Summary
Denna artikel beskriver ett protokoll för detektion av en eller flera plasma eller intracellulära membranproteiner med grundtillståndet utarmning (GSD) super-resolution mikroskopi i däggdjursceller. Här diskuterar vi de fördelar och överväganden för att använda sådana metoder för visualisering och kvantifiering av cellulära proteiner.
Abstract
Framsteg i fluorescerande mikroskopi och cellbiologi är intimt korrelerade, med den förbättrade förmåga att visualisera cellulära händelser som ofta leder till dramatiska språng i vår förståelse av hur celler fungerar. Utveckling och tillgänglighet av super-resolution mikroskopi har avsevärt utökat gränserna för optisk upplösning från ~ 250-20 nm. Biologer är inte längre begränsade till som beskriver molekylära interaktioner i form av colocalization inom ett diffraktion begränsad område, snarare är det nu möjligt att visualisera de dynamiska samspelet mellan enskilda molekyler. Här, beskriva vi ett protokoll för visualisering och kvantifiering av cellulära proteiner av grundtillståndet utarmning mikroskopi för fasta cell imaging. Vi ger exempel från två olika membranproteiner, en del av det endoplasmatiska nätverket translocon, sec61β och en plasmamembran-lokaliserad spänningskänsliga L-typ Ca2 + kanal (CaV1.2). Diskuteras är specifika Mikroskop parametrar, fixering metoder, Foto-switching buffert formulering, och fallgropar och utmaningar av bildbehandling.
Introduction
Cellulär signalering reaktioner översätta ändra inre och yttre miljöer för att initiera ett cellulärt svar. De reglerar alla aspekter av människans fysiologi, tjänstgör som grunden för hormon och neurotransmitterfrigöraren, heartbeat, vision, gödsling och kognitiv funktion. Störningar i dessa signalering kaskader kan få allvarliga följder i form av patofysiologiska förhållanden inklusive cancer, Parkinsons och Alzheimers sjukdom. Decennier, biologisk och medicinsk utredare framgångsrikt har använt fluorescerande proteiner, sonder och biosensorer tillsammans med fluorescensmikroskopi som de primära verktyg för att förstå den exakta rumsliga och tidsmässiga organisationen av dessa cellulära signaler.
Styrkan i optiska tekniker såsom epifluorescence, confocal, eller totalreflexion fluorescensmikroskopi (Frida) är deras känslighet, hastighet och kompatibilitet med levande cell imaging, medan den största begränsningen är deras diffraktion begränsad upplösning, menande strukturer eller proteinkomplex som är mindre än 200-250 nm inte kan lösas. Med teoretisk och praktisk utveckling av deterministiska super-upplösning (t.ex., stimulerad emission utarmning mikroskopi (STED1), strukturerat belysning mikroskopi (SIM2) eller stokastiska super-upplösning (t.ex. , photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM3) eller grundtillståndet utarmning (GSD4,5)), laterala och axiella upplösning i fluorescensmikroskopi har utökats utöver den diffraktion barriären, till beordra av tiotals nanometer. Utredarna nu alltså oöverträffad förmåga att visualisera och förstå hur protein dynamik och organisationen översätter till funktion på nära-molekylär nivå.
Grundtillståndet utarmning mikroskopi följt av enskilda molekylen return (GSDIM), eller helt enkelt GSD kringgår som det kallas, diffraktionsgränsen genom att minska antalet samtidigt avger fluorophores4,5. Hög energi laserljus används för att excitera fluorophore-märkt provet, bombardera elektroner med fotoner och öka sannolikheten att de kommer att genomgå en ”spinn-flip' och ange triplett eller 'dark-stat' från exciterat tillstånd4. Detta utarmar effektivt grundtillståndet, därav namnet 'marken state utarmning'. Triplett skick, fluorophores avger inte fotoner och provet visas dimmer. Men dessa fluorophores stochastically återgår till grundtillståndet och kan gå igenom flera photon avger upphetsad-till-mark tillståndsövergångar innan han återvände till triplett staten. Med mindre fluorophores avger vid varje given tidpunkt, photon skurar som avges från enskilda fluorophores blir spatialt och temporalt skiljer sig från angränsande fluorophores. Burst av fotoner kan passa med Gaussisk funktion, den beräknade centroiden som motsvarar positionen för fluorophore med en lokalisering precision som är beroende av den numeriska bländaröppningen (NA) av linsen, våglängden på ljuset som används för magnetisering och avgörande, antalet fotoner som släpps ut per fluorophore. En begränsning av GSD är att, eftersom endast en delmängd av fluorophores avger aktivt när som helst, måste tusentals bilder samlas under flera minuter att bygga upp en komplett lokalisering karta. Den långa förvärv tid kombinerat med hög laser power kravet, innebär att GSD är bättre lämpad att fast snarare än levande prover.
Denna artikel beskriver utarbetandet av fasta prover för super-resolution mikroskopi avbildning av membran och endoplasmatiska nätverket (ER)-bosatta proteiner (för en lista över nödvändiga förnödenheter och reagenser se Tabell för material). Exempel på hur detta protokoll kan enkelt anpassas för att kvantifiera storleken och graden av klustring avL-typ spänningskänsliga Ca 2 + -kanaler (Cav1.2) i sarcolemma av kardiella myocyter, eller används för att visualisera den cellulära fördelningen av ER, demonstreras. Förstå distribution och organisationen av dessa cellulära komponenter är kritiskt viktigt förstå inledande, översättning och slutligen funktionen av många Ca2 +-beroende signalering kaskader. Till exempel är Cav1.2 kanaler fundamentalt viktigt för excitation-contraction koppling, medan receptormedierad Ca2 + release från ER är kanske den mest allestädes närvarande signalering kaskaden i däggdjursceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tvätt glas Coverslips
- dagen före prov bearbetning, rengör #1.5 glas coverslips av sonicating i en 1 M lösning av KOH för 1 h. Detta tar bort eventuella fluorescerande föroreningar som kan finnas på coverslips.
- Skölj KOH från coverslips med avjoniserat vatten.
- När rengöras i KOH, lagra coverslips i 70% etanol förrän du är klar att använda.
2. Beläggning glas Coverslips
Obs: stegen i detta avsnitt bör utföras i en cell kultur huva att förhindra kontaminering.
- Använda pincett att ta bort en enskild täckglas från 70% etanol lösningen och lågor snabbt för att ta bort överskottet. Placera coverslips i en 6-bra platta. Om flammande i huv kultur inte är ett alternativ, överväga autoklavering av coverslips efter sköljning med avjoniserat vatten och/eller steriliseringsprocesser under UV-ljuset i kultur huven i minst 30 min.
- För att underlätta vidhäftning av celler, coat coverslips med steril 0,01% poly-L-lysin för 1 h i rumstemperatur.
- Aspirera den poly-L-lysin och skölj coverslips med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lufttorka och placera i kylskåp över natten.
- Nästa morgon, ta bort coverslips från kylskåpet och tillsätt 300 µL laminin, med en koncentration på 50 µg/mL, minst 30 minuter i rumstemperatur. Kontrollera att laminin noggrant är placerad direkt på täckglaset.
Obs: Detta laminin steg är inte nödvändigt för COS-7 celler eller HEK293 celler men krävs för isolerade ventrikulära myocyter. Andra primära celler såsom vaskulära glatta muskelceller eller nervceller kan följa bättre till kollagen eller Fibronektin belagda coverslips.
3. Beredning av celler
- odlade celler
- växa COS-7 celler (eller rekommenderad cellinje) på en 10 cm kultur maträtt i 10 mL Dulbecco ' s modifierade Eagles Medium (DMEM) odlingsmedium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (PS) lösning. Växa cellerna i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2.
- När cellerna når 90% konfluens, skörda dem från 10 cm skålen genom att aspirera DMEM media och lägga 5 mL 0,05% trypsin-EGTA lösning. När cellerna börjar att runda upp och lossa, omedelbart neutralisera Trypsin med kompletterade DMEM.
- Använda en 5 mL serologiska pipett ta bort celler från skålen. Pipettera medlet mot basen av skålen flera gånger att ta bort celler som förblir anhängare och likartad fördela cellerna i hela odlingssubstratet.
- Platta celler på 35 mm kultur rätter att uppnå 70% konfluens för transfection. Gör volymen av medium i skålen med färska DMEM/FBS/PS lösning upp till 2 mL.
- Transfect COS-7 celler med önskade plasmiden DNA konstruktioner (t.ex., sec61β-mCherry plasmid), med ett lämpligt transfection reagens och enligt tillverkaren ' anvisningar.
Obs: Det kan ta 24-48 h för proteinet till express, beroende på plasmiden eller transfection reagens används.
- Vuxen mus ventrikulära myocyter
- isolera vuxen mus ventrikulära myocyter med den väletablerade av perfusion metod 6. Re centrifugerade resulterande av myocyter i Medium 199 (M199) kompletteras med 2,5% FBS och 1% PS.
4. Plätering celler
- transfekterade COS-7 celler
- aspirera 2 mL DMEM/FBS/PS lösning från 35 mm skålen och tillsätt 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. Återgå skålen till inkubatorn för 2 min. skörd celler från skålen genom första aspirera på Ca 2 +-gratis PBS och sedan lägga till 1 mL 0,05% trypsin-EGTA lösning.
- När cellerna börjar att runda upp och lossa, omedelbart neutralisera Trypsin med 1 mL av kompletterade DMEM. Pipettera försiktigt upp och ner flera gånger för att säkerställa de transfekterade cellerna jämnt fördelade över 2 mL trypsin-EGTA-DMEM suspensionen.
- Plattan transfekterade COS-7 celler på poly-L-lysin belagda coverslips på lämplig djurtäthet så att enstaka celler kan visualiseras och fyll skålen volymen upp till 2 mL med DMEM/FBS/PS (t.ex. lägga till 90 µL cellsuspension på täckglas Tillsätt sedan 1.910 µL kompletteras DMEM, snurra skålen för att fördela celler jämnt).
Obs: Celler behöver inte räknas men volymen av celler som ska läggas till varje maträtt varierar beroende på konfluens cellernas. - Avkastning pläterade celler till cell kultur inkubatorn över natten så att cellerna att följa och återställa.
- aspirera 2 mL DMEM/FBS/PS lösning från 35 mm skålen och tillsätt 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. Återgå skålen till inkubatorn för 2 min. skörd celler från skålen genom första aspirera på Ca 2 +-gratis PBS och sedan lägga till 1 mL 0,05% trypsin-EGTA lösning.
- Vuxen mus ventrikulära myocyter
- aspirera laminin och plattan myocyter direkt på den bestrukna coverslips på lämplig djurtäthet så att enskilda celler kan visualiseras. Detta beror på tätheten av viabla celler som erhållits från isolering.
- Balansera cellsuspensionen i en kupol på täckglas och placera i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 ~ 45 min att möjliggöra vidhäftning.
5. Fixering av celler
- ta bort celler från inkubatorn och sug noga ut mediet.
- Skölj vidhäftande cellerna en gång med PBS.
- Fix celler med ett fixativ optimerad till individuella programmet och antikroppar.
Obs: Ett viktigt kriterium att ha i åtanke när du väljer ett fixativ är bevarandet av cellstruktur av provet, samtidigt också att det finns ingen conformationaländring i antigen av intresse. För tillämpningen av detta protokoll fixering med 3% paraformaldehyde/0.1% glutaraldehyd (PFA/GA) och fixering med 100% metanol diskuteras.
- PFA/GA fixering av transfekterade COS-7 celler uttrycker Sec61β-mCherry
- blanda 1,9 mL 16% PFA och 20 µL 50% GA och lägga till PBS för att göra en slutlig volym av 10 mL.
- Add 1 mL nyberedd PFA/GA lösning till varje maträtt av celler och fix i 10 min i rumstemperatur.
- Aspirera PFA/GA och skölj cellerna 3 gånger med PBS.
- Tvätta klibbade cellerna med PBS, 5 gånger för 5 min varje. Utför alla tvätt steg på en rotator som anges till måttlig hastighet (t.ex., 50 cykler per minut).
- Nästa, minska gratis aldehyd-grupper med 1 mL nyberedd 0,1% massa/volym natriumborhydrid i avjoniserat vatten.
- Skölj celler två gånger sedan tvätta 3 gånger för 5 min varje i PBS att avlägsna alla spår av natriumborhydrid och den alkohol som den producerar när det reagerar med gratis aldehyder.
- Metanol fixering av vuxen mus ventrikulära myocyter
- noggrant tillsätt 1 mL iskallt 100% metanol till cellerna. Tilt 6-väl plattan och Pipettera metanol mot sidovägg i stället för direkt på täckglaset. Sedan luta 6-väl plattan tillbaka till horisontellt så att metanol att jämnt tvätta över cellerna. Fix för 5 min vid-20 ° C.
- Aspirera fixativ och skölj cellerna 3 gånger med PBS.
- Tvätta klibbade cellerna med PBS, 5 gånger för 5 min varje på en rotator.
6. Blockera icke-specifik bindning
- Block för 1 h i rumstemperatur i blockerande lösningen (se Tabell för material).
Obs: Olika lösningar kan användas för att blockera icke-specifik antikropp bindande inklusive 3% bovint serumalbumin (BSA) eller icke-immun serum från samma art som den primära antikroppen.
7. Identifiering
- primär antikropp inkubation
- aspirera blockerande lösningen. Inte tvätta eller skölj.
- Bereda primär antikropp-lösning enligt följande (se steg 7.1.5): Späd den primär antikroppen till en koncentration på 10 µg/mL (eller tillverkaren ' s föreslog koncentration) i antikropp inkubation lösningen (se tabellen av material ). Balansera detta liten volym på täckglaset och noggrant ligger ett torg av plast paraffin filma på toppen. Detta hjälper till att sprida den lilla volymen av antikropp över täckglaset och skyddar mot avdunstning.
- Placera 6-väl plattan i en fuktkammare och inkubera över natten i kylskåpet.
- På morgonen, ta bort celler från luftfuktighet kammaren, försiktigt bort paraffin filma fyrkantig från ytan av täckglaset och aspirera primär antikropp lösningen.
- Skölj 3 gånger med PBS, tvätta sedan 5 gånger i 5 min med tvättlösningen block (se Tabell för material) på rotatorn.
Obs: Detta protokoll använder följande antikroppar, anti-RFP mus monoklonal antikropp för bilder visas i figur 2 och kanin polyklonala FP1 7 anti-Ca V 1.2 antikropp (en gåva från Prof. Johannes Hell, UC Davis) för bilder som visas i figur 3. När det gäller luftfuktighet kammaren fodrad en plast lunchlåda med tättslutande lock, med våta pappershanddukar verk. PBS kan användas för att tvätta steg, men detta protokoll förbättrar märkning specificitet och minskar bakgrund med en utspädd blockerande lösning för tvätt steg.
- Sekundär antikropp inkubation
- aspirera tvättlösningen och tillsätt 200 µL konjugerat sekundär antikropp lösning utspädd 1:1,000 i antikropp inkubation lösning. Placera en kvadrat med paraffin film ovanpå täckglaset (se punkt 7.1.2).
- Inkubera i 1 h i rumstemperatur i mörkret.
- Aspirera sekundär antikropp och skölj 3 gånger med PBS.
- Tvätta cellerna med utspädd blockerande lösning 5 gånger i 5 min på vippan.
- Tvätta 3 gånger för 5 min med PBS.
Obs: Det här protokollet beskriver användningen av antimus Alexa 647 konjugerad sekundär antikropp och anti-kanin Alexa 647 konjugerad sekundär antikropp för figur 2 och figur 3, respektive. För enda protein märkning, Alexa 647 är rekommenderad fluorophore på grund av dess höga fotonen räkna (förbättrar lokalisering precision) och låg intermittens (förbättrar temporal upplösning) 8. Det finns många andra fluorophore-konjugerad sekundär antikropp alternativ, såsom Atto eller Cy-färgämnen. Hänvisa till Dempsey o.a. 8 och Chozinski o.a. 9 för omfattande utvärderingar av lämpligheten hos flera fluorophores/färgämnen för super-upplösning imaging.
8. Efter fixering (valfritt steg)
- späd 50 µL 50% GA i 10 mL PBS att erhålla en 0,25% GA lösning. Efter fixa celler i 10 min i denna lösning vid rumstemperatur.
- Tvätta med PBS 3 gånger för 5 min på en rotator.
9. Lagring av prover
- lagra prover i kylskåp (4 ° C) i en aluminiumfolie fodrade behållare ljuskänsligt tills imaging.
- Lagra i PBS 3 mM natriumazid att förhindra bakterietillväxt för långsiktig lagring av prover (upp till flera månader),.
10. GSD super resolution Imaging Photoswitching buffert förberedelse
- förbereda den syre-sophantering ' GLOX ' lösning enligt följande:
- i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, lägga till 12,5 µL katalas (lager 34 mg/mL), 3,5 mg glukosoxidas och 0,5 µl 1 M Tris (pH = 8) till 49,5 µL PBS.
- Vortex kort att upplösa komponenter i lösningen sedan Centrifugera vid 20,800 x g under 3 minuter vid 4 ° C.
Obs: syre-sophantering lösningar såsom GLOX, har hittats motsätta sig fotoblekning. GLOX bör förvaras i kylskåp i upp till en vecka. Upprepa varje gång det används detta centrifug.
- Förbereda den photoswitching-inducerande thiol lösning enligt följande:
- Bered 100 mM β-mercaptoethylamine (MEA) i PBS och ändra pH-värdet till pH 8 eller alternativt använda β-merkaptoetanol (βME). Förvara aliquoted MEA lösning i frysen (-20 ° C) i upp till 1 vecka.
- Omedelbart före imaging, förbereda sista växlingen bufferten på is genom att lägga till tiol och syre-sophantering komponenter tillsammans. För 500 µL GLOX-MEA, tillsätt 5 µL GLOX till 50 µL MEA (pH = 8) och 445 µL saltlösning buffert (2,5 mL 1 M Tris pH = 8, 29.22 mg NaCl (10 mM slutlig koncentration), 5 g glukos och 47,5 mL vatten). Alternativt för GLOX-βME lösning Tillsätt 5 µL GLOX 5 µL βME och 490 µL saltlösning buffert.
- Hålla lösningarna på isen och använda som behövs för att montera prover på depression glasskivor.
Obs: Thiol innehållande lösningar såsom βME eller MEA inducera photoswitching cyanin-baserade färgämnen som Alexa 647 10 eller xanthene-baserade färgämnen som Alexa 568. ΒME ger bättre resultat med Alexa 647 MEA är rekommenderad för Alexa 568 eller när 2 proteiner ska avbildas med en dubbel märkning strategi utnyttjar både Alexa 568 och 647. Bufferten kommer att försämras under ett antal timmar på grund av försurning. Detta kommer att leda till en minskning av den genomsnittliga fotonen räkningen av provet. För att förhindra detta, är det lämpligt att göra färska photoswitching buffert efter 2-3 h eller om antingen en droppe i den genomsnittliga fotonen räkningen eller en betydande förlängning av tid vid inducerad photoswitching observeras. En artikel nyligen beskrivs en ny tänkbar buffert Ox-EA som vi ännu inte har testat men enligt uppgift utställningar stabilt pH nivåer för flera dagar och presterar bättre än GLOX för flerfärgade tänkbar program 11.
- Hålla lösningarna på isen och använda som behövs för att montera prover på depression glasskivor.
11. Montering prover
- Mount coverslips med märkta celler (avsnitt 1-9) på depression glider, använder 100 µL imaging buffert.
- Försegla kanterna av täckglaset med en silikon lim för att förhindra snabb oxidation av imaging bufferten. Vänta några minuter tills silikon limmet har härdat annars täckglaset kommer att glida när imaging.
Obs: Silikon lim inte förhärdar om det kommer i kontakt med βME. Se till att torka kanterna på täckglaset förhindrar att silikon lim att kontakta imaging bufferten.
12. Bild förvärv
- se tabell1 för en förteckning över imaging parametrar som används i figur 2 och figur 3.
- Att börja, Välj lämplig laser för att belysa provet beroende på fluorophore valt. Det SR-GSD-system som används i detta protokoll är utrustad med högeffektiva lasrar (488 nm, 1,4 KW/cm 2; 532 nm, 2,1 KW/cm 2; 561 nm, 2,1 KW/cm 2 642 nm, 2,1 KW/cm 2). figur 2 används 642 nm laser.
- Använda en Oljeimmer objektiv med en hög NA. Det SR-GSD-system som används här är utrustad med en HC PL APO 160 X / 1,43 NA mål.
- Valde lämpligt dichroic imaging kuben. SR-GSD systemet i detta protokoll är utrustat med 488 HP-T, 532 HP-T, 568 hk-T, 642 HP-T med utsläpp band-passera filter 505-605 nm, 550-650 nm och 660-760 nm.
- Välj 2D förvärv. Ställ in kameran till ram-överföring läge och exponering tid till 10 ms (100 Hz). Ställa in förstärkning av EM till 300. Välj den påvisbara gränsen.
Obs: Låga trösklar producera bilder med hög bakgrund. Höga trösklar kan filtrera ut signalen av intresse. Bestämma tröskelvärdet baserat på negativa kontroller såsom imaging coverslips av icke-transfekterade celler eller celler som inkuberas med sekundär antikropp endast. - Aktivera auto händelse kontroll och ange händelser per bilder till 8.
- Ange pixelstorlek i fliken GSD-förvärv (börja med 10 nm eller 20 nm pixelstorlek). Se till att " Histogram läge " är markerat på fliken GSD verktyg under de högupplösta bilden Beräkningsalternativ före bild förvärvandet.
- Bild proteiner vid plasmamembranet, Välj läget för Frida och ändra incidensen vinkeln för att avgöra genomträngningsdjupet.
- Att skicka elektroner till mörka staten (kallas pumpa), Ställ laser intensitet till 100%.
- Välj enda molekyl upptäckt medan pumpning och ange för att förvärva automatiskt när ram korrelationen är 0,20.
- För förvärv, inställd laser intensitet på 50%.
- Ange antalet förvärv ramar till 60,000.
Obs: Utredaren kan finna att ett prov kräver mer eller mindre ramar än detta. Ändra antalet ram baserat på observationer av fluorophore fotoblekning och stop förvärv när inga ytterligare händelser detekteras. - Start förvärv.
Obs: I början av förvärvet, alla dye molekyler är i tillståndet fluorescerande och växla sedan till mörka staten. När ram korrelationen når 0,20, kommer att bilder börja förvärvas. När mindre än 8 händelser upptäcks per bildruta, kommer 405 lasern aktivera, uppmuntra fluorophores att övergången från mörka staten till grundtillståndet. När bilder för en datamängd av n = x celler från n = y djur, parametrar såsom Frida genomträngningsdjupet påvisbara gränsen och antalet bildrutor förvärvade bör hållas konstant.
13. Bildanalys
- för att kvantifiera protein klusterstorleken, Använd den ' analysera partiklar ' funktion i ImageJ.
Obs: Ytterligare analys kan utföras med stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi-baserade relativa lokalisering analys (STORM-RLA) eller liknande 13.- Utföra klusteranalys ( figur 3) använder ImageJ enligt följande:
- öppna bildfilen som ska analyseras. Detta bör vara en 10 nm histogram enda molekyl lokalisering karta som genereras i avbildningsprogrammet beskrivet ovan (avsnitt 12).
- Justera ljusstyrka och kontrast att visualisera bilden: Klicka på bild-menyn, Välj justera, sedan ljusstyrka och kontrast. Klicka på alternativet auto.
- Ändra bildtyp till 8-bitars: Välj bild-menyn Välj typ och välj 8-bitars.
- Ange skalan på bilden: öppna menyn analysera, klicka på Ange skala och ange följande parametrar: avstånd = 1, känt avstånd = 10, 1 pixel = 10 nm.
- Välj mätningarna ska erhållas genom öppna menyn analysera, Välj Ange mått och markera rutan bredvid alternativet område.
- Justera tröskeln på bilden. Öppna bild-menyn Välj justera och välj sedan tröskel, Välj över/under. Flytta det högsta värdet till 255 och flytta det lägsta värdet till 1 och klicka på tillämpa.
- Att analysera partiklarna, öppna menyn analysera, Välj analysera partiklar. Markera för att markera bildpunktsenheter, Visa resultat och sammanfatta. Ange storlek för 4-infinity (eftersom upplösningen är ~ 20 nm), Välj alternativet bare konturer och klicka på ok. En summary fil kommer att skapas som innehåller analys detaljer såsom genomsnittliga klustret storlek och antalet kluster i bilden.
Obs: Försiktighet bör iakttas när att göra slutsatser om antalet proteiner inom ett visst kluster, som antalet lokaliserade punkter inte är linjärt korrelerade med antal proteiner. GSD lokaliserar färgämnen som konjugeras till antikroppar, vilket resulterar i en koppling-fel som förflyttar den fluorescerande etiketten från epitop av > 10 nm i någon riktning. Dessutom om polyklonala antikroppar används mer än en antikropp kan binda till ett enda antigen och blanda ihop den fråga ytterligare, kommersiella sekundärt antikroppar är konjugerat med, i genomsnitt 3-6 molekyler av färgämne så en fluorophore inte är alltid lika ett protein. Koppling-fel kan reduceras genom konjugera ett färgämne direkt till den primär antikropp (eliminera sekundärt) eller använda en nanobody-baserad märkning system 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som dokumenterats i inledningen, finns det många olika super-resolution mikroskopi imaging modaliteter. Detta protokoll, fokuserar på GSD super-upplösning imaging. Representativa bilder och lokalisering kartor visas i figur 2 och figur 3.
Figur 2 visar en COS-7 cell transfekterade med ER protein, mCherry-Sec61β, och bearbetade med metoden som beskrivs ovan. Figur 2A -2B tillåter jämförelse av bilder av ER tagit med super-upplösning Mikroskop i Frida läge (A) och använder GSD förvärv läge (B). Bilderna visar en förbättring i den axiella upplösningen när förvärvade i GSD-läge. Detta framgår ytterligare i den medföljande handling profil, som kan genereras med hjälp av ImageJ, som visar skillnaden i fördelningen av normaliserade intensitet kurvorna på områden av intresse (gula linjen). Dessa kurvor representerar diametern på de ER tubuli som verkar vara mycket smalare när den undersöks i GSD-läge. GSD mikroskopi har en lateral lokalisering precision av ca 20 nm och thus föreställer ungefärligt en tiofaldig ökning av upplösning bortom diffraktionsgränsen. Denna förbättring i resolution resulterar i en mer korrekt bild av strukturen på de ER tubuli.
Förbättringen i resolution som erbjuds av super-upplösning GSD imaging ytterligare visas i figur 3visar en märkt hjärt myocyt med en anti-Cav1.2 antikropp, behandlas enligt ovan. Bilden i figur 3A togs med GSD super-upplösning Mikroskop i Frida miljö. Kluster av CaV1.2 kanaler kan ses att organisera längs t-tubuli nätverket. Figur 3B visar samma cell, men denna bild förvärvades använder GSD-läge. Förbättringen av den axiella resolutionen är mer framträdande i panelerna som fokuserar på enstaka kluster av kanaler (figur 3B), när en jämförelse görs mellan samma ROI avbildas med Frida och GSD, separata kluster av kanaler är lättare att identifiera som ett resultat av förbättringen i resolution som erbjuds av GSD imaging. Dessa paneler också jämföra skillnaden i den påvisbara gränsen definieras som antalet fotoner per pixel. Denna parameter måste vara valt noga och anpassade till kraven i experimentet. Panelen 3D visar kluster konturer när GSD bilden bearbetades med hjälp av ImageJ programvara, från detta området kluster för varje enskilt kluster i bilden kan bestämmas (se not 13.1.8 ovan och avsnittet diskussion för viktiga överväganden När du utför sådana en kvantifiering). Denna information kan sedan användas för att generera frekvens histogrammet på panelen 3 C. Denna analys kan användas för att undersöka förändringar i klusterstorlek eller antalet kluster mellan prover under kontroll jämfört med testa villkorar (e.g., WT vs mutant kanaler eller obehandlad vs drog-behandlade celler). Använder de metoder som beskrivs i detta protokoll tillsammans med kompletterande stegvis fotoblekning experiment, utredare har fastställt att CaV1.2 kanaler distribueras i kluster av, i genomsnitt, 8 kanaler i hjärt myocyter15 .
Figur 1: Schematisk bild av tidslinjen händelser för super-upplösning imaging av membranproteiner. Dag 0 refererar till den första dagen av behandling för antikropp märkning. Avsnittet protokollet refererar till avsnittet i protokollet där detaljerade uppgifter finns på varje steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: super-resolution mikroskopi erbjuder förbättrad signal till brus och ökad rumslig upplösning. (A) vänster COS-7 celler uttrycker mCherry-Sec61β, fasta och märkt som beskrivs i protokollet och avbildas med hjälp av konventionella Frida mikroskopi. Höger, övre panelen: enda ER tubuli. Höger, nedre panelen: Rita profil tas tvärs över den ER tubuli (gula linjen). (B) samma cell som (A) utom lokaliseringen karta genererades med GSD super-upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Super-upplösning imaging Cav1.2 kanaler i hjärt myocyter. (A) Frida fotavtryck från en isolerad hjärt myocyt, fast, och färgas med anti-CaV1.2 antikropp (FP1). (B) vänster: super-upplösning Frida fotavtryck från den samma hjärt myocyt som i (A). Höger: förstorade delar av lokalisering karta som har utsatts för olika upptäckt tröskelvärden. Observera att som en ökar den påvisbara gränsen, minska storleken CaV1.2 kanal kluster. (C) frekvens histogram över klusterstorlekar erhållits från lokalisering karta i (B). (D) vänster: konturerna av certifikatutfärdarenV1.2 kluster från (B). Höger: utvidgade delar av bilden har utsatts för olika upptäckt tröskelvärden. Obs, liknar (B), eftersom den påvisbara gränsen ökar, den areal som upptas av de CaV1.2 kanal kluster minskningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fluorophore används | Alexa-647 |
| Laser | 642 nm |
| Utsläpp filter | 623 HP-T |
| Lins | 160 X 1,43 NA |
| Exponeringstid | 10 ms |
| Påvisbara gränsen | 65 |
| Incidensen vinkel (genomträngningsdjupet) | 65.04° (150 nm) |
| EM-vinst | 300 |
| #frames förvärvade | 30 000 – 60 000 |
| Laser intensitet för pumpning | 100% |
Tabell 1: Lista över imaging parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den senaste tidens explosionen av teknik som tillåter imaging bortom diffraktionsgränsen erbjudit nya windows in komplexiteten i däggdjursceller signalering i tid och rum. Dessa tekniker inkluderar STORM, STED, PALM, GSD, SIM och deras varianter (t.ex., dSTORM, FPALM). Påhittighet av forskarna bakom dessa tekniker har tillåtit oss att kringgå de begränsningar av naturlagarna styr diffractionen av ljus. Trots denna enorma prestation, var och en av dessa tekniker gör någon form av kompromiss att uppnå super-upplösning och, som sådan, har sina begränsningar. Den ideala situationen som cellbiologer och biophysicists eftersträvar är optimal känslighet, hög upplösning och snabb förvärv, med ingen fotoblekning. Dessutom bör en förbli medveten att genom att ta bort celler från djur, vi inneboende ändra dem och eventuellt ändra molekyldynamik. Därför strävan att utveckla en super resolution-teknik som tillåter dynamisk, live cell, enda molekyl imaging i en levande djur går på. För nu har vi verktyg till vårt förfogande som kan generera bilder med 10-faldig förbättringar på diffraktion begränsad upplösning. I den här artikeln diskuterar vi provberedning, bild förvärv och analys för GSD som möjliggör resolutioner ner till 20 och 50 nm i de laterala och axiella dimensionerna, respektive.
Även om fokus i detta protokoll finns på Sec61β och CaV1,2 L-typ Ca2 + kanaler, kan det protokoll som beskrivs ovan fungera som en mall för forskare som önskar bild olika proteiner i sina egna övningar på GSD Mikroskop. De positiva attributen av denna typ av protokollet är att det är relativt enkelt, kan vara modifierade och tillämpas på ett antal olika celltyper, och kan enkelt anpassas till flerfärgade imaging. De uppenbara begränsningarna är det super-upplösning system, utrustad med en känslig EM-CCD kamera skicklig av singel-molekyl upptäckt, tenderar fortfarande att vara oöverkomligt dyrt för många laboratorier.
När antalet laboratorier som använder super-resolution mikroskopi som sin föredragna bildteknik växer, behövs mer enhetlig förståelse och avtalet om bild förvärvandet, bearbetning och tolkning. Hur, till exempel en kvantifiera nivån på närheten av två proteiner som visas colocalized i en diffraktion begränsad pixel men genomsyra för att faktiskt visa lite överlappning alls i en super-upplösning bild/karta? Detta scenario har faktiskt redan uppstått för flera tidigare antagit colocalized proteiner, såsom vidhäftning komplexa proteiner paxillin och zyxin. Som resolutionen att Mikroskop alltid uppnå ökar, kommer kanske proteiner inte längre att rapporteras till 'colocalize' utan snarare för att ha icke-slumpmässigt fördelade mönster av program-lokalisering runt varandra. Det är ju omöjligt för två proteiner att fysiskt ockupera exakt den samma 3-dimensionell rymden. Lösningar på denna analys gåta börjar dyka upp i litteraturen, inklusive stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi-baserade relativa lokalisering analys (STORM-RLA), som enligt uppgift kan kvantifiera frekvens och grad av överlappning mellan två co märkt proteiner och även ge kvantitativa mätningar av avståndet mellan icke-överlappande proteiner13. När man jämför en kanal till en annan i super-upplösning, är det naturligtvis viktigt för att du har rätt registret mellan de två kanalerna. Detta kan utvärderas med hjälp av flerfärgade microsphere fluorescerande pärlor och imaging i varje enskild kanal sedan lägga över bilderna. Dessutom, eftersom det SR-GSD 3D mikroskopet kan också fungera som Frida Mikroskop och generera super-resolution lokalisering kartor i Frida, är det viktigt att matcha genomträngningsdjupet mellan två-färg kanaler, som Frida vinklar förändring beroende på den våglängd av ljus som används för att excitera provet.
Ytterligare, som skildras i figur 3B och figur 3D, kan en lokalisering karta visas väldigt olika beroende på graden av 'tröskelvärde'. Om den påvisbara gränsen är inställd för lågt, verkar strukturer vara större än de verkligen är som sannolikheten att en innehåller falska icke-specifik märkning av 'brus' ökar. Omvänt, om den påvisbara gränsen är alltför hög, sedan strukturer kan verka mindre än de verkligen är som 'verkliga' händelser är undantagna. Tröskelvärde bör således tillämpas med förnuft och försiktighet. Så hur kan en rimlig upptäckt tröskel för ett givet prov bestämmas? Kontroller är nyckeln. Som med alla immuno-märkning tillvägagångssätt, bör positiva och negativa kontroller utföras för att påvisa antikroppar specificitet. Med lämpliga kontroller är det möjligt att härleda en upptäckt tröskel över vilken endast särskilda märkning bör observeras. Lämpliga kontroller inkluderar prover där primär antikropp ruvning har utelämnats så ett prov utsätts endast för sekundär antikropp kan observeras. Från sådan kontroll, kan icke-specifik bindning av en sekundär antikropp urskiljas. I ett väl förberett prov, bör detta leda till en mycket mindre händelseantal per bild och ett lägre Genomsnittligt antal fotoner per pixel jämfört med primär och sekundär ruvade provet. Den påvisbara gränsen av bilden kan sedan ställas in så att icke-specifik märkning kan elimineras. Samma upptäckt tröskelvärde bör sedan användas när imaging primära och sekundära ruvade provet att öka förtroende att 'brus' elimineras. Ytterligare kontroller omfattar testning primära antikroppens specificitet. I transfekterade celler, om märkta proteinet inte uttrycks inbyggt i cell linje, är då ett enkelt test av primär antikropp specificitet att utföra märkning proceduren på untransfected celler. För att demonstrera primär antikropp specificitet i primära celler, är en genetisk knockout av märkta proteinet guldmyntfoten. Identifiering av tröskelvärden kan även ställas in med dessa primär antikropp kontroll experiment. I avsaknad av antigen som mål är någon fluorescens utsläpp ospecifika. Med sekundär endast kontroller, med en bra primär antikropp, mindre händelser per bild bör observeras och därför över samma antal ramar, en lägre Genomsnittligt antal fotoner per pixel bör vara uppenbart. Den påvisbara gränsen kan således fastställas till en nivå som kommer att eliminera icke-specifik bakgrund färgning på grund av off-target primär antikropp bindande. För fullständig öppenhet föreslås det att författarna bör presentera bilderna deras tröskelvärde parametrar anges tydligt och kanske med en länk till raw-data i en online depositarie.
Utredaren måste också förbli medveten att flera sekundära antikroppar kan binda till en enda primär antikropp så förhållandet 1:1 primär: sekundär bindning inte bör utgå. Dessutom noteras kommersiella sekundära antikroppar är ofta konjugerat med flera fluorophores, till exempel de sekundära antikroppar som anställd i detta protokoll av tillverkaren att vara konjugerat med 2-8 fluorophores. Som en work-around till detta, kan en fluorophore vara direkt konjugerat till en primär antikropp. Spektrofotometri kan sedan användas för att bestämma det genomsnittliga antalet fluorophores per primär antikropp. Flera kommersiellt tillgängliga kit finns att utföra proceduren konjugation. Men även om en 1:1 stökiometri uppnås, kan fluorophore molekylen själv skapa ytterligare overcounting problem på grund av den blinkande och reversibel koppling av fluorophores. I praktiken innebär detta att en fluorophore får cykla flera gånger mellan marken och exciterat tillstånd avger kluster av fotoner som det gör så. Dessa fotoner kan upptäckas i flera intilliggande pixlar och leda till överskattning av klusterstorleken. Andra utredare har tagit upp denna fråga genom att välja att kombinera fluorescerande utsläpp klustrade under kortare perioder i tid och rum16,17. Detta är en något empiriskt synsätt som fortfarande inte eliminerar möjligheten att samma fluorophore kunde cykeln tillbaka till det mörka tillståndet för en längre period, då omvänd till statusen cykling/avger en gång till och bedömas som en andra molekyl. Antalet molekyler i ett kluster inte kan därför beräknas baserat enbart på klusterstorleken. För tillfället finns ingen perfekt lösning på dessa problem och, därför, användningen av super-upplösning imaging i samband med en annan teknik som stegvis fotoblekning kan ge en ungefärlig uppskattning av antalet molekyler per kluster. Relevanta kontroller att öka förtroendet för klustret område mätningar inkluderar jämför klustret storlekar av kända monomer proteiner (t.ex., CD86) och kända dimeriskt proteiner (t.ex., CTLA-4) till de av proteinet av intresse som föreslagits av Fricke o.a. 18.
I sammandrag, i denna artikel, är en okomplicerad immunolabeling-protokollet installerat som vidare beskriver utarbetandet av fasta prover för super-upplösning imaging. Dessutom diskuteras några vanliga fallgropar i bild förvärv och analys. Som super-upplösning imaging blir vanligare, kan det bli nödvändigt för journaler att anges en ny uppsättning riktlinjer för att avvärja olämpligt manipulation av dessa komplexa bilder/lokalisering kartor. Super-resolution mikroskopi har lagt ett kraftfulla nya verktyg i verktygslådan av cellbiologer och biophysicists och har redan gjort en extraordinär inverkan på vår förståelse av cellulära arkitektur och molekylär organisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från AHA till R.E.D. (15SDG25560035). Författarna vill erkänna Dr Fernando Santana för användning av hans Leica SR GSD 3D Mikroskop och Dr Johannes Hell för vänligt att ge FP1 antikroppen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
