velge å kombinere fluorescerende utslipp gruppert i korte tidsperioder tid og rom16,17. Dette er en noe empirisk tilnærming som fortsatt ikke vil eliminere muligheten for at den samme fluorophore kan sykle den mørke tilstand for en lengre periode, og omvendt å en sykling/emitting tilstand igjen og bli dømt som et andre molekyl. Derfor antallet molekyler i en klynge kan ikke beregnes basert utelukkende på klyngestørrelsen. For øyeblikket er det ingen perfekt løsning på disse problemene, og derfor bruk av super-oppløsning imaging sammen med en annen teknikk som step-wise photobleaching kan gi et omtrentlig anslag over antallet molekyler per sektorgruppe. Relevant omfatter å øke tilliten i klyngen området målinger sammenligne klyngestørrelser kjent monomerisk proteiner (f.eksCD86) og kjente dimeric proteiner (f.eksCTLA-4) til de av protein av interesse som foreslått av Fricke et al. 18.
I sammendraget, i denne artikkel, er en enkel immunolabeling protokollen satt frem beskriver utarbeidelse av fast prøver for super-oppløsning bildebehandling. I tillegg drøftes noen felles fallgruver i bildeopptak og analyse. Som Super-oppløsning imaging blir mer vanlig, kan det bli nødvendig for journaler til fremsatt et nytt sett med retningslinjer for å avverge upassende manipulering av disse komplekse bilder/lokalisering kartene. Super-oppløsning mikroskopi har lagt et kraftig nytt verktøy til verktøykassen celle biologer og biophysicists og har allerede gjort en ekstraordinær innvirkning på vår forståelse av mobilnettet arkitektur og molekylære organisasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra AHA til R.E.D. (15SDG25560035). Forfattere ønsker å erkjenne Dr. Fernando Santana for bruk av hans Leica SR GSD 3D mikroskop, og Dr. Johannes Hell for vennlig å gi FP1 antistoffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
