Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.
Abstract
Fortschritte in der Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellbiologie korrelieren eng mit der verstärkten Fähigkeit zu visualisieren, zelluläre Ereignisse führt häufig zu dramatischen Sprünge in unserem Verständnis, wie Zellen funktionieren. Die Entwicklung und Verfügbarkeit der Höchstauflösung Mikroskopie wurde erheblich erweitert die Grenzen der optischen Auflösung von ~ 250-20 nm. Biologen sind nicht mehr nur auf die Beschreibung der molekularer Interaktionen in Bezug auf NS1 innerhalb eines Bereichs von Beugung begrenzt, sondern es ist nun möglich, die dynamischen Wechselwirkungen einzelner Moleküle zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie für feste Zelle Bildgebung. Wir bieten Beispiele aus zwei verschiedenen Membranproteinen, Bestandteil des endoplasmatischen Retikulum Translocon, sec61β undeiner Plasmamembran lokalisiert Voltage-gated Typ L Ca 2 + -Kanäle (CaV1.2). Diskutiert werden spezifische Mikroskop Parameter, Fixierung Methoden, Foto-Umschaltung Puffer Formulierung und Fallstricke und Herausforderungen der digitalen Bildverarbeitung.
Introduction
Zelluläre Reaktionen Signalisierung übersetzen wechselnde interne und externe Umgebungen um eine zelluläre Reaktion zu initiieren. Sie regelt alle Aspekte der menschlichen Physiologie, dienen als Grundlage für Hormon und Neurotransmitter-Freisetzung, der Herzschlag, Vision, Düngung und kognitive Funktion. Störung der diese Signalisierung Kaskaden kann gravierende Folgen in Form von pathophysiologischen Bedingungen wie Krebs, Parkinson und Alzheimer-Krankheit haben. Jahrzehntelang haben biologischer und medizinischer Forscher erfolgreich fluoreszierende Proteine, Sonden und Biosensoren gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie als die wichtigsten Tools verwendet, um die genaue räumliche und zeitliche Organisation dieser zelluläre verstehen Signale.
Die Stärken des optischen Techniken wie Epifluoreszenz, konfokale, oder Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) sind ihre Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Kompatibilität mit live Cell imaging, während die große Einschränkung ist ihre Beugung begrenzte Auflösung, Bedeutung Strukturen oder Proteinkomplexe, die kleiner als 200-250 nm können nicht aufgelöst werden. Mit der theoretischen und praktischen Entwicklung von deterministischen Höchstauflösung (z.B.stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED-1), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM2) oder stochastische Höchstauflösung (z.B. , photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM3) oder Grundzustand Erschöpfung (GSD4,5)), laterale und axiale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie erweitert darüber hinaus die Beugung Barriere zu Gunsten von Dutzende von Nanometern. So haben Ermittler nun die unvergleichliche Fähigkeit zu visualisieren und zu verstehen, wie Proteindynamik und Organisation Funktion auf in der Nähe von molekularer Ebene übersetzt.
Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie gefolgt von einzelnen Molekül zurück (GSDIM) oder einfach GSD umgeht wie es bekannt ist, die Beugungsgrenze durch Reduzierung der Anzahl der gleichzeitig emittierende Fluorophore4,5. Hochenergie-Laser-Licht wird zur begeistern der Fluorophore beschriftet Probe, bombardieren Elektronen mit Photonen und erhöhen die Wahrscheinlichkeit sie unterziehen einen "Spin-Flip" und geben Sie die Triole oder "Dark-Staat" aus dem angeregten Zustand4. Dies verbraucht effektiv den Grundzustand, daher der Name "Boden stand Erschöpfung". Im Triplett-Zustand Fluorophore emittieren keine Photonen und die Probe erscheint dunkler. Jedoch diese Fluorophore stochastisch in den Grundzustand zurück und können durch mehrere Photonen emittieren aufgeregt Grundzustand Übergänge vor der Rückkehr in den Triplett-Zustand gehen. Mit weniger Fluorophore aussenden zu einem bestimmten Zeitpunkt, Photon platzt aus einzelnen Fluorophore werden räumlich und zeitlich voneinander benachbarte Fluorophore emittiert. Das Platzen der Photonen kann mit einer Gaußschen Funktion, fit sein, die Position der Fluorophor mit einer Genauigkeit der Lokalisierung der berechneten Schwerpunkt davon, die abhängig von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs, die Wellenlänge des Lichts verwendet entspricht für Erregung und entscheidend ist, die Anzahl der Photonen pro Fluorophor. Eine Einschränkung der GSD ist, dass da nur eine Teilmenge der Fluorophore aktiv jederzeit abgibt, Tausende von Bildern über mehrere Minuten zum Aufbau einer vollständigen Lokalisierung Karte gesammelt werden müssen. Die lange Erfassungszeit kombiniert mit der hohen Laser Leistungsbedarf bedeutet, dass GSD besser repariert anstatt live Proben geeignet ist.
Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung von festen Proben für die Höchstauflösung Mikroskopie Bildgebung der Membrane und das endoplasmatische Retikulum (ER)-resident Proteine (für eine Liste der notwendigen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien siehe Tabelle of Materials). Beispiele wie dieses Protokolls leicht angepasst, um die Größe und Grad der Cluster-Bildung von L-Typ Voltage-gated Ca2 + -Kanäle (CaV1.2) in das Sarkolemm von kardialen Myozyten zu quantifizieren, oder verwendet werden kann, die zelluläre Verteilung von der Notaufnahme zu visualisieren, werden demonstriert. Verständnis für die Verteilung und Organisation dieser zellulären Komponenten ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Einleitung, Übersetzung und letztlich die Funktion der vielen Ca2 +-abhängige Signalisierung Kaskaden. Zum Beispiel sind CaV1.2 Kanäle für Erregung-Kontraktion Kupplung, während Rezeptor-vermittelte Ca2 + Entlassung aus der ER vielleicht die allgegenwärtige Signalkaskade in Säugetierzellen ist grundlegend wichtig.
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Protocol
1. Waschen Glasdeckgläser
- am Vortag Probenverarbeitung, reinigen #1.5 Glasdeckgläser in einer 1 M Lösung von KOH 1 h beschallen. Dies entfernt alle fluoreszierenden Verunreinigungen, die auf den Deckgläsern vorhanden sein können.
- KOH von Deckgläsern mit deionisiertes Wasser gründlich zu spülen.
- Einmal in KOH gereinigt, speichern in 70 % igem Ethanol bis zum Gebrauch der Deckgläsern.
2. Beschichtung Glasdeckgläser
Hinweis: Schritte in diesem Abschnitt sollte durchgeführt werden, in eine Zelle Kultur Haube um Kontaminationen zu vermeiden.
- Zange verwenden, um die 70 % ige Ethanol-Lösung eine individuelle Deckglas entziehen und rasch Flamme um den Überschuss zu entfernen. Legen Sie die Deckgläsern in einer 6-Well-Platte. Flammen in einem Kultur-Abzug nicht möglich ist, sollten Autoklavieren die Deckgläsern nach dem Spülen mit deionisiertes Wasser und/oder Sterilisation unter dem UV-Licht in der Kultur-Haube für mindestens 30 Minuten
- Adhäsion der Zellen Beihilfen, Beschichten Deckgläsern mit sterilen 0,01 % Poly-L-Lysin für 1 h bei Raumtemperatur.
- Aspirieren der Poly-L-Lysin und spülen Sie die Deckgläsern mit sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). An der Luft trocknen und legen Sie über Nacht in den Kühlschrank stellen.
- Am nächsten Morgen die Deckgläsern aus dem Kühlschrank nehmen und fügen Sie 300 µL Laminin, bei einer Konzentration von 50 µg/mL, für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die Laminin direkt auf das Deckglas vorsichtig platziert ist.
Hinweis: Diese Laminin Schritt ist nicht erforderlich für COS-7 oder HEK293 Zellen aber erforderlich für isolierten ventrikulären Myozyten. Andere primäre Zellen wie z. B. vaskulären glatten Muskelzellen oder Nervenzellen einhalten können besser zu Kollagen oder Fibronektin beschichtet Deckgläsern.
3. Vorbereitung der Zellen
- kultivierten Zellen
- wachsen COS-7 Zellen (oder bevorzugte Zelllinie) auf einen 10 cm Kulturschale in 10 mL Dulbecco ' s geändert Eagles Medium (DMEM) Kulturmedium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (PS) Lösung. Wachsen die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO 2.
- Wenn die Zellen erreichen 90 % Konfluenz, ernten sie aus 10 cm Teller durch Absaugen der DMEM Medien und Hinzufügen von 5 mL Trypsin-EGTA-Lösung 0,05 %. Sobald die Zellen beginnen sich zu runden und lösen, sofort neutralisieren Sie die Trypsin mit ergänzt DMEM.
- Verwendung einer 5 mL serologische Pipette auf die Zellen aus der Schale entfernen. Pipette das Medium gegen die Basis der Schale mehrmals um alle Zellen zu entfernen, die bleiben Anhänger und homogen zu verteilen, die Zellen in das Kulturmedium.
- Platte Zellen auf 35 mm-Kultur-Gerichte, 70 % Konfluenz zur Transfektion zu erreichen. Machen Sie das Volumen des Mediums in der Schale mit frischen DMEM/FBS/PS-Lösung bis zu 2 mL.
- Transfect COS-7 Zellen mit das gewünschte Plasmid DNA-Konstrukte (z. B. sec61β-mCherry-Plasmid), mit einer entsprechenden Transfection Reagens und laut Hersteller ' s Anweisungen.
Hinweis: Es kann dauern 24-48 h für das Protein zum Ausdruck zu bringen, je nach dem Plasmid und/oder die Transfection Reagens verwendet.
- Erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten
- erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten mit etablierten Langendorff Perfusion Methode 6 zu isolieren. Wieder aussetzen der daraus resultierenden Pellet der Myozyten im Medium 199 (M199) ergänzt mit 2,5 % FBS und 1 % PS.
4. Galvanischen Zellen
- COS-7 transfizierten Zellen
- Aspirieren 2 mL DMEM/FBS/PS-Lösung von 35 Millimeter-Teller und 1 mL Ca 2 +-freie PBS. Zurück die Schüssel in den Inkubator für 2 min. Ernte Zellen aus der Schale von ersten Absaugen der Ca 2 +-kostenlose PBS und dann hinzufügen 1 mL Trypsin-EGTA-Lösung 0,05 %.
- Sobald die Zellen beginnen sich zu runden und lösen, sofort neutralisieren die Trypsin mit 1 mL ergänzt DMEM. Pipette vorsichtig nach oben und unten mehrmals darauf die transfizierten Zellen gleichmäßig verteilt 2 mL Trypsin-EGTA-DMEM Aufhängung.
- Platte transfiziert COS-7 Zellen auf Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläsern in eine entsprechende Dichte, so dass Einzelzellen visualisiert werden, und füllen Sie die Schale Volumen bis zu 2 mL DMEM/FBS/PS (z. B. das Deckglas 90 µL Zellsuspension hinzufügen dann fügen Sie 1.910 µL ergänzt DMEM, wirbeln Teller um Zellen gleichmäßig verteilen).
Hinweis: Zellen müssen nicht gezählt werden, aber das Volumen der Zellen hinzugefügt werden, jedes Gericht ist die Konfluenz der Zellen abhängig. - Rückkehr vernickelt Zellen in der Zelle Kultur Inkubator über Nacht zu den Zellen zu halten und zu erholen.
- Aspirieren 2 mL DMEM/FBS/PS-Lösung von 35 Millimeter-Teller und 1 mL Ca 2 +-freie PBS. Zurück die Schüssel in den Inkubator für 2 min. Ernte Zellen aus der Schale von ersten Absaugen der Ca 2 +-kostenlose PBS und dann hinzufügen 1 mL Trypsin-EGTA-Lösung 0,05 %.
- Erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten
- Aspirieren Laminin und Platte Myozyten direkt auf der beschichteten Deckgläsern in eine entsprechende Dichte, so dass einzelne Zellen visualisiert werden können. Dies hängt von der Dichte der lebensfähigen Zellen aus der Isolation.
- Balance die Zellsuspension in einer Kuppel auf dem Deckglas und in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO 2 ~ 45 min erlauben Adhäsion.
5. Fixierung der Zellen
- Zellen aus dem Inkubator zu entfernen und vorsichtig Aspirieren Mediums.
- Spülen die adhärenten Zellen einmal mit PBS.
- Fix Zellen mit optimal an die individuelle Anwendung und Antikörper Fixiermittel.
Hinweis: Ein wichtiges Kriterium zu beachten bei der Auswahl ein Fixiermittel ist die Erhaltung der Zellstruktur der Probe, während auch sicherstellen, dass es keine Konformationsänderung in das Antigen von Interesse. Für die Zwecke dieses Protokolls Fixierung mit 3 % paraformaldehyde/0.1% Glutaraldehyd (PFA/GA) und Fixierung mit 100 % Methanol diskutiert.
- PFA/GA Fixierung von COS-7 transfizierten Zellen mit dem Ausdruck Sec61β-mCherry
- mischen 1,9 mL 16 % PFA und 20 µL 50 % GA und fügen Sie PBS zu einem Endvolumen von 10 mL.
- Add 1 mL frisch zubereitete PFA/GA Lösung für jedes Gericht von Zellen und Fix für 10 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren der PFA/GA und spülen Zellen 3 Mal mit PBS.
- Waschen die eingehalten Zellen mit PBS, 5 Mal für 5 Minuten. Führen Sie alle Waschschritte auf ein Rotator setzen auf eine moderate Geschwindigkeit (z. B. 50 Zyklen pro Minute).
- Als nächstes reduzieren die freien Aldehyd-Gruppen mit 1 mL frisch zubereitete 0,1 % Masse/Volumen Natriumborohydrid deionisiertes Wasser.
- Spülen Zellen zweimal dann waschen 3 Mal für 5 min in PBS, entfernen alle Spuren von Natriumborohydrid und der Alkohol, die es erzeugt, wenn sie mit freien Aldehyden reagiert.
- Methanol Fixierung der erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten
- sorgfältig fügen Sie 1 mL eiskaltes 100 % Methanol zu den Zellen. Kippen Sie die 6-Well-Platte und pipette das Methanol gegen die Seitenwand nicht direkt auf das Deckglas. Dann kippen Sie die 6-Well-Platte zurück zur horizontalen erlauben das Methanol, gleichmäßig zu waschen über die Zellen. Fix für 5 min bei-20 ° c
- Aspirieren Fixiermittel und spülen Zellen 3 Mal mit PBS.
- Waschen die eingehalten Zellen mit PBS, 5 Mal für 5 min auf ein Rotator.
6. Blockiert eine unspezifische Bindung
- Block für 1 h bei Raumtemperatur in der blockierenden Lösung (siehe die Tabelle der Werkstoffe).
Hinweis: Verschiedene Lösungen können verwendet werden, um unspezifische Antikörperbindung einschließlich 3 % Rinderserumalbumin (BSA) oder nicht-immunen Serum aus der gleichen Art wie die primären Antikörper blockieren.
7. Erkennung
- Primärantikörper Inkubation
- Aspirat die blockierende Lösung. Nicht waschen oder spülen.
- Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung wie folgt (siehe Schritt 7.1.5.): den primäre Antikörper zu einer Konzentration von 10 µg/mL zu verdünnen (oder Hersteller ' s vorgeschlagene Konzentration) in der Antikörperlösung Inkubation (Tabelle der Werkstoffe anzeigen ). Balancieren Sie dieses kleine Volumen auf dem Deckglas zu und legen Sie vorsichtig ein Quadrat aus Kunststoff Paraffin-Film an der Spitze. Dies hilft, das kleine Volumen der Antikörper auf das Deckglas verteilt und schützt vor Verdunstung.
- 6-Well-Platte in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie über Nacht in den Kühlschrank stellen.
- Am Morgen entfernen Sie die Zellen aus der feuchten Kammer, sorgfältig entfernen Sie den Paraffin-Film quadratisch von der Oberfläche des das Deckglas und aspirieren Primärantikörper Lösung.
- Spülen mit PBS, 3 mal 5 Mal für 5 min mit Waschlösung Block dann waschen (siehe Tabelle der Materialien) auf den Rotator.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet die folgenden Antikörper, Anti-RFP Maus monoklonale Antikörper für Bilder in Abbildung 2 dargestellt und Kaninchen polyklonale FP1 7 Anti-Ca V 1.2 Antikörper (ein Geschenk von Prof. Johannes Hell, UC Davis) für Bilder, die in Abbildung 3 dargestellt. In Bezug auf die feuchte Kammer eine Kunststoff Lunch-Box mit einem dicht schließenden Deckel, ausgekleidet mit feuchten Papiertüchern Werke. PBS darf für Waschschritte, aber dieses Protokoll verbessert die Kennzeichnung Spezifität und Hintergrund verringert mithilfe einer verdünnten blockierenden Lösung für Waschschritte.
- Sekundärantikörper Inkubation
- aspirieren Sie die Waschlösung und 200 µL konjugierten Sekundärantikörper Lösung verdünnt 1:1,000 in Inkubation Antikörperlösung hinzufügen. Legen Sie ein Quadrat von Paraffin-Film auf dem Deckglas (siehe Schritt 7.1.2).
- Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Sekundärantikörper Absaugen und Spülen mit PBS 3 x.
- Zellen mit verdünnten blockierende Lösung 5 Mal für 5 min auf die Wippe zu waschen.
- Wash 3 Mal für 5 min mit PBS.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Anti-Maus Alexa 647 konjugierten Sekundärantikörper und Anti-Kaninchen-Alexa 647 konjugierten Sekundärantikörper für Abbildung 2 und Abbildung 3, beziehungsweise. Für einzelne Protein Kennzeichnung, Alexa 647 ist die bevorzugte Fluorophor aufgrund seiner hohen Photon Graf (verbessert die Genauigkeit der Lokalisierung) und geringer Einschaltdauer (verbessert die Zeitauflösung) 8. Viele andere Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper Optionen, z. B. Atto oder Cy-Farbstoffe, zur Verfügung. Beziehen sich auf Dempsey Et al. 8 und Chozinski Et al. 9 für umfangreiche Auswertungen über die Eignung der verschiedenen Fluorophore/Farbstoffe für Super-Resolution Imaging.
8. Post-Fixierung (optionaler Schritt)
- verdünnen 50 µL 50 % GA in 10 mL PBS eine 0,25 % GA-Lösung zu erhalten. Post-Zellen für 10 Minuten in dieser Lösung bei Raumtemperatur zu beheben.
- Waschen mit PBS 3 Mal für 5 min auf ein Rotator.
9. Lagerung von Proben
- lagern Proben im Kühlschrank (4 ° C) in einem Aluminium-Folie ausgekleidet-Behälter bis Bildgebung vor Licht zu schützen.
- Für langfristige Lagerung von Proben (bis zu mehreren Monaten), speichern in PBS mit 3 mM Natriumazid, Bakterienwachstum zu verhindern.
10. GSD Super-Resolution Imaging Photoswitching Puffer Vorbereitung
- vorzubereiten, der Sauerstoff Aufräumvorgang ' GLOX ' Lösung wie folgt:
- In einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch hinzufügen 12,5 µL Katalase (Lager 34 mg/mL), 3,5 mg Glukose-Oxidase und 0,5 µl 1 M Tris (pH = 8) 49,5 µL PBS.
- Vortex kurz zu Komponenten in Lösung auflösen dann Zentrifugieren bei 20.800 x g für 3 min bei 4 ° c
Hinweis: Sauerstoff-Aufräumvorgang Lösungen wie GLOX, gegen Immunofluoreszenz gefunden. GLOX sollte bis zu einer Woche im Kühlschrank aufbewahrt werden. Wiederholen Sie die Zentrifuge Schritt jedesmal dient.
- Photoswitching-induzierende vorbereiten Thiol-Lösung wie folgt:
- 100 mM β-Mercaptoethylamine (MEA) Lösung mit PBS-Puffer vorbereiten und verändern den pH-Wert auf pH 8 oder alternativ Nutzung β-Mercaptoethanol (βME). Speichern regelmÄÑig MEA-Lösung in den Gefrierschrank (-20 ° C) für bis zu 1 Woche.
- Unmittelbar vor der Bildgebung, bereiten die endgültige Schaltungen Puffer auf Eis durch das Hinzufügen der Thiol und Sauerstoff-Aufräumvorgang Komponenten zusammen. Für 500 µL GLOX-MEA, 50 µL MEA 5 µL GLOX hinzufügen (pH = 8) und 445 µL saline Puffer (2,5 mL 1 M Tris pH = 8, 29,22 mg NaCl (10 mM Endkonzentration), 5 g Glucose und 47,5 mL Wasser). Alternativ für GLOX-βME-Lösung hinzufügen 5 µL GLOX 5 µL βME und Kochsalzlösung 490 µL Puffer.
- Die Lösungen auf dem Eis halten und verwenden Sie je nach Bedarf Proben auf Objektträgern Depression montieren.
Hinweis: Thiol enthaltende Lösungen wie βME oder MEA induzieren Photoswitching Cyanin-basierte Farbstoffe wie Alexa 647 10 oder Xanthene-basierte Farbstoffe wie Alexa 568. ΒME produziert bessere Ergebnisse mit Alexa 647 während MEA wird bevorzugt für Alexa 568 oder als 2-Proteine mit einem doppelten Kennzeichnung Ansatz unter Verwendung Alexa 568 und 647 abgebildet werden sollen. Der Puffer wird über einen Zeitraum von Stunden durch Versauerung verschlechtern. Dies führt zu einem Rückgang der Anzahl der durchschnittlichen Photon der Probe. Um dies zu verhindern, empfiehlt es sich, frisch Photoswitching Puffer nach 2-3 h oder wenn, entweder einen Rückgang der Anzahl der durchschnittlichen Photon oder eine bemerkenswerte Verlängerung der Verarbeitungszeit für induzierte Photoswitching festgestellt wird zu machen. Ein kürzlich erschienener Artikel beschrieben einen neuen bildgebenden Puffer Ox-EA die wir noch nicht getestet haben, aber angeblich Exponate stabilen pH für mehrere Tage Niveaus und besseren Ergebnissen als GLOX für Multi-Color imaging Anwendungen 11 führt.
- Die Lösungen auf dem Eis halten und verwenden Sie je nach Bedarf Proben auf Objektträgern Depression montieren.
11. Montage der Proben
- Mount Deckgläsern mit beschrifteten Zellen (siehe Abschnitte 1-9) auf die Depression Rutschen, mit 100 µL bildgebenden Puffer.
- Seal die Ränder der Deckglas mit einem Silikonkleber, schnelle Oxidation des Puffers Bildgebung zu verhindern. Warten Sie einige Minuten, bis der Silikonkleber das Deckglas sonst voll ausgehärtet ist driftet beim abbilden.
Hinweis: Silikonkleber härtet nicht, kommt es in Kontakt mit βME. Achten Sie darauf, die Ränder der Deckglas zu verhindern, dass der Silikonkleber Kontaktaufnahme mit den bildgebenden Puffer trocknen.
12. Bild Erwerb
- Siehe Tabelle1 für eine Liste von imaging-Parameter in Abbildung 2 und Abbildung 3.
- Zu beginnen, wählen die geeigneten Laser zur Beleuchtung der Probe abhängig von der Fluorophor ausgewählt. In diesem Protokoll verwendeten SR GSD-System ist ausgestattet mit High-Power-Laser (488 nm, 1,4 KW/cm 2; 532 nm, 2,1 KW/cm 2; 561 nm, 2,1 KW/cm 2 642 nm, 2,1 KW/cm 2). Abbildung 2 verwendet die 642 nm Laser.
- Verwenden eine Öl-Immersion-Objektiv mit einer hohen Na Die hier verwendeten SR GSD-System verfügt über eine HC PL APO 160 X / 1,43 NA Ziel.
- Wählen Sie den entsprechenden dichroitischen bildgebenden Cube. Das SR-GSD-System in diesem Protokoll ist ausgestattet mit 488 HP-T, 532 HP-T, 568 PS-T 642 HP-T mit Emission Bandpass-Filter von 505-605 nm, 550-650 nm und 660-760 nm.
- Wählen Sie die 2D Akquisitionsmodus. Stellen Sie die Kamera auf Frame-Transfer-Modus und Belichtung Zeit auf 10 ms (100 Hz). Legen Sie den EM-Gewinn auf 300. Wählen Sie die Nachweisgrenze.
Hinweis: Niedrige Schwellen erzeugen Bilder mit hoher Hintergrund. Das Signal von Interesse können hohe Schwellen herausfiltern. Bestimmen Sie den Grenzwert basierend auf negative Kontrollen wie imaging Deckgläsern nicht transfizierten Zellen oder Zellen mit nur Sekundärantikörper inkubiert. - Schalten Sie Auto Ereignissteuerung und festgelegte Ereignisse pro Bilder auf 8.
- Geben Sie die Pixelgröße in der Registerkarte "GSD-Übernahme" (beginnen Sie mit 10 nm oder 20 nm Pixelgröße). Stellen Sie sicher, dass " Histogramm-Modus " wird in der GSD Registerkarte "Extras" unter das hochauflösende Bild Berechnungsoptionen vor Bildaufnahme ausgewählt.
- Bild-Proteine an der Plasmamembran, wählen den TIRF-Modus und ändern den Einfallswinkel um die Eindringtiefe zu bestimmen.
- , Elektronen an den dunklen Zustand (so genannte Pumpen) senden, Laserintensität auf 100 % eingestellt.
- Wählen Sie Einzelmolekül-Erkennung beim Pumpen und stellen automatisch zu erwerben, wenn die Frame-Korrelation 0,20 ist.
- Für Akquisition, Laserintensität auf 50 % eingestellt.
- Legen Sie die Anzahl der Erwerb Frames auf 60.000.
Hinweis: Die Ermittler kann feststellen, dass eine Probe mehr oder weniger Bildern als dies erfordert. Ändern Sie die Frameanzahl basierend auf Beobachtungen der Fluorophor Immunofluoreszenz und Stop, wenn keine weiteren Ereignisse nachweisbar sind. - Start Übernahme.
Hinweis: Zu Beginn des Erwerbs, alle Farbstoffmoleküle sind im fluoreszierenden Zustand und wechseln Sie dann in den dunklen Zustand. Wenn die Frame-Korrelation 0.20 erreicht, startet Bilder erworben werden. Wenn weniger als 8 Veranstaltungen pro Frame erkannt werden, wird der 405 Laser einschalten, ermutigend Fluorophore, Übergang von der dunklen Zustand in den Grundzustand. Beim Erwerb von Bildern für ein Dataset von n = x Zellen von n = y Tiere, Parameter, wie z. B. TIRF Eindringtiefe, Nachweisgrenze und Anzahl der Frames erworben konstant gehalten werden sollen.
13. Bildanalyse
- verwenden, um Protein-Clustergröße zu quantifizieren, die ' Partikel zu analysieren ' Merkmal des ImageJ.
Hinweis: Weitere Analyse kann mit stochastischen optische Rekonstruktion relativen Lokalisierung Mikroskopie-basierte Analyse (Sturm-RLA) oder ähnliche 13 durchgeführt werden.- Cluster-Analyse ( Abbildung 3) mit ImageJ wie folgt durchführen:
- Öffnen Sie die Image-Datei analysiert werden. Dies sollte eine 10 nm Histogramm Einzelmolekül Lokalisierung Karte, wie in der imaging-Software (Abschnitt 12) beschriebenen generiert.
- Stellen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes zu visualisieren: Klicken Sie auf das Menü "Bild", wählen Sie anpassen, dann Helligkeit und Kontrast. Klicken Sie auf die Option "Auto".
- Ändern Sie den Bildtyp in 8-Bit: Wählen Sie das Menü "Bild", dann wählen Sie Typ, und wählen Sie 8-Bit.
- Legen Sie den Maßstab des Bildes: das Analyse-Menü zu öffnen, klicken Sie auf Set Maßstab und geben Sie die folgenden Parameter: Abstand = 1, bekannt Entfernung = 10, 1 Pixel = 10 nm.
- Um die Messungen zu erreichenden auszuwählen, öffnen Sie das Analyse-Menü, wählen Sie Set Messungen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der Option Bereich.
- Passen Sie den Schwellenwert des Bildes. Öffnen Sie das Menü "Bild", wählen Sie anpassen, und wählen Sie dann die Schwelle, wählen Sie über/unter. Verschieben Sie den maximalen Wert auf 255 und der Mindestwert 1 und klicken Sie auf anwenden.
- , Die Partikel zu analysieren das Analyse-Menü zu öffnen, wählen Sie Analyze Partikel. Setzen Sie ein Häkchen, um wählen Pixeleinheiten und zeigen Ergebnisse zusammenfassen. Legen Sie die Größe auf 4-unendlich (da Auflösung ~ 20 nm), wählen Sie die nackten Konturen-Option und klicken Sie auf ok. Eine zusammenfassende Datei erstellt werden, die die Analyse-Details wie die durchschnittliche Clustergröße und die Anzahl der Cluster im Bild enthalten wird.
Hinweis: Vorsicht sollte ausgeübt werden, wenn so dass Rückschlüsse auf die Zahl der Proteine in einem bestimmten Cluster als die Anzahl der lokalisierte Punkte nicht linear mit der Anzahl der Proteine korreliert ist. GSD lokalisiert Farbstoffe, die konjugiert sind, Antikörper, wodurch ein Gestänge-Fehler, der das fluoreszierende Label aus der Epitops durch verdrängt > 10 nm in eine beliebige Richtung. Darüber hinaus Wenn polyclonal Antikörper verwendet werden, mehrere Antikörper kann an ein einziges Antigen binden und um das Problem weiter, kommerzielle sekundäre verwirren Antikörper sind konjugiert, im Durchschnitt ca. 3-6 Moleküle des Farbstoffes, so dass ein Fluorophor ist nicht immer gleich ein Protein. Gestänge-Fehler reduziert werden, indem Konjugation einen Farbstoff direkt an den primären Antikörper (Beseitigung der Sekundarstufe) oder eine gemeinnützige-basierte Kennzeichnung Schema 14.
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Representative Results
Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es viele andere super-Auflösung Mikroskopie bildgebende Modalitäten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf GSD Höchstauflösung Bildgebung. Repräsentative Bilder und Lokalisierung Karten sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt.
Abbildung 2 zeigt eine COS-7-Zelle, mit der ER Protein, mCherry-Sec61β und verarbeitet mit dem oben beschriebenen Verfahren transfiziert. Abbildung 2A -2 b ermöglichen den Vergleich der Bilder von der ER genommen mit dem Super-Resolution-Mikroskop im TIRF-Modus (A) und mit GSD Akquisitionsmodus (B). Die Bilder zeigen eine Verbesserung der axiale Auflösung GSD Modus übernommen. Das ist weiter in das dazugehörige Grundstück Profil zeigen, die mit ImageJ, das zeigt den Unterschied in der Verteilung der normalisierten Intensität Kurven in den Bereichen von Interesse (gelbe Linie) erzeugt werden kann. Diese Kurven zeigen den Durchmesser der Tubuli ER die scheinbar wesentlich geringer als im GSD-Modus untersucht. GSD-Mikroskopie hat eine seitliche Lokalisierung Präzision von etwa 20 nm und somit stellt etwa eine zehnfache Erhöhung der Auflösung jenseits der Beugungsgrenze. Diese Verbesserung der Auflösung führt zu einer genaueren Darstellung der Struktur der ER Tubuli.
Die Verbesserung der Auflösung von Höchstauflösung GSD Bildgebung weiter in Abbildung 3zeigt eine beschriftete kardialen Myozyten mit einem Anti-CaV1.2 Antikörper, wie oben beschrieben verarbeitet zeigt angeboten. Das Bild in Abbildung 3A wurde mit einem GSD Höchstauflösung Mikroskop inmitten der TIRF entnommen. Cluster von CaV1.2 Kanäle lässt sich entlang des t-Röhrchen-Netzwerks zu organisieren. Abbildung 3 b zeigt die gleiche Zelle, aber dieses Bild aufgenommen wurde mit GSD-Modus. Die Verbesserung der axiale Auflösung ist noch ausgeprägter in die Platten, die sich auf einzelne Gruppen von Kanälen (Abb. 3 b), bei ein Vergleich zwischen den gleichen ROI abgebildet mit TIRF und GSD, separate Cluster Kanäle leichter, als zu erkennen sind ein Ergebnis der verbesserten Auflösung von GSD Bildgebung angeboten. Diese Platten vergleichen auch den Unterschied in der Nachweisgrenze definiert als die Anzahl der Photonen pro Pixel. Dieser Parameter muss sorgfältig ausgewählt und angepasst an die Anforderungen des Experiments. Panel-3D zeigt Cluster Konturen, wenn das GSD-Bild mit ImageJ-Software verarbeitet wurde, aus diesem Bereich Cluster für jeden einzelnen Cluster im Bild ermittelt werden (siehe Hinweis oben 13.1.8 und Diskussionsbereich für wichtige Überlegungen bei solch einer Quantifizierung). Diese Information lässt dann die Frequenz-Histogramm im Bedienfeld " 3 C" zu generieren. Diese Analyse kann verwendet werden, Veränderungen in der Cluster-Größe oder die Anzahl der Cluster zwischen Proben unter Kontrolle versus Testbedingungen (z.B., WT Vs mutierten Kanäle oder unbehandelten Vs Medikament behandelten Zellen) zu untersuchen. Mit den Ansätzen, die in diesem Protokoll neben ergänzenden schrittweise Immunofluoreszenz Experimente beschrieben, haben Forscher festgestellt, dass CaV1.2 Kanäle verteilen sich in Büscheln, im Durchschnitt, 8 Kanäle in kardialen Myozyten15 .
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Chronologie der Ereignisse für das Super-Resolution Imaging von Membranproteinen. Tag 0 bezieht sich auf den ersten Tag der Verarbeitung für Antikörper zu beschriften. Protokoll Abschnitt bezieht sich auf den Abschnitt im Protokoll, wo detaillierte Informationen zu den einzelnen Schritten gefunden wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Super-Auflösung Mikroskopie bietet verbesserte Signal-Rausch und eine höhere räumliche Auflösung. (A) links COS-7 Zellen mit dem Ausdruck ihrer mCherry-Sec61β, fixiert und beschriftet, wie im Protokoll beschrieben und abgebildet, mit konventionellen TIRF-Mikroskopie. Rechten, oberen Panel: einzelne ER Röhrchen. Rechte, untere Platte: plot-Profil über die Breite des ER-Röhrchen (gelbe Linie). (B) (A) mit Ausnahme der Lokalisierung Zelle Karte wurde mit GSD Höchstauflösung erstellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Super-Resolution Imaging CaV1.2 Kanäle in kardialen Myozyten. (A) TIRF Fußabdruck aus einer isolierten kardialen Myozyten fixiert und gefärbt mit Anti-CaV1.2 Antikörper (FP1). (B) links: Super-Resolution TIRF Fußabdruck aus der gleichen kardialen Myozyten (a). Rechts: vergrößert Teile der Lokalisierung-Karte, die verschiedene Detektionsschwellen unterzogen worden. Beachten Sie, dass wie erhöht man die Nachweisgrenze, die scheinbare Größe von CaV1.2 Kanal Clustern zu verringern. (C) Frequenz Histogramm der Cluster-Größen aus der Lokalisierung Karte in (B) gewonnen. (D) links: Umrisse der ZertifizierungsstelleV1.2 Cluster aus (B). Rechts: erweiterte Teile des Bildes wurden verschiedene Detektionsschwellen unterzogen. Hinweis, (B), ähnlich wie die Nachweisgrenze erhöht, die Fläche der CaV1.2 Kanals Cluster abnimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Fluorophor verwendet | Alexa-647 |
| Laser | 642 nm |
| Emission Filter | 623 HP-T |
| Objektiv | 160 X 1,43 NA |
| Belichtungszeit | 10 ms |
| Nachweisgrenze | 65 |
| Einfallswinkel (Eindringtiefe) | 65,04 ° (150 nm) |
| EM-Gewinn | 300 |
| #frames erworben | 30.000 – 60.000 |
| Laserstärke für Pumpen | 100 % |
Tabelle 1: Liste von imaging-Parameter.
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Discussion
Die jüngste Explosion von Technologien, mit denen Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze haben neue Fenster in die Komplexität der Säugetier-Zelle signalisieren in Raum und Zeit angeboten. Diese Technologien sind Sturm, STED, PALM, GSD, SIM und ihre Varianten (z.B. dSTORM, FPALM). Der Einfallsreichtum der Wissenschaftler hinter diesen Techniken ermöglichte uns, die Beschränkungen durch die Gesetze der Physik für die Beugung von Licht zu umgehen. Trotz dieser großen Leistung jede dieser Techniken macht eine Art Kompromiss zu super-Auflösung zu erreichen und als solche hat seine Grenzen. Die ideale Situation, der Zellbiologen und Biophysiker anstreben ist optimale Empfindlichkeit, hohe Auflösung und schnelle Übernahme mit keine Immunofluoreszenz. Darüber hinaus sollte man bewusst bleiben, dass durch das Entfernen von Zellen von Tieren, wir von Natur aus zu ändern und möglicherweise Molekulardynamik ändern. Daher die Quest, eine super-Resolution-Technologie zu entwickeln, die dynamisch, ermöglicht live-Zelle, Einzelmolekül-Bildgebung in ein lebendiges, atmendes Tier geht weiter. Im Moment haben wir Werkzeuge zur Verfügung, die Bilder mit 10-divisibel Verbesserungen auf Beugung begrenzt Auflösung erzeugen kann. In diesem Artikel besprechen wir Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Analyse für GSD, die Auflösungen bis zu 20 und 50 nm in den Seiten- und axialen Dimensionen, bzw. zu ermöglichen.
Obwohl der Schwerpunkt dieses Protokolls auf Sec61β und CaV1,2 L-Typ Ca2 + -Kanälen, kann das oben beschriebene Protokoll als Vorlage für Forscher dienen, die wollen Bild verschiedene Proteine in ihren eigenen Labors auf dem GSD-Mikroskop. Die positiven Eigenschaften dieser Art des Protokolls sind, dass es relativ einfach ist, kann geändert und auf eine Reihe von verschiedenen Zelltypen angewendet und kann leicht an Multi-Color Imaging angepasst werden. Die offensichtlichen Beschränkungen sind die Höchstauflösung, Systeme, ausgestattet mit einer sensiblen EM-CCD-Kamera in der Lage Einzelmolekül-Erkennung, tendenziell immer noch zu teuer für viele Labore werden.
Da die Zahl der Labors, die Höchstauflösung Mikroskopie als ihre bevorzugte bildgebendes Verfahren verwenden wachsen, ist mehr einheitliches Verständnis und Vereinbarung über Bilderfassung, Verarbeitung und Interpretation erforderlich. Wie quantifizieren man beispielsweise das Niveau der Nähe zweier Proteine, die colocalized in einem Beugung begrenzte Pixel transpirieren um tatsächlich wenig Überlappung überhaupt in einer Höchstauflösung/Imagemap anzuzeigen? In der Tat ist dieses Szenario bereits für mehrere bisher angenommen colocalized Proteine, wie z.B. die Haftung komplexe Proteine Paxillin und Zyxin entstanden. Wie in der Entschließung, dass Mikroskope ausnahmslos zulegen werden vielleicht Proteine nicht mehr gemeldet, "sondern vielmehr colocalize' um nicht nach dem Zufallsprinzip Muster bevorzugt-Lokalisierung umeinander verteilt haben. Immerhin ist es unmöglich für zwei Proteine, genau die gleichen 3-dimensionalen Raum physikalisch zu besetzen. Einige Lösungen für dieses Problem der Analyse beginnen, in der Literatur, einschließlich stochastische optische Rekonstruktion relativen Lokalisierung Mikroskopie-basierte Analyse (Sturm-RLA), die angeblich die Häufigkeit und der Grad der Überlappung quantifizieren kann entstehen zwischen zwei Co beschriftet Proteine und bieten auch quantitative Messungen des Abstandes zwischen nicht-überlappende Proteine13. Beim Vergleich von einem Kanal zum anderen in Höchstauflösung ist es natürlich wichtig, um sicherzustellen, dass Sie korrekte Registrierung zwischen den beiden Kanälen haben. Dies kann mit Multi-Color-Mikrosphären fluoreszierenden Perlen und Bildgebung in jedes einzelnen Kanals dann überlagern die Bilder ausgewertet werden. Zusätzlich, da die SR GSD 3D Mikroskop kann auch als TIRF Mikroskop funktioniert und erzeugen Höchstauflösung Lokalisierung in TIRF Landkarten, es ist wichtig, die Eindringtiefe zwischen zwei Farbkanäle als TIRF Winkel ändern je nach entsprechen die Wellenlänge des Lichts verwendet, um die Probe zu begeistern.
Darüber hinaus kann wie in Abbildung 3 b und 3D Abbildungdargestellt, eine Lokalisierung Karte völlig andere je nach dem Grad der "Schwellwerte" angezeigt. Wenn die Nachweisgrenze zu niedrig eingestellt ist, können Strukturen scheinen größer als sie wirklich als die Wahrscheinlichkeit, sind dass eine enthält falsche unspezifische Kennzeichnung von "Rauschen" erhöht sein. Umgekehrt, wenn die Nachweisgrenze zu hoch eingestellt ist, dann können Strukturen erscheinen kleiner als sie wirklich sind, als "echte" Veranstaltungen ausgeschlossen sind. So sollte Schnittstellenüberwachung mit Vernunft und Vorsicht angewendet werden. Also, wie kann eine angemessene Nachweisgrenze für eine gegebene Probe werden ermittelt? Kontrollen sind der Schlüssel. Wie sollte mit jeder Immuno-labeling-Ansatz positive und negative Kontrollen durchgeführt werden, um die Spezifität der Antikörper zu demonstrieren. Mit entsprechenden Kontrollen ist es möglich, eine Nachweisgrenze ableiten, oberhalb derer nur spezifische Kennzeichnung beachtet werden sollten. Entsprechende Kontrollen sind Proben in denen Primärantikörper Inkubation weggelassen hat, so eine Probe nur Sekundärantikörper ausgesetzt beobachtet werden kann. Von solch einem Steuerelement ist die unspezifische Bindung eines sekundären Antikörpers erkennbar. In einer gut vorbereiteten Probe sollte dadurch eine viel kleinere Anzahl der Ereignisse pro Bild und eine geringere mittlere Anzahl von Photonen pro Pixel im Vergleich zu der primären und sekundären inkubierten Probe. Die Nachweisgrenze des Bildes kann dann eingestellt werden, so dass unspezifische Kennzeichnung beseitigt werden kann. Die gleiche Nachweisgrenze sollte dann verwendet werden, wenn Bildgebung der primären und sekundären inkubierten Probe Vertrauen zu stärken, dass "Lärm" entfällt. Weitere Kontrollen umfassen die Prüfung der Spezifität des primären Antikörpers. In transfizierten Zellen wenn die beschriftete Protein nicht nativ in der Zelllinie exprimiert wird soll dann ein einfacher Test der Primärantikörper Besonderheit der Kennzeichnung Verfahren auf untransfected Zellen ausführen. Um Primärantikörper Spezifität bei Primärzellen zu demonstrieren, ist ein genetische KO von den beschrifteten Protein der Goldstandard. Detektionsschwellen können auch mit diesen Primärantikörper Experimente eingestellt werden. Bei fehlender das Ziel-Antigen ist Fluoreszenzemission unspezifisch. Wie mit den sekundären nur Kontrollen, mit einem guten primären Antikörper weniger Ereignisse pro Bild beobachtet werden sollte und deshalb über die gleiche Anzahl von Einzelbildern, bedeuten eine geringere Anzahl der Photonen pro Pixel sollte klar sein. Die Nachweisgrenze kann somit auf ein Niveau eingestellt werden, die unspezifischen Hintergrund Färbung aufgrund Ziel Primärantikörper Bindung zu beseitigen wird. Für vollständige Transparenz wird vorgeschlagen, dass Autoren mit ihren Schnittstellenüberwachung Parametern deutlich gesagt und vielleicht mit einem Link auf die Rohdaten in eine Onlin Bilder präsentieren solltee-Depot.
Der Prüfer muss auch bewusst bleiben, dass mehrere Sekundärantikörper an einem einzigen Primärantikörper binden können, also eine Verhältnis 1:1 primäre: sekundäre Bindung nicht davon ausgegangen werden sollte. Darüber hinaus sind kommerzielle Sekundärantikörper häufig an mehreren Fluorophore konjugiert sind, beispielsweise die sekundäre Antikörper eingesetzt, die in diesem Protokoll vom Hersteller an 2-8 Fluorophore konjugiert werden vermerkt. Als Work-around dazu kann ein Fluorophor direkt an einen primären Antikörper konjugiert werden. Spektrophotometrie kann dann verwendet werden, um festzustellen, die durchschnittliche Anzahl der Fluorophore pro Primärantikörper. Mehreren im Handel erhältlichen Kits sind erhältlich um diese Konjugation durchzuführen. Auch wenn eine 1:1-Stöchiometrie erreicht ist, kann das Fluorophor-Molekül selbst weiter overcounting Probleme aufgrund der blinkenden und reversible Umschalten des Fluorophore schafft. In der Praxis bedeutet dies, dass ein Fluorophor mehrmals, zwischen dem Boden und angeregten Zustand Cluster von Photonen emittieren fahren kann, als es das tut. Diese Photonen können in mehreren benachbarten Pixeln erkannt werden und zu einer Überschätzung der Clustergröße. Andere Forscher haben dieses Problem behoben, indem Sie beschließen, fluoreszierende Emissionen über kurze Zeiträume von Zeit und Raum16,17Cluster kombinieren. Dies ist ein etwas empirischen Ansatz, der noch nicht die Möglichkeit beseitigt, die die gleichen Fluorophor konnte wieder in den dunklen Zustand für eine längere Zeit, dann rückwärts in einen Rad-/emittierende Zustand nochmals Zyklus und als zweite Molekül beurteilt werden. Daher kann nicht die Anzahl der Moleküle in einem Cluster ausschließlich auf die Cluster-Größe berechnet werden. Im Moment gibt es keine perfekte Lösung für diese Probleme, und daher kann die Verwendung von Super-Resolution Imaging in Verbindung mit einer anderen Technik wie schrittweise Immunofluoreszenz geben eine ungefähre Schätzung der Anzahl der Moleküle pro Cluster. Relevanten Steuerelemente Vertrauen in Cluster Flächenmaße Stärken gehören Clustergrößen von bekannten Monomere (z. B.CD86) und bekannten dimeres Proteine (z.B.CTLA-4) zu vergleichen, denen des Proteins des Interesses wie vorgeschlagen Fricke Et al. 18.
Fazit: in diesem Artikel wird eine einfache Immunolabeling-Protokoll festgelegt her beschreibt die Vorbereitung von festen Proben für Super-Resolution Imaging. Darüber hinaus werden einige häufige Probleme in der Bildaufnahme und Analyse diskutiert. Als Super-Auflösung mehr alltäglich wird, kann es notwendig für Zeitschriften, einen neuen Satz von Richtlinien, um unangemessene Manipulation dieser komplexe Bilder/Lokalisierung Karten abzuwenden dargelegt werden. Super-Auflösung Mikroskopie hat ein leistungsfähiges neues Tool der Toolbox von Zellbiologen und Biophysiker und hat bereits eine außerordentliche Wirkung auf unser Verständnis der zellulären Architektur und molekulare Organisation.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der AHA an R.E.D (15SDG25560035) unterstützt. Autoren möchten Dr. Fernando Santana für den Einsatz des Mikroskops seiner Leica SR GSD-3D und Dr. Johannes Hell für die freundlicherweise Bereitstellung des FP1 Antikörpers erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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