Summary
Este artículo describe un protocolo para la detección de uno o más de plasma y proteínas de la membrana intracelular mediante microscopía de superresolución estado agotamiento (GSD) en células de mamíferos. Aquí, discutimos las ventajas y consideraciones del uso de estos enfoques para la visualización y cuantificación de proteínas celulares.
Abstract
Avances en biología celular y microscopía fluorescente se correlacionan íntimamente con la mayor habilidad de visualizar eventos celulares conduce a menudo a dramáticos saltos en nuestra comprensión de cómo las células de función. El desarrollo y la disponibilidad de la microscopía de superresolución ha ampliado considerablemente los límites de la resolución óptica de ~ 250-20 nm. Biólogos no se limitan a describir las interacciones moleculares en términos de colocalización dentro de un área de difracción limitada, más bien ahora es posible visualizar las interacciones dinámicas de las moléculas individuales. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de proteínas celulares por microscopia de agotamiento de la tierra-estado para la proyección de imagen fija de la célula. Proporcionamos ejemplos de dos proteínas de membrana diferentes, un elemento de la translocon del retículo endoplásmico, sec61β y un localizado en membrana del plasma voltaje tipo L de Ca2 + canal (CaV1.2). Discutidos son el microscopio específicos parámetros, métodos de fijación, cambio de foto formulación del buffer y trampas y desafíos de procesamiento de imágenes.
Introduction
Reacciones de señalización celulares traducen cambiando los entornos internos y externos para iniciar una respuesta celular. Regulan todos los aspectos de la fisiología humana, sirviendo como la Fundación de hormonas y liberación de neurotransmisor, del latido del corazón, visión, fertilización y función cognitiva. La interrupción de estas cascadas de señales puede tener consecuencias graves en forma de condiciones fisiopatológicas, incluyendo cáncer, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Durante décadas, los investigadores biológicos y médicos han utilizado con éxito proteínas fluorescentes, sondas y biosensores juntados con microscopía de fluorescencia como las herramientas principales para comprender la organización espacial y temporal precisa de estos celulares señales.
Las fuerzas de técnicas ópticas como epifluorescencia, confocal, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total son su sensibilidad, velocidad y compatibilidad con imágenes de células vivas, mientras que la mayor limitación es su difracción limitada resolución y las estructuras de significado o complejos de la proteína menores de 200-250 nm no se puede resolver. Con el desarrollo teórico y práctico de super-resolución determinista (estructurap. ej., microscopia de agotamiento estimulante de la emisión (STED1), microscopía de iluminación (SIM2) o estocástico super-resolución (p. ej. , fotoactiva localización microscopia (3de la palma), o estado el agotamiento (GSD4,5)), resolución lateral y axial en microscopía de fluorescencia se ha extendido más allá de la barrera de la difracción, a la orden de decenas de nanómetros. Así, los investigadores tienen ahora la capacidad sin precedentes para visualizar y entender cómo organización y dinámica de proteínas se traduce en función a nivel molecular cerca.
Microscopia de agotamiento de estado seguido por cada molécula de retorno (GSDIM), o simplemente GSD como se le conoce, evita el límite de difracción reduciendo el número de fluoróforos4,5al mismo tiempo que emite. Luz laser de la alta energía se utiliza para excitar la muestra marcada con el fluoróforo, bombardeo de electrones con fotones y aumentando la probabilidad de que se someten a un 'spin-flip' y entrar en el trío o 'estado de oscuro' desde el estado excitado4. Esto efectivamente reduce el estado, por lo tanto el nombre de 'tierra de agotamiento del estado'. En el estado de triplete, fluoróforos no emiten fotones y la muestra aparece más dévil. Sin embargo, estos fluoróforos estocástico regreso al estado base y se pueden pasar por varios fotones emitiendo las transiciones de estado excitado a tierra antes de regresar al estado de triplete. Con menos fluoróforos que emiten en un momento dado, ráfagas del fotón emitieron por fluoróforos individuales se convierten en espacial y temporal distinto de los vecinos de fluoróforos. La ráfaga de fotones se puede caber con una función Gaussiana, el centroide calculado que corresponde a la posición del fluoróforo con una precisión de localización que depende de la apertura numérica (NA) de la lente, la longitud de onda de la luz utilizada para excitación y crucial, el número de fotones emitidos por el fluoróforo. Una limitación de GSD es que, puesto que sólo un subconjunto de fluoróforos emite activamente en cualquier momento, miles de imágenes deben recogerse durante varios minutos para construir un mapa de localización completa. El tiempo de adquisición largo combinado con el requisito de energía láser de alta, significa que GSD mejor se adapta a fijo en lugar de muestras vivas.
Este artículo describe la preparación de muestras fijadas para obtener imágenes de microscopía de superresolución de membrana y el retículo endoplásmico (ER)-proteínas residentes (para una lista de reactivos véase Tabla de materialesy consumibles necesarios). Ejemplos de cómo este protocolo puede ser fácilmente adaptado para cuantificar el tamaño y el grado de agrupamiento de tipo L canales voltaje-bloqueados Ca2 + (Cav1.2) en el sarcolema de los miocitos cardiacos, o utilizado para visualizar la distribución celular de la ER, se han demostrado. Comprensión de la distribución y organización de estos componentes celulares es de vital importancia en la comprensión de la iniciación, traducción y en última instancia la función de muchas Ca2 +-cascadas de señales dependientes. Por ejemplo, canales de Cav1.2 son fundamentalmente importantes para la excitación-contracción de acoplamiento, mientras que la mediada por receptor Ca2 + lanzamiento de ER es quizá el más ubicua cascada de señalización en células de mamíferos.
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Protocol
1. cubreobjetos de vidrio lavado
- el día antes de procesamiento de las muestras, limpiar #1.5 vidrio cubreobjetos por sonicando en una solución de 1 M de KOH para 1 h. Esto elimina cualquier contaminante fluorescente que puede estar presente en el cubre-objetos.
- El KOH del cubreobjetos con agua desionizada enjuague a fondo.
- Una vez limpiado en KOH, almacenar el cubreobjetos en etanol al 70% hasta que esté listo para uso.
2. Cubreobjetos de vidrio de capa
Nota: los pasos de esta sección deben realizarse en una campana de cultivo celular para prevenir la contaminación.
- Utilizar pinzas para quitar un cubreobjetos individuales de la solución de etanol 70% y rápidamente la llama para eliminar el exceso. Coloque el cubreobjetos en una placa de 6 pozos. Si llamas en una campana de cultura no es una opción, considere autoclave el cubreobjetos tras el enjuague con agua desionizada o esterilización bajo la luz de la campana de cultivo durante al menos 30 min UV
- Para facilitar la adherencia de las células, la capa cubreobjetos con 0.01% poly-L-lisina estéril durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Aspirar la poli-l-lisina y enjuague el cubreobjetos con solución salina tamponada estéril de fosfato (PBS). Aire seco y coloque en el refrigerador durante la noche.
- a la mañana siguiente, retire los cubreobjetos del refrigerador y agregar 300 μL de laminina, a una concentración de 50 μg/mL, por lo menos 30 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que la laminina está cuidadosamente colocada directamente sobre el cubreobjetos.
Nota: Este paso de laminina no es necesario para las células COS-7 o las células HEK293 pero se requiere de miocitos ventriculares aislados. Otras células primarias tales como las células de músculo liso vascular o neuronas pueden adherirse mejor a colágeno o fibronectina revestido cubreobjetos.
3. Preparación de las células
las células de crecer COS-7- células cultivadas
- (o línea celular preferido) en una placa de cultivo de 10 cm en 10 mL Dulbecco ' s medio de cultivo medio de águilas modificado (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% solución de penicilina/estreptomicina (PS). Crecer las células en una incubadora de cultivo celular en 37 ° C y 5% CO 2.
- Cuando las células alcanzan el 90% de confluencia, cosecharlos del plato 10 cm aspirando los medios DMEM y agregar 5 mL de solución EGTA tripsina al 0,05%. Una vez que las células comienzan a reunir y separar, neutralizar inmediatamente la tripsina con DMEM suplementado.
- Uso 5 mL pipeta serológica para eliminar las células de la fuente. Pipeta el medio contra la base del plato varias veces para eliminar todas las células que permanecen adherente y homogénea distribución de las células en el medio de cultivo.
- Células en platos de cultivo de 35 mm para lograr la confluencia de 70% para la transfección de la placa. Hacer que el volumen del medio en el plato hasta 2 mL con solución fresca de DMEM/FBS/PS. Construcciones
- COS-7 transfectar las células con el ADN del plásmido deseado (por ejemplo, plásmido sec61β mCherry), utilizando un reactivo de transfección adecuada y según el fabricante ' instrucciones s.
Nota: Puede tardar 24-48 h para la proteína a expresar, según el plásmido o el reactivo de transfección usado.
- Miocitos ventriculares ratón adulto
- aislar miocitos ventriculares de ratón adulto usando la bien establecida Langendorff perfusión método 6. Resuspenda el sedimento resultante de miocitos en medio 199 (M199) complementado con 2,5% FBS y 1% de PS.
4. Las células de la galjanoplastia
- las células Transfected COS-7
- aspirar 2 mL de DMEM/FBS/PS solución de plato de 35 mm y añadir 1 mL de Ca 2 +-libre de PBS. Vuelva el plato a la incubadora por 2 minutos las células de la cosecha del plato aspirando primero el Ca 2 +-libre de PBS y luego agregar 1 mL de solución EGTA tripsina al 0,05%.
- Una vez que las células comienzan a reunir y separar, neutralizar inmediatamente la tripsina con 1 mL de DMEM suplementado. Pipetee suavemente arriba y abajo varias veces para asegurar las células transfected se distribuyen uniformemente a lo largo de la suspensión de la tripsina-EGTA-DMEM de 2 mL.
- Placa transfected las células COS-7 sobre cubreobjetos recubiertos de poli-l-lisina en una densidad adecuada para que las células se pueden visualizar y llenan el volumen del plato hasta 2 mL de DMEM/FBS/PS (p. ej., añadir suspensión 90 μl a cubreobjetos Agregar suplido de 1.910 μl DMEM, plato para distribuir las células del remolino).
Nota: Las células no necesita ser contado pero el volumen de las células que se añade a cada plato dependerá de la confluencia de las células. - Vuelta plateado las células a la incubadora de cultivo celular durante la noche para permitir que las células se adhieren y recuperar.
- aspirar 2 mL de DMEM/FBS/PS solución de plato de 35 mm y añadir 1 mL de Ca 2 +-libre de PBS. Vuelva el plato a la incubadora por 2 minutos las células de la cosecha del plato aspirando primero el Ca 2 +-libre de PBS y luego agregar 1 mL de solución EGTA tripsina al 0,05%.
- Miocitos ventriculares ratón adulto
- aspirar miocitos laminina y placa directamente sobre el cubreobjetos cubierta en una densidad adecuada para que las células individuales pueden ser visualizadas. Esto dependerá de la densidad de células viables del aislamiento.
- La suspensión de células en una bóveda en el cubreobjetos y el lugar en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2 por ~ 45 min permitir la adherencia del balance.
5. Fijación de las células
- eliminar las células de la incubadora y Aspire cuidadosamente el medio.
- Enjuague las células adherentes de una vez con PBS.
- Fijar las células con un fijador optimizado para la aplicación individual y los anticuerpos.
Nota: Un criterio importante a tener en cuenta al seleccionar un fijador es la preservación de la estructura celular de la muestra, asegurando también que no hay ningún cambio conformacional en el antígeno de interés. A los efectos de este protocolo la fijación fijación con glutaraldehído al 3% paraformaldehyde/0.1% (PFA/GA) y con el 100% se discute metanol.
- Fijación de PFA/GA de transfected COS-7 células expresando mCherry Sec61β
- 1.9 mL de la mezcla 16% PFA y 20 μl 50% GA y añadir PBS para hacer un volumen final de 10 mL.
- Agregue 1 mL solución PFA/GA a cada plato de las células y fix recién preparada durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirar las células PDC/GA y enjuagar 3 veces con PBS.
- Lave las células adheridas con PBS, 5 veces por 5 minutos cada uno. Realizar todos los pasos de lavado en un agitador a una velocidad moderada (p. ej., 50 ciclos por minuto).
- a continuación, reducir los grupos aldehído libre con 1 mL 0,1% masa/volumen borohidruro de sodio en agua desionizada preparados.
- Enjuague las células dos veces luego lavar 3 veces de 5 minutos cada uno en PBS para eliminar todo rastro de borohidruro de sodio y el alcohol produce cuando reacciona con aldehídos gratis.
- Fijación de metanol de miocitos ventriculares ratón adulto
- Agregar cuidadosamente 1 mL de metanol 100% helado a las células. Inclinación de la placa de 6 pozos y pipetear el metanol contra la pared lateral en lugar de directamente sobre el cubreobjetos. Luego incline la placa de 6 pozos a horizontal para permitir que el metanol lavar uniformemente sobre las células. Fijar por 5 min a-20 ° C.
- Aspirar las células fijador y enjuagar 3 veces con PBS.
- Lavar las células adheridas con PBS, 5 veces por 5 min en un agitador.
6. Bloqueo de la Unión no-específica
- bloque por 1 h a temperatura ambiente en la solución de bloqueo (véase la Tabla de materiales).
Nota: Varias soluciones pueden utilizarse para bloquear la Unión de anticuerpos no específicos incluyendo 3% albúmina de suero bovino (BSA) o suero no inmune de la misma especie que el anticuerpo primario.
7. Detección de
- incubación del anticuerpo primario
- aspirar la solución de bloqueo. No lave o enjuague.
- Preparar la solución de anticuerpo primario como sigue (ver paso 7.1.5): diluir el anticuerpo primario a una concentración de 10 μg/mL (o fabricante ' s sugiere concentración) en la solución de incubación del anticuerpo (ver la tabla de de materiales ). El balance de este pequeño volumen sobre el cubreobjetos y cuidadosamente establecer un cuadrado de film de plástico de la parafina en la parte superior. Esto ayuda a extender el volumen pequeño del anticuerpo sobre el cubreobjetos y protege contra la evaporación.
- Coloque la placa de 6 pozos en una cámara de humedad e incubar durante una noche en el refrigerador.
- En la mañana, eliminar las células de la cámara de humedad, con cuidado quite la película de parafina cuadrada de la superficie del cubreobjetos y aspirar la solución de anticuerpo primario.
- Enjuagar 3 veces con PBS, luego lavar 5 veces durante 5 min con bloque solución de lavado (véase Tabla de materiales) en el rotor.
Nota: Este protocolo utiliza los siguientes anticuerpos, anti-RFP anticuerpo monoclonal de ratón para las imágenes mostradas en la figura 2 y conejo policlonales FP1 7 anti-Ca V 1.2 anticuerpos (un regalo de Prof. Infierno de Johannes, UC Davis) para las imágenes que aparecen en la figura 3. Con respecto a la cámara de humedad, una fiambrera de plástico con una tapa ajustada, forrado con toallas de papel mojadas obras. PBS puede utilizarse para el lavado de pasos, sin embargo este protocolo mejora la especificidad etiquetado y reduce el fondo utilizando una solución diluida de bloqueo para pasos de lavado.
- Incubación del anticuerpo secundario
- Aspire la solución de lavado y añadir 200 μL conjugado anticuerpo secundario 1:1,000 de solución diluida en la solución de incubación del anticuerpo. Coloque una escuadra de la película de parafina sobre el cubreobjetos (ver paso 7.1.2).
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Anticuerpo secundario aspirado y enjuagar 3 veces con PBS.
- Lavar las células con solución diluida de bloqueo 5 veces durante 5 min en el eje de balancín de.
- Lavado 3 veces durante 5 minutos con PBS.
Nota: Este protocolo describe el uso de anti-ratón 647 Alexa conjugado de anticuerpo secundario y anti-conejo 647 Alexa conjugado de anticuerpo secundario figura 2 y figura 3, respectivamente. Para el etiquetado de la proteína sola, 647 de Alexa es el fluoróforo preferido debido a su alta fotones cuenta (mejora la precisión de la localización) y el ciclo de trabajo baja (mejora de resolución temporal) 8. Muchas otras opciones del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo, como Atto o Cy-tintes, están disponibles. Se refieren a Dempsey et al. 8 y Chozinski et al. 9 para las evaluaciones integrales de la idoneidad de varios fluoróforos/tintes para proyección de imagen de súper resolución.
8. Posteriores a la fijación (paso opcional)
- GA de 50% diluir 50 μL en 10 mL de PBS para obtener una solución de 0.25% GA. -Fijar las células durante 10 minutos en esta solución a temperatura ambiente.
- Lavar con PBS 3 veces durante 5 min en un agitador.
9. Almacenamiento de muestras
- almacenar las muestras en el refrigerador (4 ° C) en un recipiente de papel forrado de aluminio para proteger de la luz hasta la proyección de imagen.
- Para almacenamiento a largo plazo de muestras (hasta varios meses), almacenar en PBS con azida de sodio de 3 mM para evitar el crecimiento bacteriano.
10. Preparación Buffer GSD súper resolución Imaging Photoswitching
- preparar el barrido del oxígeno ' GLOX ' solución como sigue:
- en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 12,5 la catalasa μl (stock 34 mg/mL), 3,5 mg glucosa oxidasa y 0,5 μL 1 M Tris (pH = 8) a 49.5 μl PBS.
- Vortex brevemente para disolver los componentes en solución y luego centrifugar a 20.800 x g durante 3 min a 4 ° C.
Nota: se han encontrado soluciones de depuración de oxígeno como GLOX, oponerse al fotoblanqueo. GLOX debe conservarse en el refrigerador hasta una semana. Repetir la centrifugadora cada vez se usa.
- Solución de tiol Prepare la inducción de photoswitching como sigue:
- 100 mM solución de β-mercaptoethylamine (MEA) en PBS y modificar el pH a pH 8 o en su defecto usar β-mercaptoetanol (βME). Almacene la solución MEA alícuotas en el congelador (-20 ° C) hasta por 1 semana.
- Inmediatamente antes de la proyección de imagen, preparar el buffer final de conmutación en el hielo agregando el tiol y barrido de oxígeno componentes juntos. Para 500 μl GLOX-MEA, añadir 5 μl GLOX a 50 μl MEA (pH = 8) y 445 μl de tampón de solución salina (2.5 mL 1 M Tris pH = 8, 29,22 mg NaCl (concentración final de 10 mM), 5 g de glucosa y 47,5 mL de agua). Como alternativa, para la solución de GLOX βME añadir 5 μl GLOX 5 μl βME y 490 μl de tampón de solución salina.
- Mantener las soluciones en el hielo y utilizar según sea necesario para montar las muestras en portaobjetos depresión.
Nota: Soluciones que contienen tioles como βME o MEA inducen photoswitching de tintes base de Cianina como Alexa 647 10 o base de xanthene tintes como Alexa 568. ΒME produce mejores resultados con 647 de Alexa mientras que MEA es preferida para Alexa 568 o cuando son 2 proteínas para ser fotografiada con un doble enfoque etiquetado utilizando Alexa 568 y 647. El búfer se deteriorará durante horas debido a la acidificación. Esto conducirá a una reducción en el conteo de fotones promedio de la muestra. Para evitar esto, es recomendable hacer buffer de photoswitching fresco después de 2-3 h o si se observa una disminución en la cuenta del fotón media o una extensión notable del tiempo necesario para photoswitching inducida. Un artículo reciente describió un nuevo buffer imagen buey-EA que todavía no hemos probado pero al parecer pH estable exhibe niveles durante varios días y realiza mejor que GLOX multicolor de aplicaciones 11.
- Mantener las soluciones en el hielo y utilizar según sea necesario para montar las muestras en portaobjetos depresión.
11. Montaje de muestras
- Monte cubreobjetos con las células etiquetadas (véanse las secciones 1-9) sobre la depresión desliza, por medio de 100 μl buffer imagen.
- Selle todos los bordes del cubreobjetos con un pegamento de silicona para evitar la rápida oxidación del búfer imágenes. Espere varios minutos hasta que el pegamento de silicona ha curado completamente de lo contrario el cubreobjetos se deriva cuando proyección de imagen.
Nota: Pegamento de silicona no endurecen si entra en contacto con βME. Asegúrese de secar los bordes del cubreobjetos para evitar que el pegamento de silicona entre en contacto con el buffer de imagen.
12. Adquisición de imágenes
- ver tabla 1 para una lista de imágenes de parámetros utilizados en la figura 2 y figura 3.
- Para comenzar, seleccione el láser adecuado para iluminar la muestra según el fluoróforo seleccionado. El sistema SR-GSD en el presente Protocolo está equipado con láseres de alta potencia (488 nm, 1,4 KW/cm 2; 532 nm, 2.1 KW/cm 2; 561 nm, 2.1 KW/cm 2 642 nm, 2.1 KW/cm 2). figura 2 utiliza el láser 642.
- Utilizar un objetivo de inmersión en aceite con un alto na El sistema SR-GSD aquí está equipado con un APO de PL HC 160 X / 1.43 objetivo NA.
- Eligió el cubo imagen dicroico apropiado. El sistema SR-GSD en el presente Protocolo está equipado con 488 HP-T, 532 HP-T, 568 HP-T, HP 642-T con filtros de paso de banda de emisión de 505-605 nm, 550-650 nm y 660-760 nm.
- Seleccione el modo de adquisición 2D. Ajustar la cámara a tiempo de exposición y modo de marco-transferencia a 10 ms (100 Hz). Ajuste la ganancia de EM a 300. Seleccionar el umbral de detección.
Nota: Los umbrales bajo producen imágenes con alta experiencia. Umbrales de alta pueden filtrar hacia fuera la señal de interés. Determinar el umbral basado en controles negativos como cubreobjetos no transfected las células o las células se incubaron con el anticuerpo secundario sólo la proyección de imagen. - Activar el control automático de eventos y eventos sets por imágenes a 8.
- Ingrese el tamaño del pixel en la ficha de adquisición GSD (iniciar con 10 nm o tamaño de pixel de 20 nm). Asegúrese de que " modo de histograma " se selecciona en la pestaña de herramientas GSD bajo las opciones de cálculo de imagen de alta resolución antes de la adquisición de la imagen.
- a las proteínas de la membrana plasmática de la imagen, seleccione el modo de la TIRF y modificar el ángulo de incidencia para determinar la profundidad de penetración.
- Enviar electrones al Estado oscuro (llamado bombeo), ajustar la intensidad de laser al 100%.
- Sola molécula de detección durante el bombeo y escoja ajuste de adquirir automáticamente cuando la correlación del marco es 0.20.
- Para la adquisición, ajustar la intensidad de laser al 50%.
- Establece el número de fotogramas de adquisición en 60.000.
Nota: El investigador puede encontrar que una muestra más o menos requiere marcos que esto. Modificar el número de bastidor en base a observaciones de fluoróforo fotoblanqueo y parada cuando no otros acontecimientos son detectables. - Inicio adquisición.
Nota: En el principio de adquisición, todas las moléculas del tinte en el estado fluorescente y luego al Estado oscuro. Cuando la correlación del marco llega 0.20, imágenes comenzará a ser adquirido. Cuando se detectan menos de 8 eventos por marco, el láser 405 se encenderá, alentando fluoróforos a la transición desde el estado oscuro al estado base. Momento de la adquisición de imágenes para un conjunto de datos de n = x las células de n = y animales, parámetros como la profundidad de la penetración TIRF, umbral de detección y número de cuadros adquiridos deben mantenerse constante.
13. Análisis de imágenes
- para cuantificar el tamaño del clúster proteína, utilizar la ' analizar las partículas ' característica de ImageJ.
Nota: El análisis adicional puede realizarse mediante análisis de localización relativa basada en microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta-RLA) o similar de 13.- Realizar el análisis de cluster ( figura 3) con ImageJ como sigue:
- abrir el archivo de imagen a ser analizada. Este debe ser 10 nm histograma sola molécula localización mapa generado en el software de imagen descrito anteriormente (sección 12).
- Ajustar el brillo y contraste para visualizar la imagen: haga clic en el menú imagen, seleccione ajustar, después de brillo y contraste. Haga clic en la opción auto.
- Cambiar el tipo de imagen a 8 bits: seleccione el menú imagen, luego seleccione el tipo y elija 8 bits.
- Establecer la escala de la imagen: abrir el menú analizar, haga clic en ajuste de escala y especifique los siguientes parámetros: distancia = 1, conocida la distancia = 10, 1 píxel = 10 nm.
- Para seleccionar las mediciones que se obtengan, abra el menú analizar, seleccione sets medidas y marque la casilla al lado de la opción área de.
- Ajustar el umbral de la imagen. Abre el menú imagen, seleccione ajustar y seleccione umbral, seleccione encima o por debajo. Hacia el valor máximo de 255 y mover el valor mínimo 1 y haga clic en aplicar.
- Para analizar las partículas, abra el menú analizar, seleccione analizar partículas. Seleccione la casilla para seleccionar las unidades de píxeles, mostrar resultados y resumir. Establezca el tamaño en 4-infinity (puesto que la resolución es ~ 20 nanómetro), selecciona la opción contornos pelado y haga clic en Aceptar. Se creará un archivo de resumen que contendrá los detalles de análisis tales como el tamaño promedio del racimo y el número de clusters en la imagen.
Nota: Debe tener cuidado al hacer conclusiones sobre el número de proteínas dentro de un grupo particular, como el número de puntos localizados no se correlaciona linealmente con el número de proteínas. GSD localiza tintes que se conjugan a los anticuerpos, lo que resulta en un error de vínculo que desplaza la etiqueta fluorescente del epitopo por > 10 nm en cualquier dirección. Además, si se utilizan anticuerpos policlonales, anticuerpos más de uno pueden enlazar a un solo antígeno y confundir la secundaria cuestión comercial, aún más anticuerpos se conjugan, en promedio, 3-6 moléculas de colorante por lo que no siempre es igual a un fluoróforo una proteína. Error de vinculación puede reducirse por conjugar un tinte directamente al anticuerpo primario (eliminación de la secundaria) o mediante un esquema etiquetado basada en nanobody 14.
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Representative Results
Como se indica en la introducción, hay muchos microscopía de resolución súper diferentes modalidades de la proyección de imagen. Este protocolo se centra en la proyección de imagen de súper-resolución GSD. Imágenes representativas y localización mapas se muestran en la figura 2 y figura 3.
La figura 2 muestra una células COS-7 transfectadas con el ER proteínas, mCherry Sec61β y procesados con el método arriba descrito. Figura 2A -2B permite la comparación de imágenes de la sala de emergencias tomadas usando un microscopio de súper-resolución en modo TIRF (A) y usando el modo de adquisición de GSD (B). Las imágenes muestran una mejora en la resolución axial cuando adquiere en el modo de GSD. Esto se demuestra más en el perfil de trama que lo acompaña, que puede generarse con el ImageJ, que muestra la diferencia en la distribución de las curvas de intensidad normalizada en las áreas de interés (línea amarilla). Estas curvas representan el diámetro de los túbulos de ER que parecen ser mucho más estrecho cuando se examina en el modo de GSD. Microscopia GSD tiene una precisión de localización lateral de aproximadamente 20 nm y por lo tanto representa aproximadamente un aumento de diez veces en la resolución más allá del límite de difracción. Esta mejora en la resolución se traduce en una representación más precisa de la estructura de los túbulos de ER.
La mejora en la resolución de súper resolución de imagen de GSD se demuestra más en la figura 3, muestra un miocito cardiaco marcado con un anticuerpo anti-Cav1.2, procesado como se describió anteriormente. La imagen en la Figura 3A fue tomada usando un microscopio de súper-resolución GSD en entorno TIRF. Racimos de CaV1.2 pueden verse canales para organizar a lo largo de la red de t-tubule. Figura 3B muestra la misma célula, sin embargo, esta imagen fue adquirida utilizando el modo GSD. La mejora en la resolución axial es más prominente en los paneles que se centran en solo grupos de canales (figura 3B), cuando se realiza una comparación entre el mismo ROI reflejado usando TIRF y GSD, diferentes grupos de canales son fáciles de identificar como el resultado de la mejora en la resolución ofrecida por proyección de imagen de GSD. Estos paneles también comparan la diferencia en el umbral de detección, definido como el número de fotones por pixel. Este parámetro será elegido cuidadosamente y adaptado a las necesidades del experimento. Panel 3D muestra contornos de clúster cuando la imagen GSD se procesó utilizando el software ImageJ, de esto se puede determinar el área de cluster para cada grupo individual en la imagen (ver Nota 13.1.8 arriba y la sección de discusión de consideraciones importantes Cuando se realiza dicha cuantificación). Esta información puede utilizarse entonces para generar el histograma de frecuencia de panel C 3. Este análisis puede utilizarse para examinar los cambios en el tamaño del clúster, o el número de racimos entre muestras bajo control frente a condiciones de prueba (e.g., peso vs mutantes canales o células tratadas con drogas vs no tratados). Usando los métodos descritos en el presente Protocolo junto con experimentos complementarios fotoblanqueo paso a paso, los investigadores han determinado que CaV1.2 canales se distribuyen en grupos de, en promedio, 8 canales en miocitos cardiacos15 .
Figura 1: representación esquemática de la cronología de los eventos para la proyección de imagen de súper-resolución de proteínas de membrana. Día 0 se refiere al primer día del proceso para el anticuerpo etiquetado. La sección de protocolo se refiere a la sección en el protocolo donde se encuentra la información detallada en cada paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: microscopía de superresolución ofrece mejora de señal a ruido y mayor resolución espacial. (A) izquierda COS-7 células expresando mCherry-Sec61β, fijo y etiquetada como se describe en el protocolo y reflejada mediante microscopía TIRF convencional. Panel de la derecho, superior: solo túbulo de ER. Panel de la derecho, inferior: parcela perfil tomado a lo ancho del túbulo ER (línea amarilla). (B) misma célula como (A) excepto la localización mapa se generó mediante resolución súper GSD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Proyección de imagen de súper-resolución de canales de Cav1.2 en miocitos cardiacos. Huella TIRF (A) de un miocito cardiaco aislado, fijo y teñidas con anti-CaV1.2 anticuerpo (FP1). (B) izquierda: huella de TIRF de súper-resolución de la misma del miocito cardiaco como en (A). Derecha: agrandamiento de porciones del mapa de localización que han sido sometidas a los umbrales de detección diferentes. Tenga en cuenta que a medida que uno aumenta el umbral de detección, el tamaño aparente de CaV1.2 canal grupos disminuyen. (C) histograma de frecuencia de tamaños de cluster obtenida desde el mapa de localización (b). (D) izquierda: contornos de la CaV1.2 racimos de (B). Derecho: partes ampliadas de la imagen han sido sometidos a los umbrales de detección diferentes. Nota, similar a (B), a medida que aumenta el umbral de detección, el área ocupada por la CaV1.2 canal racimos disminuye. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fluoróforo utilizado | Alexa-647 |
| Láser | 642 nm |
| Filtros de emisión | 623 HP-T |
| Lente | NA DE 160 X 1.43 |
| Tiempo de exposición | 10 ms |
| Umbral de detección | 65 |
| Ángulo de incidencia (profundidad de la penetración) | ° 65,04 (150 nm) |
| Ganancia de EM | 300 |
| #frames adquirido | 30.000 – 60.000 |
| Intensidad para el bombeo del laser | 100% |
Tabla 1: Lista de parámetros de la proyección de imagen.
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Discussion
La reciente explosión de las tecnologías que permiten la proyección de imagen más allá del límite de difracción han ofrecido nuevas ventanas en las complejidades de células de mamífero en el espacio y el tiempo. Estas tecnologías incluyen tormenta STED, Palma, GSD, SIM y sus variantes (p. ej., dSTORM, FPALM). El ingenio de los científicos detrás de estas técnicas nos ha permitido sortear las limitaciones impuestas por las leyes de la física que rigen la difracción de la luz. A pesar de este enorme logro, cada una de estas técnicas hace algún tipo de compromiso para lograr la super- resolución de y, como tal, tiene sus limitaciones. La situación ideal que buscan biofísicos y biólogos de la célula es óptima sensibilidad, alta resolución y rápida adquisición, con no fotoblanqueo. Además, uno debe seguir siendo consciente que mediante la eliminación de las células de animales, inherentemente cambiarlos y cambiar potencialmente la dinámica molecular. Por lo tanto, la búsqueda para desarrollar una tecnología de súper resolución que permite la dinámica, vivo de la célula, proyección de imagen de molécula única en vivo, respiración animal va en. Por ahora, tenemos herramientas a nuestra disposición que puede generar imágenes con mejoras 10 veces en la resolución de la difracción limitada. En este artículo, discutimos la preparación de muestras, adquisición de imágenes y análisis de GSD que permiten resoluciones de hasta 20 y 50 nm en las dimensiones lateral y axiales, respectivamente.
Aunque el objetivo de este protocolo es en Sec61β y CaV1,22 + canales de Ca tipo L, el protocolo descrito anteriormente puede servir como una plantilla para los investigadores que deseen proteínas diferentes de la imagen en sus propios laboratorios en un microscopio GSD. Los atributos positivos de este tipo de protocolo son que es relativamente sencillo, puede ser modificado y aplicado a un número de diferentes tipos de células y puede ser fácilmente adaptado a la imagen de varios color. Las limitaciones obvias son esa super resolución sistemas, equipados con una cámara EM-CCD sensible capaz de detectar una sola molécula, todavía tienden a ser prohibitivo para muchos laboratorios.
A medida que crece el número de laboratorios que utilizan la microscopía de superresolución como su técnica preferida de la proyección de imagen, se necesita más uniforme entendimiento y el acuerdo sobre interpretación, procesamiento y adquisición de la imagen. ¿Cómo, por ejemplo, una cuantificar el nivel de proximidad de dos proteínas que aparecen colocalized en un píxel de difracción limitada pero transpiran para realmente mostrar poca superposición en todos en súper resolución de imagen/mapa? De hecho, este escenario ha surgido ya varios se suponía colocalized proteínas, como la adherencia proteínas complejas paxillin y zyxin. Como la resolución que microscopios invariablemente logran aumentos, tal vez proteínas no se informará a 'colocalize' sino más bien para no-al azar han distribuido patrones de localización preferida alrededor de uno con el otro. Después de todo, es imposible que dos proteínas que físicamente ocupan exactamente el mismo espacio de 3 dimensiones. Algunas soluciones a este dilema de análisis están comenzando a emerger en la literatura, incluyendo el análisis de localización relativa basada en microscopía reconstrucción óptica estocástica (tormenta-RLA), que al parecer puede cuantificar la frecuencia y el grado de solapamiento entre dos co etiqueta proteínas y también proporcionar medidas cuantitativas de la distancia entre la no superposición de proteínas13. Al comparar un canal a otro en la estupendo-resolución, por supuesto es fundamental para que tenga registro correcto entre los dos canales. Esto puede evaluarse usando granos fluorescente multicolor microesfera y proyección de imagen en cada canal individual luego superponer las imágenes. Además, puesto que el SR-GSD microscopio 3D también puede funcionar como un microscopio de la TIRF y generar localización de súper-resolución mapas en TIRF, es importante para que coincida con la profundidad de penetración entre los canales de dos colores, como cambio de ángulos TIRF dependiendo de la longitud de onda de la luz usada para excitar la muestra.
Además, como se muestra en la figura 3B y 3D de la figura, un mapa de localización puede aparecer muy diferente dependiendo del grado de 'umbral'. Si el umbral de detección se establece demasiado bajo, las estructuras parece ser más grande de lo que realmente son como la probabilidad que uno incluye falsos inespecífica etiquetado de 'ruido' aumenta. Por el contrario, si el umbral de detección se establece demasiado alto, entonces las estructuras pueden aparecer más pequeñas de lo que verdaderamente son como se excluyen los acontecimientos 'reales'. Por lo tanto, umbral debe aplicarse con razón y precaución. ¿Cómo se puede determinar un umbral de detección razonable para una muestra determinada? Los controles son fundamentales. Como con cualquier método inmuno-etiquetado, controles positivos y negativos se deben realizar para demostrar la especificidad de los anticuerpos. Con los controles adecuados, es posible obtener un umbral de detección por encima del cual debe observarse sólo de etiquetado específicas. Controles adecuados incluyen muestras en las que se ha omitido la incubación del anticuerpo primario por lo que puede observarse una muestra expuesta solamente al anticuerpo secundario. De tal control, se puede discernir el atascamiento no específico de un anticuerpo secundario. En una muestra preparada, esto debe resultar en una menor cuenta evento por imagen y un menor número medio de fotones por pixel en comparación con la muestra se incubó primaria y secundaria. El umbral de detección de la imagen puede ajustarse para que el etiquetado no específica puede ser eliminado. El mismo umbral de detección debe utilizarse cuando la proyección de imagen la muestra incubada primaria y secundaria para mejorar la confianza que el ruido se elimina. Otros controles incluyen las pruebas de la especificidad del anticuerpo primario. En las células transfected, si la proteína marcada no se expresa de forma nativa en la línea celular, entonces una simple prueba de la especificidad del anticuerpo primario es realizar el procedimiento de etiquetado en las células untransfected. Para demostrar la especificidad del anticuerpo primario en células primarias, un nocaut en genético de la proteína marcada es el estándar de oro. Umbrales de detección también se pueden definir mediante estos experimentos de control anticuerpo primario. En la ausencia del antígeno blanco, cualquier emisión de fluorescencia es inespecífica. Como con los controles sólo secundarios, con un buen anticuerpo primario, menos eventos por imagen deben ser observados y por lo tanto, sobre el mismo número de fotogramas, un más bajo significa número de fotones por pixel debe ser evidente. El umbral de detección puede ajustarse así a un nivel que eliminará el fondo no específico coloración debido a la Unión del anticuerpo primario fuera del objetivo. Para total transparencia, se sugiere que los autores deben presentar imágenes con sus parámetros de umbral claramente y quizás con un enlace a los datos en bruto en un onlindepositario e.
El investigador también debe seguir siendo consciente de que varios anticuerpos secundarios pueden enlazar un único anticuerpo primario por lo que no debe suponerse una relación de 1:1 primaria: secundaria obligatoria. Además, anticuerpos secundarios comerciales comúnmente se conjugan para múltiples fluoróforos, por ejemplo, los anticuerpos secundarios en este protocolo se destacan por el fabricante para ser conjugado con fluoróforos de 2-8. Como una solución a esto, un fluoróforo puede ser directamente conjugado a un anticuerpo primario. Espectrofotometría puede entonces utilizarse para determinar el número promedio de fluoróforos por anticuerpo primario. Varios kits disponibles en el mercado están disponibles para realizar este proceso de conjugación. Sin embargo, incluso si se logra una estequiometría 1:1, la molécula de fluoróforo sí mismo puede crear problemas más overcounting debido al parpadeo y conmutación reversible de fluoróforos. En la práctica, esto significa que un fluoróforo puede ciclo varias veces entre la tierra y el estado excitado emite grupos de fotones como lo hace. Estos fotones pueden detectarse en varios pixeles vecinos y llevan a la sobreestimación del tamaño del clúster. Otros investigadores han abordado este problema al combinar las emisiones fluorescentes agrupadas en cortos períodos de tiempo y el espacio de16,17. Se trata de un enfoque empírico algo que todavía no elimina la posibilidad de que el mismo fluoróforo podría ciclo al Estado oscuro por un período prolongado, a continuación, retroceso a un estado de ciclismo/emisión una vez más y ser juzgado como una segunda molécula. Por lo tanto, el número de moléculas en un clúster no puede calcularse basado únicamente en el tamaño del clúster. Por el momento, no hay ninguna solución perfecta a estos problemas y, por lo tanto, el uso de la proyección de imagen de súper-resolución conjuntamente con otra técnica como paso a paso fotoblanqueo puede dar una estimación aproximada del número de moléculas por racimo. Controles pertinentes para aumentar la confianza en las mediciones de área de cluster incluyen comparar tamaños de clúster de proteínas monoméricas conocidas (p. ej., CD86) y dimérico las proteínas conocidas (p. ej., CTLA-4) a los de la proteína de interés según lo sugerido por Fricke et al. 18.
En Resumen, en el presente artículo, se establece un protocolo sencillo inmunomarcación adelante describiendo la preparación de muestras fijadas para la proyección de imagen de súper-resolución. Además, se discuten algunos errores comunes en la adquisición de imágenes y análisis. Como proyección de imagen de súper-resolución se convierte en más común, puede ser necesario para las revistas que establecen un nuevo conjunto de directrices para evitar manipulación inadecuado de estos mapas de complejas imágenes y localización. Microscopía de superresolución ha añadido una nueva herramienta a la caja de herramientas de biofísicos y biólogos de célula y ya ha hecho un impacto extraordinario en nuestra comprensión de la arquitectura celular y organización molecular.
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Disclosures
Los autores tienen intereses que compiten a revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención de la AHA para R.E.D. (15SDG25560035). Autores desean reconocer el Dr. Fernando Santana para el uso de su microscopio 3D de Leica SR GSD y el Dr. Johannes Hell por proporcionar amablemente el anticuerpo de la FP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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