Summary
이 프로토콜 영구 epicranial 전극 소켓 설치류에 이식된 가슴 전극에 대 한 수술 설정을 설명합니다. 두 번째 전극 소켓에 두어서 transcranial 전기 두뇌 자극의 종류 그대로 두개골을 통해 경고 동물에서 모터 시스템에 전달할 수 있습니다.
Abstract
Transcranial 전기 두뇌 자극은 대뇌 피 질의 흥분 및 인간과 설치류에 소성 변조 수 있습니다. 인 간에 있는 자극의 가장 일반적인 형태는 transcranial 직류 자극 (tDCS)입니다. 덜 자주 transcranial 교류 전류 자극 (공군) 또는 transcranial 랜덤 잡음 자극 (tRNS), 공군이 미리 정의 된 주파수 범위 내에서 임의로 적용 하는 전기 전류를 사용 하 여 특정 형태의 사용 됩니다. 실험 및 임상 목적을 위해 둘 다 인간, 비 침 투 적인 전기적 뇌 자극 연구의 증가 기본, 기계, 안전 연구 동물에 대 한 요구는 굴복 했다. 이 문서에서는 경고 설치류에 모터 시스템을 대상으로 그대로 두개골을 통해 transcranial 전기 두뇌 자극 (tES)에 대 한 모델을 설명 합니다. 프로토콜 가슴에 이식된 카운터 전극과 함께 영구 epicranial 전극 소켓의 외과 설정에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다. Epicranial 소켓에 자극 전극을 두어서, 다른 전기 자극 종류, tDCS, 공군, 그리고 인간, tRNS 비교를 전달할 수 있습니다. 또한, tES 경고 설치류에 대 한 실제적인 단계 소개 된다. 적용 된 전류 밀도, 자극 기간, 및 자극 유형 실험 필요에 따라 선택할 수 있습니다. 안전 및 내성 양상 주의 장점과 단점이이 설정의 설명 되어 있습니다.
Introduction
두뇌 기능을 공부 하 고 동작을 수정 (tES) 뇌를 전기 전류의 transcranial 관리 수십 년 동안 사용 되었습니다. 더 최근에, 적용 직접 전류, 또는 자주 noninvasively 그대로 두개골을 통해 교류 전류 (공군, tRNS)를 사용 하 여 두 개 이상의 전극 (anode(s) 및 cathode(s)) 과학 및 임상 관심 받고 있다. 특히, tDCS 건강 한 과목과 정신병 질환을 가진 환자에서 33,200 이상의 세션에서 사용 되 고 나왔다는 안전 하 고 쉽게, 오래 지속 가능한 치료 잠재력과 비용 효과적인 머리 맡 응용 프로그램 행동 효과1. 이 명확 하 게 증가 필요 및 안전 측면을 포함 하 여 기계 론 적인 연구에 과학적 관심을 얻지 못했다. 이 기사에서는 가장 일반적으로 사용 되 형태의 자극, tDCS에.
종에 걸쳐 tDCS 대뇌 피 질의 흥분 및 시 냅 스가 소성을 조절 한다. 쥐와 고양이2,3,4, 자발적인 신경 발사 속도의 극성 종속 변경 또는 변경으로 인간 및 쥐 (모터 갖는 잠재력 (MEP) 진폭에 흥분 변경 보고 모두 cathodal tDCS 후 anodal 및 감소 후 증가: 인간5,6; 마우스7)입니다. Anodal DC 모터 외피의 시 냅 스 효능 증가 또는 hippocampal synapses 생체 외에서 몇 시간 동안 자극 또는 긴 장기 potentiation (LTP) 때 특정 약한 시 냅 스 입력 또는 소성 하기 전에 주어진 공동 적용 자극8,9,10,,1112유도 에 따라, 모터 또는 인지 훈련 성공에 자극의 혜택은 종종 공개만 경우 tDCS 공급 되는 공동 훈련8,13,,1415. 이러한 이전 결과 주로 뉴런의 기능에 기인, 하는 동안 비 신경 세포 (명과) 또한 tDCS의 기능성 효과에 기여할 수 있습니다 주목 해야한다. 예를 들어, astrocytic 세포내 칼슘 수준 경고 마우스16anodal tDCS 동안 증가. 마찬가지로, neurodegeneration에 대 한 임계값 아래 전류 밀도에서 anodal tDCS microglia17의 복용량 의존 활성화를 유도 한다. 그러나, tDCS로 신경 명과 상호 변조 특정 조사 더 필요합니다.
찍은 함께, 동물 연구는 명확 하 게 흥분 및 소성 tDCS의 modulatory 효력의 우리의 이해를 고급. 그러나, 거기에 "역 변환 격차" 관찰 천천히 달리 인간의 tDCS 연구의 간행물에 있는 지 수 증가 및 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 tES의 기본 메커니즘의 수사에 약간 증가 동물 모델. 또한, 설치류 tES 모델 높은 가변성 (까지 경 피에서 epicranial 자극), 연구 실험실에서 수행 됩니다 그리고 보고 자극 절차는 종종 방해는 comparability 완전히 투명 하 고 replicability 기초 연구 데이터 결과의 해석의.
여기, 우리가 자세하게에서 transcranial 두뇌 자극 설정 기본 모터 피 질, 변화를 최소화 하면서 인간의 tDCS 조건에 번역을 허용 하 고 수 없이 반복 된 자극을 대상으로 외과 구현 설명 동작을 방해. 후속 tES 경고 쥐에 대 한 단계별 프로토콜 제공 됩니다. TES 경고 설치류에서의 안전한 응용 프로그램의 방법론 및 개념적 측면을 설명 합니다.
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Protocol
동물을 포함 하는 연구에 대 한 관련 (국가별) 승인 실험을 시작 하기 전에 얻을 수 있어야 합니다. 여기에서 보고 된 모든 동물 실험은 EU 지침 2010/63/EU, 업데이트 독일 동물 보호 법률에 따라 수행 됩니다 (" Tierschutzgesetz ") 2013 년 7 월, 8 월 2013의 업데이트 독일 동물 연구 규정. 지방 자치 단체에 의해 동물 프로토콜 승인 " 위원회는 지역 위원회의 프라이 부르 크의 동물 실험에 대 한 " 및 " 대학 의료 센터 Freiburg의 동물 실험에 대 한 위원회 ".
1. 계측의 준비와 수술에 대 한 자료
- 그림 1에 나열 된 항목 사용할 수 있는 이미 배치 된 수술에 대 한 있는지 확인 하십시오.
- 얇은 사각형 백 금 접시를 준비 (예: m m 6 m m x 0.15 m m x 10), 피하는 가슴에 배치 하는 카운터 전극 역할을 것입니다 그리고 격판덮개의 2 개의 반대 모서리에 2 개의 작은 구멍을 펀치.
- 솔더는 리드 프리 주석-솔더 백 금 판 (구멍) 없이 모서리 중 하나를 사용 하 여 ~ 10 cm의 길이 가진 절연된 케이블.
- 격리에 대 한 납땜 조인트에 조직-아크릴 접착제의 작은 방울을 적용.
2. 수술에 대 한 설치류의 준비
- 쥐 연구 번호를 할당 하 고 준비 된 수술에이 카드
- 는 설치류 무게 고 수술 카드에 무게 합니다. (예, 케 타 민 100 mg/kg 체중 플러스 쥐에 대 한 xylazine 70 밀리 그램/kg 체중) 주입 마 취약의 복용량을 계산. 마 취약의 계산된 금액의 복 (i.p.) 주입 마 취
- 유발.
참고: 흡입 마 취를 대신 사용 하는 경우 (예: isoflurane), 1-2 L/min 산소에서 ~ 4%의 지속적인 흐름 유도 실에서 쥐를 놓습니다. - 검사 깊이 시작 5 분 발가락 핀치 반사에 의해 마 취의 포스트 주입. 발가락 핀치 반사 여전히 있으면 도달 연장 30%의 초기 복용량의를 주입 하 여 마 취의 심화.
- 마 취의 초기 복용량의 30%를 주입 해야 실험에서 시간 언제 든 지 발가락 핀치 반사 반환,.
- 흡입 마 취를 사용 하 여 유도 챔버에 설치류의 자세 반사의 손실에 대 한 모양과 발가락 핀치 반사의 부족에 의해 마 취의 깊이 확인. 반사 신경은 여전히 존재 하 고, 마 취 약 실에 있는 기간을 확장 합니다. 모든 실험에 걸쳐 ~1-1.5% isoflurane의 유지 관리 농도 도달할 때까지 isoflurane 마 취의 깊이 비율을 적응.
- 감소 호흡 하 고 헐 떡이 고의 주파수 발생 때 설치류 차릴 발가락 핀치 반사 또는 자발적인 운동 비율; 낮은, 흡입 마 취의 비율을 증가.
- 최대한 빨리 반사는 결 석, 설치류 실험실 벤치에 두거나 손에 잡고.
참고: 흡입 마 취를 사용할 경우는 분무기에 연결 된 노즐을 사용 하 여 (지금 2-3%) 간의 지속적인된 감소 isoflurane 흐름 제공. - 쥐에 머리를 제거 ' s 머리 면도 지역 귀 귀와 깎기로 귀 뒤에 그냥 rostral 눈높이 사이. 다음은 clavicles까지 칼에서 앞 발 사이의 영역을 면도 하 여 가슴에 머리를 제거.
참고: 면도 질 때 긴장 아래 피부 유지. - 커버 각 막을 보호 하기 위해 눈 연 고의 하락을 가진 쥐의 눈.
- 표시 쥐 ' 할당 된 연구 번호에 따라 s 귀.
참고: 학문의 길이 따라 꼬리 마크 충분 한 수 있습니다, 그렇지 않으면 earmarking 표준화 하는 것이 좋습니다.
3. 수술: 가슴 전극 이식
참고: 카운터 전극 외부 조끼와 함께 면도 가슴에 배치 되 면이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
- 장소 설치류 (가슴)에 발생 하기 쉬운 작업 테이블.
참고: 흡입 마 취의 경우 계속 쥐 ' s 주 둥이 마 취 노즐, 더 1.5-2 %isoflurane 농도 감소에 배치. - 소독 살 균 스프레이 함께 또는 살 균 에이전트 (예를 들어, 에탄올 70%)에 흠뻑 젖 고 공기가 건조 하 게 면봉으로 면도 두 피. 두 번 반복.
- 중간 귀 수준 rostral 눈높이에서 한 줄에 메스로 피부를 잘라.
참고:이 머리의 상단을 향해 이식된 가슴 전극에서 연결 케이블의 터널링에 대 한 허용 하 고도 DCS 전극 소켓 배치에 대 한 원하는 컷. - 가슴 노출 부정사 위치에 쥐를 돌립니다.
- 단계 3.2에에서 설명 된 대로 가슴의 피부를 소독.
- 오른쪽 가슴의 옆 피부 조직 집게와 함께 상승 하 고 오른쪽 겨드랑이에서 중간 약 0.5 c m의 작은 위는 buttonhole를 잘라. 다음은 위 두개골 방향에 똑바로 화살 컷 확인.
- 들은 왼쪽된 주요 가슴 근육에서 피부를 분리 하 여 피하 주머니를 형성 합니다. 이렇게 반복적으로 작은 위를 열어 (또는 염 분 젖은 면봉).
- 케이블 경로 후 두의 왼쪽 목 homeostatic 집게를 사용 하 여 표면 근 막 관통 하 여 가슴 주머니에 종료를 따라 열린된 머리 피부에서에서 터널의 오른쪽 면에 동물을 차례.
- 신중 하 게 날카로운 전선 이탈을 허용 하지 않고 백 금 전극에 부착 된 전극 케이블의 끝을 잡으려고 homeostatic 집게를 엽니다. 전극 입력 설치류 왼쪽된 hindlimb 향해 납땜 포인트 지향 주머니까지 터널을 통해 케이블을 당겨. 설치류는 경향이 위치로 다시 설정.
- 코너 구멍 (4-5 노트는 안정성에 대 한 것이 좋습니다)를 반대 하는 2에 백 금 판 가슴 근 막에 살 균 합성 꼰된 비 흡수 봉합으로 해결.
- 마찬가지로 느슨한 매듭, 조직 터널의 입구의 앞에 약간의 루프를 형성 하 여 근 막에 케이블을 연결.
- 컷 (동일한 봉합 재료는 전극 및 케이블 사용할 수 있습니다)의 크기에 따라 3-4 피부 봉합 피부 닫습니다.
4. 수술: Epicranial tES 소켓의 배치
- 장소 정위 적 프레임에서 동물.
참고: 발가락 핀치 반사와 호흡 패턴을 조정 하는 ~1.5-1 %의 유지 보수 isoflurane 흐름에 마 취약의 농도 낮추면 흡입 마 취를 사용 하 여,. - 단계 3.2에에서 설명 된 대로 면도 두 피 소독.
- 중간 귀 수준 rostral 눈높이에서 한 줄에 메스로 피부를 잘라.
참고: 경우 가슴 전극 placement 수행한, 4.2와 4.3 단계를 이미 수행한. - 긁어 메스와 철저 하 게 면과 두개골에 (결합 조직)에서 목화와 함께 닦아가 바꿉니다. 불독 클램프와 컷의 4 모서리에 결합 조직 흥분 하 고 그들을 넓히려 수술 필드 옆으로 걸어.
- 적용 0.9% 식 염 수를 면봉으로 조직과 뼈 표면 청소. 다음 3% H 2 O 2와 뼈 표면 청소. 조직와의 접촉을 피하십시오. 이로써 뼈를 더 철저 하 게 청소 하 고 뼈에서 작은 출혈이 중지 됩니다. 또한,는 오차 표시 된다. 적당 한 압력을 적용 하는 면봉으로 이러한 오차를 제거.
참고:과 오차의 제거는 접착과 뼈에 붙어 tES 소켓의 내 구성을 증가 합니다.- 거침 없는 출혈의 경우 뼈 드릴을 사용 하 고 뼈에 약간의 압력으로 1-3 s 터치. 이 기계적인 절차 대부분의 경우에 중지 됩니다 상당한 난방 없이 출혈. 결코 electrocautery 뼈;에 사용 심지어 간단한 응용 프로그램 뇌 조직 손상 귀 착될 것 이다 (electrocautery 전적으로 사용 해야 상처 조직 출혈).
- 고정 나사 설정 준수 향상 됩니다, 드릴 비트 피팅 나사 크기 선택. 미리 손 드릴으로 드릴링에 의해 그리고 뼈 드릴으로 약간의 수직 압력 응용 프로그램에 의해 두 개의 버 구멍 두 개의 서로 다른 뼈 접시에 놓습니다. 전극에 속이 고 다는 것을 방해 수도 tES 소켓의 원하는 위치에 가까운 근접을 피하십시오 (예를 들어, 왼쪽된 기본 모터 피 질 tES에 대 한 선택 바로 정면 및 후부 정수 리 나사 위치).
- 이식된 카운터 전극의 경우 터널링된 케이블의 미래 고정을 위한 바로 후부 정수 리 뼈에 있는 제 3의 구멍을 규 석.
- 버 구멍에 플라스틱 나사를 배치 하 고 첫 번째 마찰 느낌까지 나사. 다음 3 개의 추가 180 ° 스크류 회전을 수행 합니다. 집게는 스크류의 안정성에 대 한 확인 하 고 하나 더 설정 하지 꽉 충분히 추가.
참고: 성인 쥐에 대 한 이렇게 하면 나사에의 경 막 외 배치 경질 또는 (나사 스레드 설계, 회전 수 다를 수 있습니다)에 따라 뇌 손상 없이. 스테인레스 스틸 나사를 사용 하 여 또한 실현 되어야, 이후 neurodegeneration 임계값 이상 DC 전류 밀도, 에서도 나사 배치 않았다 교란 하지 병 변 위치 또는 나사 아래 정도. - 차례 납땜 및 대략 5 분에 대 한 전 열 케이블 occipitally 오른쪽 정수 리 나사 주위 조직 터널 종료 바람 그리고 잘라, 감기 뒤에 약 1 c m 케이블을 떠나. 조심 스럽게 메스와 케이블의 끝에 절연 스트립.
- Cyanoacrylic 접착제와 나사를 뼈 호흡이 케이블을 수정.
- 커넥터 및 카운터 전극 케이블의 맨 와이어 리드 프리 주석-솔더의 작은 금액을 적용 하 고 짧게 함께 주석 땜 납이 녹아 때까지 납땜 끝을만 지는 동안 두 사전 납땜된 부분을 누르면 모두 연결 (약 2-3 s). 즉시 후속 조직 손상이와 케이블의 과도 한 금속 난방을 피하기 위해 납땜 팁 제거.
- 구부러진, 톱니 모양의 팁 집게와 사용자 정의 만든된 tES 전극 소켓 ( 그림 1B, 빨간색에서)을 선택 하 고 소켓의 아래쪽 가장자리에 cyanoacrylic 접착제의 얇은 층을 적용. 모터 피 질와 4 m m 직경 소켓을 사용 하 여 배치, 2mm 앞쪽은 bregma에서 2mm 측면에서 중반 소켓 포인터를 놓습니다. 이 위치에 대 한 소켓의 내부 중간 국경 화살 봉합에 끝나야 하 고 꼬리 테두리 bregma의 높이에서 종료 해야 합니다. 간단히 (대부분 cyanoacrylic 접착제 강화 압력에 의해) 뼈에 소켓을 누릅니다.
참고: 소켓 배치 쉽게 수 있습니다 소켓 위에 직접 광원을 배치. - 소켓의 영역 내에서 뼈가 접착제의 무료 (접착제는 반사 때문에 빛으로 확인) 확인 하십시오. 접착제의 경우 유출, 소켓 제거, 메스와 접착제를 긁 고 단계를 반복 4.12.
- 소켓 장소에서 이며 미래의 자극 지역 접착제, 무료 후 먼저이 위치에서 현재의 전철 이어질 수 있는 액체 다리를 피하기 위해 cyanoacrylic 접착제의 작은 방울으로 인접 조직에 소켓의 측면 테두리 인감. 그것은 자극 영역으로 흐름 수 있습니다 너무 많은 접착제는 적용 되지 않습니다 (이 경우 단계로 돌아가서 4.12).
참고: 중요 한 자극의 감소 수 있습니다 극적으로 전류 밀도 증가 접착제의 무료 자극 지역 유지 (A/m ²). - Cyanoacrylic 접착제로 모든 나사 커버.
- 믹스 2 분 치과 아크릴 작은 실리콘 튜브 또는 유리에 시멘트. 최대한 빨리 그것은 된다 점성, 뼈에 소켓의 나머지 테두리를 봉인 하기 위해 치과 주걱으로 그것을 적용 합니다. 자극 영역으로 치과 아크릴 시멘트의 어떤 흐름 방지.
- 마침내 커버 전체 두개골, 나사, 카운터 전극 케이블 및 소켓 최대 ⅓ 치과 아크릴 시멘트와 소켓의. 시멘트가 올바른 점도: 만약 너무 유체 흐름 것입니다 주변 조직;으로 너무 열심히 하는 경우 그것은 균등 하 게 배포 어렵다.
- 모든 뼈를 보호 하 고 시멘트 경화 불독 클램프를 제거, 봉합이 필요 하지 않습니다 있도록에 피부는 그냥 내장 시멘트를 터치 한다. (초기 컷 선택 너무 오래 되었고 결합 조직, 근육이 보이는 경우 적용 한 봉합 단계 3.12에에서 설명 된 대로).
- 컷된 피부의 테두리 면봉으로 요오드의 한 레이어를 적용 하 고 carprofen (5 mg/kg 체중의 0.9% 식 염 수 통증 치료 및 유체 교체에 대 한 5-7.5 mL에 용 해)을 피하 주사.
참고: 흡입 마 취를 사용 하는 경우 그것을 해제 지금. - 놓고 쥐 마 취에서 회복에 대 한 지구 온난화 상자에서 설치류는 깨어 고 자세 안정성 복원.
참고: 확인 하십시오 동물 ' s 무게 개발, 상처는 기관에 따라 매일 주, 및 일반적인 복지 기준 ' s 추천.
5. Transcranial 전기 자극 절차
참고: 마 취 tES 효과 영향을, 가능 하면 경고 설치류에 자극을 수행 것이 좋습니다. 쥐 실험을 시작 하기 전에 최소 5 일 (머리와 가슴 상처의 치유)에 대 한 복구를 허용 합니다. 실험에서 수행할 수 있습니다 이전 시간 포인트 수술 후 가슴의 상처는 대부분 과민성; 외부 카운터 전극, 조끼와 함께 고정을 사용 하는 경우 하지만 동물 전극 조끼에 몇 일 동안 익혀 진다 될 필요가 있고 행동 작업 방해가 발생할 수 있습니다.
- TES 전극 소켓 0.9% 식 염 수와 절반를 기포 제거.
- 수앞 cathodal tDCS 세션 항상 염소, 확인 하 고 (와 같은 빛나는 은색 표면), 필요한 경우 다시 Ag/AgCl 전극 인터네셔널. Anodal tDCS 세션 전에 자극 동안 좋은 전도도 수 있도록 샌드 페이퍼와 이전 stimulations에서 가능한 초과 AgCl 예금을 제거. ( 그림 1B, 회색 조각) tES 전극 나사 모자 나사.
주의: 다시 cathodal tDCS 세션 사이의 전극 인터네셔널를 지도할 것 이다 자극 동안 수돗물의 고갈 및 독성 구축 전기 화학 반응에 의해. 이 조직의 손상을 유발 한다. 단일 세션 내에서 다시 염소 자극 기간 20 분 보다 짧은 경우 필요 하지 않습니다 - 머리에 2 명의 커넥터에 케이블을 연결 (anodal 자극에 대 한 anodal 케이블 연결 된 커넥터 나사 모자 cathodal 자극을 위해에 그것은 반대).
참고: 외부 배치 카운터 전극에 사용 하 여, 커버 전도성 젤와 설치류에 카운터 전극 ' s 가슴. 이것은 전극은 미리 설치류 자극 동안 입을 수 있는 작은 설치류 조끼에 고정 하는 경우 가장 쉬운. - 으로 실험, 케이블 쥐 운동 무료 있도록 케이지 위에 회전에 연결 장소.
- 는 자극 설정 (자극 강도, 기간, 시간 아래로 램프) 자극 매개 변수를 조정 하는 고.
- 종료 안전 및 단선 경보 상용 자극 장치를 사용 하지 않을 때 일정 전류 흐름 확인 회로에 미터를 포함.
참고:이 설정 자극 적용할 수 있는 성능 또는 행동 작업 훈련 동안. - 자극 동안 긴장의 표시 또는 설치류의 불편에 대 한 확인 하십시오.
- 자극 끝 후 케이블을 분리, 나사 머리에 전극 cap 및 청소 하 고 면봉으로 소켓을 건조. 가정 환경에 쥐를 반환 하거나 원하는 경우 행동 절차 진행.
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Representative Results
신뢰할 수 있는 반복된 tES 경고 설치류에 대 한 설정의 기술된 구현 기계 실험, 복용량 응답 학문 또는 실험 행동 작업 등으로 쉽게 통합 수 있습니다. 날짜 하려면, (비 침 투) tES를 사용 하 여 동물 연구에서 데이터의 comparability 방해 실험실 사이 tES 자극 설정의 다양성에 의해과 자극 매개 변수 (예를 들어, 다양 한 전류 밀도에서 적용 차이 의해 엄청난 높은 수준 인간의 응용 프로그램에 비해). 따라서, tES의 분야에서 동물 연구의 유익한 값 제한 됩니다. 이 문서는 대상된 피 질 위에 뼈에 "활성" 전극의 배치를 구현 하 여 실험실에 걸쳐 표준화 하기 쉬운 tES 설정 선물 (기본 모터 피 질 (M1) 위에 여기)와 식 염 수는 낫으로 전도성 매체와 카운터 전극 가슴에 배치 (외부 또는 이식).
설치류의 작은 크기를 감안할 때, 쥐의 피부에 대상된 피 질 위의 전극 배치로 이어질 수 있습니다 과도 한 shunting 카운터 전극 가까이, 예를 들어, (예: 현재 모델링의 목에에 배치 하는 경우에 특히 (참조1에서 채택) 그림 3 참조). 또한, 안정성과 전극 접촉 덜 안정적 이며 설치류 반복된 전극 배치에 의해 염증이 더 경 피 응용 프로그램을 사용 하는 경우. 아닌 영구적인 설정의 고정 또한 자유롭게 수행에서 짐승을 방해 수 있습니다. 대조적으로, 설치류가 영구적으로 현재 이식된 설정 빠르게 조정합니다.
인간의 자극 매개 변수에 비해 해당 자극 강도의 추정 어렵습니다, 이후 모델 수만 고려 요인의 제한 된 숫자 및 설치류는 pachygyric (는 확장의 추정에 대 한 참조1 참조 요소)입니다. 따라서, 낮은 강도의 전류를 포함 한 복용량 응답 데이터 수집 수 있습니다 가장 유익. 마 취 쥐에서 복용량 응답 학문에서 제시 수술 설정 사용 하 여, 자극 기간 (24 시간 후 자극)을 outlasting 복용량 의존 microglial 활성화 되었고 시연 neurodegeneration 높은 발생에서 사람이 강도 DC (그림 4; 참조17에서 채택). Microglial 활성화, 형태 변경에 의해 평가 먼저 31.8 A/m ² (그림 4C)에서 발생 한 neurodegeneration의 첫 번째 징후 47.8에서 검색 하는 동안 A/m ². 이 실험에서 마 취 명확 하 게 영향을 DC에 대 한 응답의 크기 fluorojade C (FJC) 긍정적인 degenerating 신경 세포 경고 쥐와 뇌 조각의 비율 47.8 A/m ² (그림 4A)에서 더 높은 했다. ≥ 24 h에 대 한 임계값으로 병 변 임계값에 가까운은 microglial 활성화를 지속 하지만 크게 농도 인 간에 있는 생리 인지 및 플라스틱 프로세스를 촉진, 위 같은 활성화 나타낼 수 있습니다 오히려 pre-lesional 염증 DC에 의해 유도. 따라서, 이러한 높은 농도에서 DC의 행동 또는 분자 효과 낮은 강도 효과 (효과 및 그림5에서 tDCS 실험의 농도 요약 하는 스키마를 참조)에 비해 mechanistically 다른 예상 된다.
그림 1: 수술 및 tES 소켓 및 전극의 기술 체계에 대 한 공급 장치 모자 (A) 1입니다. 면 면봉, 2 살 균 제, 3 정위 적 프레임, 4입니다. 인 철, 5입니다. 진통제 (예, carprofen), 6. & 7. 마 취약 (예: xylazine & 마 취 제), 8. 주사기, 9입니다. 클리퍼, 10 귀 뚫는, 11 눈 연 고 (예를 들어, bepanthene), 12. 주석 무연-솔더, 13입니다. 2 구성 요소 치과 아크릴 시멘트 (DAC), 14. 요오드, 15 3% H2O2, 16. 0.9% 식 염 수, 17 합성 꼰 비 흡수 봉합 (예를 들어, Mersilene 4-0), 18. 드릴 비트, 19. cyanoacrylic 접착제, 20입니다. 불독 클램프 21 항상성 집게, 22 구부러진, 톱니 모양의 팁 겸 자, 23 바로, 날카로운 팁 겸, 24. 스트레이트, 조직 집게, 25 치과 주걱, 26 메스, 27 가 위, 28. 손 드릴, 29입니다. 스크류 드라이버, 30입니다. 모터 구동 드릴, 31입니다. 여성 커넥터, 32입니다. tES 소켓, 33입니다. 백 금 전극 케이블, histoacrylic 접착제, 34로 덮여 납땜 조인트에 부착 된 광장. 플라스틱 나사 (B) tES 소켓 4 밀리미터;의 내부 직경을 가진 설치류 두개골에 고정을 위한 (빨간색) 전극 단위 (회색) 스탬프의 하단에 붙어 있는 Ag/Cl 디스크 전극 케이블을 위한 공간을 떠나 센터 구멍 나사 모자 및 내부 도장에 의해 만들어집니다. 설정의 최대 안정성 및 민감한 와이어 전극 연결 지점에서 와이어 휴식의 회피 가능합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: tES 설정 갖춘 쥐. 왼쪽에 쥐 면도 가슴에 외부 고정된 카운터 전극 갖추고 있다. 탄소 고무 전극은 조끼의 아래쪽을 꿰 매. 오른쪽에 쥐 머리에 터널링 케이블 이식된 가슴 전극에는 있습니다. (꼬리) 케이블에 연결 된 암 커넥터 (rostral) tES 전극에 대 한 소켓의 뒤에 건설 하는 치과 아크릴 시멘트 단위 내에서 고정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 두 개의 다른 설치류 tES montages 현재 배포의 모델링. 유한 요소 모델 epicranial tDCS montages, 권한이1로 두 쥐 모델에서 뇌 전류 흐름을 예측. 이러한 모델을 사용 하 여, 대뇌 피 질의 병 변 유발 예측된 임계값 뇌 전류 밀도 17.0 A/m ² Fritsch, 외 에서 사용 하는 몽타주에 대 한 8 (A), 및 6.3 A/m ²로 한, 외. 여 몽 타 쥬에 대 한 21 (B)에 해당 하는 61, 전기 분야 23 V/m, 각각. 두 개의 다른 montages의 현재 흐름 패턴에 불일치 note (A) (B) 보다 더 낮은 충전 밀도 결과 짧은 시간에 대 한 더 높은 전류 밀도 적용 됩니다. 가장 중요 한 카운터 전극 (목 가슴 대)의 배치 결과 뇌 전류 흐름에 추가적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 설치류 데이터의 해석, 전극 크기, 배치 (두 전극), 적용 된 전류와 자극 기간 사양이 필요 합니다. 참고 쥐 뇌 내에서 실제 전류만 이러한 계산 모델을 사용 하 여 예상할 수 있는. 색 눈금 표시 제로 11.6에서 전류 밀도 A/m ², 이상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: anodal tDCS 기본 모터 피 질에 적용의 다른 복용량 후 얻은 microglia 활성화 및 뇌 조각에서 neurodegeneration DC의 복용량 응답 효과. 그림17 복용량 응답 tDCS 연구의 immunohistological 연구 결과 요약에서 수정 됩니다. (A)의 관계형태학 상으로 활성화 안티-CD11b/c 얼룩 (등급 아래 참조)에 의해 평가 microglia neurodegeneration FJC 양성 공개. 쥐 모터 외피 두뇌 분할 영역 평가 되었다 안티-CD11b/c와 FJC 얼룩으로 멀게 탐정 중 하나에 의해 안티-CD11b/c 긍정적인만 (감지 활성화 형태학 상으로 결정의), 또는 안티-CD11b/c와 FJC 부정적인 긍정적인. 참고 microglial 활성화 neurodegeneration 요일 앞에. (B) anodal tDCS 기본 모터 피 질에 적용의 다른 농도에 노출 된 쥐에서 왼쪽된 모터 외피 두뇌 조각에서 (+1.56 밀리미터는 bregma에서 근처)의 대표적인 코로나 섹션입니다. 마 취 쥐, neurodegeneration의 흔적 31.8에 발생 한 A/m ², 몇 동안 degenerating 신경 복용량을 증가 함께 더욱 증가 47.8 A/m ²와 신경 손상에 참석 했다. 주의 47.8 A에서 anodal DC/경고 쥐 m ² neurodegeneration와 조각의 비율 증가. 모든 섹션에 대 한 눈금 막대: 500 µ m. 확대 입구 눈금 막대 모든 섹션에 대 한: 20 µ m. (C) 조직학 샘플 이미지 4 (심각 하 게 활성화 (활성화 되지 않음) 0에서 사이의 안티-CD11b/c immunohistochemistry 정품 인증 microglia 등급의 ), 1-4 "확실성"으로 평가 했다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 현재의 관계를 설명 하는 스키마 사용 인간의 응용 프로그램에 비해 설치류 tDCS 전류 밀도: 염증, neurodegeneration, 및 30의 자극 기간에 생리 적 프로세스의 변조에 대 한 임계값 분 현재 사용 된 설치류 DC 전류 밀도 범위 1.3에서 143을 사용 하 여 연구의 대다수와 가진 A/m ² 이상의 20 A/m ², 인간 연구의 대다수에서 전류 밀도 사이 0.3과 0.8 A/m ²1,14는 하는 동안. 인간의 자극 매개 변수 neurodegeneration1에 대 한 임계값 크기 순서 하나 이상 있습니다. 대뇌 피 질의 흥분 억제17때 임계값 neurodegeneration 마 취, 크게 높은 수준 이다. Microglial 활성화를 지속 아래 하지만 신경 손상17유도 농도 가까이 시작 합니다. 병 변 임계값 아래 높은 농도에서 대뇌 생리 적 프로세스에 DC의 효과 조절의 확률이 매우 낮은 농도 (인간의 응용 프로그램에 비해)에서 본 논문에서 다른. 종 사이 자극 매개 변수의 정확한 번역은 조사를 받고. 의견 (모른다 여부 같은 전류 흐름 이어질 것 같은 종에 걸쳐 가능한 다른 감도 뉴런, 명과, 그리고 네트워크의 전기 분야에 의해 뿐만 아니라 크기와 해부학 (sulci 및 gyri) 같은 수동 요인에 의해 방해 생리 효과)입니다. 따라서, 가장 유익한 연구 설계 복용량 응답 방식으로, 현재 매우 낮은 농도 포함 하 여 tES 효과 테스트입니다. 7,12,16,18,19,20,,2122, 에서 데이터 기반으로 계획 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (세션 당 30 분의 최대 자극 기간, 데이터 제외 질환 동물 모델에서 있다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 일반적인 재료와 경고 설치류에 후속 자극 뿐만 아니라 영구 tES 설정의 외과 실현을 위한 절차 단계에 설명합니다. 몇 가지 방법론적 측면 (안전성 및 내성의 tES, 결과 매개 변수) 뿐만 아니라, 개념적 측면 (comparability 인간의 조건, 특정 뇌에 자극의 기대 효과와 tES 실험 쥐의 준비 하는 동안 고려 되어야 하는 지역) 필요. 방법론 관점에서 이식된 가슴 카운터 전극으로 두개골 tES 소켓의 외과 설정 경고, 자유롭게 이동 하는 설치류에서 응용 프로그램에 대 한 있습니다 이후 경도 연구에 대 한 유리 하다. 케이블 연결 및 영구 설정에 설치류의 요법이 니 필요 하지만 나중에, 그것은 함께 행동 작업에도 tES을 허용 한다. 또한, 자극 동안 설치류의 불편은 착용 하는 동안 이식된 전극의 전 케이스와 조직 접촉에서 움직임은 제한 되지 않습니다 때문에 조끼, 수 놓은 카운터 전극에 비해이 설정 가능성이 낮은 자극 보장 됩니다.
제시 tES 설정 전극 케이블 불연속성, 물자 불안정, 또는 감염 없이 최대 3 개월 지속 실험을 위해 사용 되었습니다. 그것은 따라서 가능성이 설정은 또한이 기간 보다 더 긴 실험에 적합입니다.
이 epicranial 자극 몽타주는 설치류 몸 크기에 게 전극의 관계에에서 더 큰 넓이에 발생 가능성이 피부 구조를 통해 과도 한 shunting 방지 ( 그림 3 및 참조1참조). 설치류에서 epicranial 자극에 대 한 이식된 설정 실험을 자유롭게 이동 하는 동물, 전극 위치의 명확한 정 및 현재 배달의 신뢰성에 대 한 높은 실용성에 대 한 수 있습니다. 이러한 요인 실험의 표준화에 대 한 주요 장점, 대표 하는 동안 인간 또는 설치류 (예: 32,33참조) 경 피 자극에 불일치는 마음에 지켜져야 한다. 그러나, 결과의 번역, 현재 뇌 (뇌 전류 밀도), 다른 조직을 통해 통로의 독립에 도달 실제 양의 주요 관련성34입니다. 카운터 전극의 배치는 일반적으로 방향과 전류 흐름1의 배포를 확인합니다. 따라서, 뉴런의 양극 화, 가슴 (전류 흐름의 dorsoventral 방향)에 카운터 전극의 배치 수 있습니다 더 효과적인 목 (전류 흐름의 방향 rostrocaudal)에 배치에 비해.
TES 또는 행동에 미치는 영향의 근본적인 메커니즘을 해결 하는 연구 해야 가능할 때마다 경고 설치류 때문에 마 취는 크게 (patho)와 상호 작용 하 수행-신경 활동35 를 포함 하 여 생리 적 프로세스 36 및 소성36,37, 그리고 수 있습니다 억제 또는 변경 tES 효능17, (그리고 우리의 되지 않은 관찰) 또는 해1,17. 반대로 마 취 설치류에서 얻은 결과 경고 조건, 잠재적으로 방해 하는 인간에서 연구를 앞으로 번역에 직접 유추를 허용 하지 않습니다. TDCS 마 취 쥐에 경고 쥐 모터 피 질에 적용의 차이의 예를 들어 대표적인 결과 섹션에 표시 됩니다. tDCS 동등 하 게 높은 전류 밀도에서 적용 경고 쥐 마 취 쥐17에 비해 neurodegeneration microglia 활성화의 큰 비율을 유도 한다. 이러한 결과 복용량 응답 실험의 일부는 tDCS에 microglia 및 neurodegeneration 효과에서 발생 한 높은 농도 (하지 기계 또는 행동 연구에 사용 하기 위해 권장 합니다), 그것은 낮은 tDCS 현재에서 추측 하는 유혹 밀도, 결과의 동일한 전환 설치류의 경계에 따라 발생 합니다.
마지막으로, 제공 된 프로토콜의 또 다른 장점은 오류의 가능한 소스의 감소 이다. 문제 해결 전략 그리고 중요 한 단계는 프로토콜에서 강조 되었다. 특정 연구 목적 (위에서 설명한), 대로 tES 전극의 준비에 대 한 필요 각 자극, 적용 전에 대 한 적절 한 전류 밀도의 선택 포함 됩니다 그리고 철저 하 게 신뢰할 수 있는 전도성에 대 한 검사를 반복. 전극 준비, 관련 cathodal 자극 (즉, 대뇌 피 질의 대상 영역 음극) 하기 전에 전극의 수돗물은 절대적으로 중요 한 자극 중 염소의 피로 의해 독성 구축으로 이어질 것입니다 이후 전기 화학 반응 그리고 이차 원인 조직 손상입니다. 우리의 경험에서는, 염소의 피로 자극의 첫번째 20 분 이내 발생 하지 않습니다. 그와 반대로, 반복된 anodal 자극 하기 전에 양극에서 증 착 Ag/Cl 자극의 중지를 피하기 위해 제거 되어야 합니다. 전도성 전극 준비 뿐만 아니라 tES 소켓의 외과 이식의 질 뿐만 아니라, 설치류의 실제적인 자극 세션에만 관계 하지 않는 중요 한 포인트입니다. 전류 밀도의 정확한 예측에 대 한 수술 절차 동안 주변의 두개골과 조직 지역 tES 소켓의 폐쇄를 보장 합니다. 인접 조직을 따라 전철과의 한 반면에, 두뇌에 적용 된 전류에 지도 하 고 왜곡의 현재 흐름 방향에 따라 생리 적인 결과 변경할 수 있습니다. 반면에, 자극의 감소-Ag/Cl 증 착 (위 참조) 하거나 tES 동안 자극 영역의 범위 (예를 들어, 아크릴 시멘트 또는 histoacrylic 접착제로) 이식 소켓-적용의 과소를 이어질 수 있습니다 전류 밀도, 그리고 감소 된 영역을 통해 자극 실수로 높은 피크 전류 밀도 의해 단순히 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 전도성 매체, 예를 들어, 염 분, 최적의 자극 영역 지속적인된 자극에 대 한 허용을 통해 배포 될 필요가 있다. 지속적인 실험 중 변경 된 계수는 다음과 같이 표시 될 수 있습니다: (긴장의 표시, 특정 작업에 가변 성능), 설치류의 예기치 않은 동작이 변화는 전기의 암페어 미터에 표시 된 현재 배달 회로, 또는 자극 연속성의 완전 한 손실입니다. 이 경우에, 전극 선 서에서 청소 한다 고 어떤 파편 든 지에 대 한 자극 영역 다시 검사 해야 합니다. 케이블 연결, 해당 소켓 및 전도성 매체에서 tES 전극의 배치 확인 하 고 때 게재 역 기능을 대체 한다. TES 배달 일관성이 있었다면,이 특정 세션의 얻은 데이터 (예를 들어, 동작, 조직학) 분석에서 제외 해야 합니다.
Neurodegeneration에 대 한 임계값 경고 쥐 (게시 되지 않은 데이터)의 cathodal 및 anodal 세션은 안전 하 고 잘 용납 경고 설치류에 31.8 A/m ² (0.4에 해당 아래 농도에서 최대 20 분 연속 자극을 사용 하는 경우 결정 4 m m 직경 transcranial 전극과 mA), 그리고이 프로토콜에서 설명 하는 권장 사항을 준수 하는 경우. 그러나, 인간의 자극 매개 변수를 가까이 낮은 농도 선택 (0.3-1.6 A/m ²) 또는 선호 복용량 책임se 실험 취득된 데이터의 유익한 특성을 최대화 하 고 인간의 응용 프로그램에 결과의 앞으로 번역을 촉진 하기 위하여 추천 된다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연구 재단 (DFG 다시 2740/3-1)에 의해 지원 되었다. 우리가 주문 품 tES 설정 및 DC-자극 기의 사내 생산에 대 한 프랭크 Huethe와 토마스 귄터 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softasept N | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
3887138 | antiseptic agent |
| Ethanol 70 % | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | T913.1 | |
| arched tip forceps | FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland | 11071-10 | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 15914 | |
| Scalpel Handle #3, 13cm | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500236 | |
| Standard Scalpel Blade #10 | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500239 | |
| Zelletten cellulose swabs | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland | 13349 | 5 x 4 cm |
| Isoflurane | AbbVie Deutschland GmbH & Co | N01AB06 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501758 | small scissors |
| cotton swab/cotton buds | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | EH12.1 | Rotilabo |
| Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501241 | surgical clamp |
| electrode plate (platinum) | custom made | Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland | 10x6 mm, 0.15 mm thickness |
| insulated copper strands (~1 mm diameter) | Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany | LITZE BL | electrode cable |
| Weller EC 2002 M soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | EC2002M1D | |
| Iso-Core EL 0,5 mm | FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland | 20970510 | lead free solder |
| MERSILENE Polyester Fiber Suture | Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | R871H | nonabsorbable braided suture, 4-0 |
| Histoacryl | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
9381104 | cyanoacrylate |
| Ketamin 10% | Medistar GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
References
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