Summary
Ce protocole décrit un montage chirurgical pour une prise d’électrode permanente epicranial et une électrode de poitrine implanté chez les rongeurs. En plaçant une deuxième électrode dans la douille, différents types de stimulation électrique cérébrale transcrânienne peuvent être livrés au système moteur chez les animaux alerte à travers le crâne intact.
Abstract
La stimulation transcrânienne électrique cérébrale peut moduler excitabilité corticale et la plasticité chez les humains et les rongeurs. La forme la plus courante de stimulation chez l’être humain est la stimulation transcrânienne courant continu (CDV). Moins fréquemment, la stimulation transcrânienne courant alternatif (TAC) ou la stimulation transcrânienne bruit aléatoire (tRNS), une forme spécifique de TAC à l’aide d’un courant électrique appliqué au hasard dans une plage de fréquences prédéfinies, est utilisée. L’augmentation de la recherche de stimulation de cerveau électrique non invasive chez l’homme, tous deux à des fins expérimentales et cliniques, a donné un besoin accru d’études de sécurité de base, mécaniste, chez les animaux. Cet article décrit un modèle pour la stimulation transcrânienne électrique cérébrale (tES) à travers le crâne intact ciblant le système moteur chez les rongeurs alertes. Le protocole fournit des instructions détaillées pour la mise en place chirurgicale d’une prise d’électrode permanente epicranial combiné avec une contre-électrode implantés sur la poitrine. En plaçant une électrode de stimulation dans la prise d’epicranial, des types différents de stimulation électrique, comparables au CDV, TAC et tRNS chez l’homme, peuvent être livrés. En outre, des mesures concrètes pour tES rongeurs alerte sont introduites. La densité de courant appliquée, la durée de la stimulation et type de stimulation peuvent être choisies selon les besoins expérimentaux. Les mises en garde, les avantages et les inconvénients de cette configuration sont discutés, ainsi que les aspects sécuritaires et tolérabilité.
Introduction
L’administration transcrânienne de courants électriques dans le cerveau (tES) a été utilisée pendant des décennies d’étudier le fonctionnement du cerveau et de modifier le comportement. Plus récemment, appliquer directement des courants, ou moins fréquemment des courants alternatifs (TAC et tRNS), non invasive à travers le crâne intact par l’utilisation de deux ou plusieurs électrodes (anodes et cathode(s)) a acquis un intérêt scientifique et clinique. En particulier, STD a été utilisé dans plus de 33 200 sessions de sujets sains et des patients atteints de maladies neuropsychiatriques et a émergé comme un coffre-fort et facile, application de chevet rentable, avec potentiel thérapeutique possible mais aussi de longue durée effets sur le comportement1. Cela a clairement donné le besoin accru et l’intérêt scientifique pour des études mécanistes, y compris les aspects de sécurité. Cet article se concentre sur la forme plus couramment utilisée de la stimulation, Std.
Selon les espèces, tDCS module excitabilité corticale et la plasticité synaptique. Changements d’excitabilité ont été signalés comme dépendante de polarité altération du taux de décharge neuronale spontanée dans les rats et les chats2,3,4, ou comme des changements de moteurs amplitudes de (MEP) des potentiels évoqués chez les humains et les souris ( tous deux augmenté après anodiques et une diminution après tDCS cathodiques : humain5,6; souris7). DCS anodiques ont augmenté l’efficacité synaptique du cortex moteur ou hippocampe synapses in vitro pendant plusieurs heures après stimulation ou potentialisation de long terme (LTP), lorsque appliquées conjointement avec un apport spécifique de synaptique faible ou lorsqu’il est administré avant une plasticité induire la stimulation8,9,10,11,12. En conformité, les avantages de la stimulation sur la réussite de la formation motrice ou cognitive sont révèlent souvent seulement si STD est appliquée conjointement avec formation8,13,14,15. Bien que ces résultats antérieurs sont attribués principalement aux fonctions des neurones, il convient de noter que les cellules non neuronales (glia) peuvent aussi contribuer à effets fonctionnels du CDV. Par exemple, taux de calcium intracellulaire astrocytaires augmentent tDCS anodique en alerte souris16. De même, tDCS anodique à des densités de courant inférieures au seuil pour la neurodégénérescence induite par une activation de dose dépendante des microglies17. Toutefois, la modulation des interactions neurone-glie par tDCS doit être une enquête spécifique.
Prises ensemble, animale recherche avancée clairement notre compréhension de l’effet modulatrice de TDC sur l’excitabilité et de la plasticité. Cependant, il y a une observable « écart translationnel inverse » à l’augmentation exponentielle des publications d’études tDCS humaine contraste avec la lenteur et la légère augmentation dans les enquêtes sur les mécanismes sous-jacents de tES dans in vitro et in vivo des modèles animaux. En outre, rongeurs tES modèles sont effectuées avec une variabilité élevée dans l’ensemble des laboratoires de recherche (allant de transdermal epicranial stimulation) et procédures de stimulation signalés ne sont souvent pas totalement transparents qui entravent la comparabilité et reproductibilité des données de la recherche fondamentale ainsi que l’interprétation des résultats.
Ici, nous décrivons en détail la mise en œuvre chirurgicale d’une machination de stimulation transcranienne cerveau ciblant le cortex moteur primaire, ce qui permet la traduction de la condition humaine tDCS tout en minimisant la variabilité et permet une stimulation répétée sans comportement gênant. Un protocole étape par étape pour tES ultérieurs chez les rats alertes est fourni. Les auteurs discutent des aspects méthodologiques et conceptuels d’application sûre de tES rongeurs alerte.
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Protocol
pour la recherche impliquant des animaux, les approbations (spécifique au pays) pertinentes doivent être obtenues avant d’entreprendre des expériences. Toutes les expériences sur des animaux présentés ici sont effectuées selon la directive 2010/63/UE, la Loi sur la protection animale allemand mis à jour (" Tierschutzgesetz ") de juillet 2013 et les règlements de la recherche animale allemand mise à jour d’août 2013. Protocoles animales ont été approuvés par les autorités locales " Commission pour l’expérimentation animale du Conseil régional de Fribourg " et " Commission pour l’expérimentation animale de l’University Medical Center Freiburg ".
1. préparation de l’Instrumentation et du matériel pour chirurgie
- Assurez-vous que celles indiquées dans la Figure 1 sont disponibles et déjà placé pour chirurgie.
- Préparer une plaque mince de platine rectangulaire (par exemple, 10 x 6 x 0,15 mm), qui servira la contre-électrode placée sous la peau sur la poitrine et percer deux petits trous dans deux coins opposés de la plaque.
- Souder un câble isolé avec une longueur d’environ 10 cm à l’aide d’une soudure sans plomb étain à l’un des coins (sans trous) de la plaque platine.
- Appliquer une petite goutte de colle histo-acrylique sur le joint de soudure pour isolement.
2. Préparation du rongeur pour chirurgie
- attribue un numéro de l’étude pour les rongeurs et l’indiquer sur la chirurgie préparée Cardinal
- Peser le rongeur et noter le poids sur la carte de la chirurgie. Calculer la dose d’anesthésique d’injection (p. ex., la kétamine 100 mg/kg de poids corporel plus xylazine 70 mg/kg de poids corporel chez le rat).
- Induce anesthésie par injection intrapéritonéale (i.p.) du montant calculé des anesthésiques.
Remarque : Lors de l’utilisation de l’anesthésie par inhalation à la place (p. ex., isoflurane), placer le rongeur dans une chambre à induction avec un flux continu d’environ 4 % d’oxygène de 1 à 2 L/min. - Contrôle de profondeur de l’anesthésie par le réflexe de pincée d’orteil à partir 5 min après injection. Si le réflexe de pincée d’orteil est toujours présent, atteindre le prolongement et l’approfondissement de l’anesthésie par injection de 30 % de la dose initiale.
- Si à tout moment dans l’expérience renvoie le réflexe de pincée d’orteil, 30 % de la dose initiale de l’anesthésie doit être injecté.
- Lors de l’utilisation de l’anesthésie par inhalation, Rechercher perte du réflexe postural du rongeur dans la chambre de l’induction et vérifier la profondeur de l’anesthésie par l’absence d’un réflexe de pincée d’orteil. Si les réflexes sont toujours présents, prolonger la durée de la chambre de l’anesthésie. Tout au long de l’expérience entière, adapter le pourcentage d’isoflurane à la profondeur de l’anesthésie jusqu'à arriver à une concentration de maintenance d’isoflurane ~1-1.5%.
- En cas de la fréquence respiratoire diminue et haletant, diminuer le pourcentage ; lorsque le rongeur regagne le réflexe de pincée d’orteil ou montre le mouvement spontané, augmenter le pourcentage des anesthésiques par inhalation.
- , Dès que les réflexes sont absents, placer le rongeur sur le banc de laboratoire ou tenez-le dans la main.
Remarque : Lors de l’utilisation de l’anesthésie par inhalation, fournir un débit continu isoflurane réduite (maintenant entre 2-3 %) en utilisant un embout relié à la nébulisation. - Enlever les poils sur le rat ' s la tête en se rasant la zone jusqu’aux oreilles et entre le niveau des yeux rostral juste derrière les oreilles avec une tondeuse. Puis enlever les poils sur la poitrine en se rasant la zone située entre les pattes antérieures de la xiphoïde jusqu'à les clavicules.
NOTE : Garder la peau sous tension facilite le rasage. - Couvrir les yeux du rat avec une goutte de pommade ophtalmique pour protéger la cornée.
- Marquer le rat ' oreille s selon le nombre d’étude attribuée.
Remarque : Selon la durée de l’étude, une marque de la queue peut être suffisante, sinon le fléchage normalisé est préférable.
3. Intervention chirurgicale : Poitrine électrode Implantation
Remarque : cette étape peut être sautée lorsque la contre-électrode est placée à l’extérieur sur la poitrine rasée avec un gilet.
- Lieu le rongeur enclin (sur la poitrine) sur la table d’opération.
Remarque : En cas d’anesthésie par inhalation, garder le rat ' museau s placée dans l’embout de l’anesthésie, réduisant la concentration de l’isoflurane à 1,5 à 2 %. - Désinfecter cuir chevelu rasé avec un spray désinfectant ou avec un coton tige imbibé d’antiseptique (par exemple, éthanol 70 %) et laisser sécher à l’air. Répéter deux fois.
- Couper la peau avec un scalpel dans une ligne de niveau des yeux rostral au milieu niveau oreille.
Remarque : Ceci permet pour le tunneling de raccordement de l’électrode implantée poitrine vers le haut de la tête et est également la coupe désirée pour l’emplacement de prise des électrodes DCS. - Tourner le rat à la position couchée, afin que la poitrine soit exposée.
- Désinfecter la peau de la poitrine, comme décrit à l’étape 3.2.
- Élever la peau latérale de la poitrine droite avec un forceps de tissu et couper une boutonnière avec des petits ciseaux d’environ 0,5 cm médiale de l’aisselle droite. Puis faites une coupe sagittale tout droit dans l’orientation crânienne avec les ciseaux.
- Former une poche sous-cutanée par atraumatically déconnecter la peau le muscle pectoral majeur gauche. Le faire en ouvrant à plusieurs reprises les petits ciseaux (ou un coton-tige imbibé de saline).
- Mettez l’animal sur le côté droit de tunnel le chemin de câble depuis le coin gauche occipital de la peau tête ouverte le long du cou jusqu'à la sortie dans la poche pectorale en pénétrant dans le fascia superficiel avec une pincette homéostatique.
- Ouvrez soigneusement le forceps homéostatique pour attraper l’extrémité du câble électrode attachée à l’électrode de platine sans qu’ils s’éloignent pointus. Tirez le câble à travers le tunnel jusqu'à ce que l’électrode pénètre dans le sachet, orienté avec le brasage pointent vers le membre postérieur gauche de rongeurs. Remettez les rongeurs à la position couchée.
- Fixer la plaque platine avec une suture non résorbable tressée synthétique stérile au fascia pectoral sur les deux s’opposant à des trous d’angle (4-5 noeuds sont recommandés pour la stabilité).
- De même fixer le câble à l’aponévrose d’un noeud lâche, formant une boucle avant l’entrée du tunnel.
- Fermer la peau avec des sutures cutanées 3-4 selon la taille de la coupe (le même matériel de suture peut être utilisé que pour l’électrode et le câble).
4. Intervention chirurgicale : Placement de la Epicranial de tES prise
- Place l’animal dans un cadre stéréotaxique.
Remarque : Si l’utilisation de l’anesthésie par inhalation, abaisser la concentration de l’anesthésique à un flux d’isoflurane entretien de ~1.5-1 %, ajusté à l’orteil pincée réflexe et la respiration. - Désinfecter le cuir chevelu rasé comme décrit à l’étape 3.2.
- Couper la peau avec un scalpel dans une ligne de niveau des yeux rostral au milieu niveau oreille.
Remarque : Si la poitrine électrode placement s’est déroulée, 4.2 et 4.3 des mesures ont déjà été réalisées.
Swaps de - gratter hors le périoste (tissu conjonctif sur le crâne) sur les côtés avec le scalpel et bien essuyer avec du coton. Fixer le tissu conjonctif aux 4 coins de la coupe avec des colliers bouledogue et laissez-les pendre latéralement pour garder le domaine de la chirurgie ouverte.
- Appliquer 0,9 % sérum physiologique pour nettoyer la surface osseuse et les tissus avec des cotons-tiges. Ensuite, nettoyez la surface osseuse avec 3 % H 2 O 2. Éviter tout contact avec les muqueuses. Par les présentes, l’os sont plus soigneusement nettoyés et saignements mineurs de l’os seront arrêté. En outre, les résidus du périoste deviennent visibles. Enlever ces résidus avec un coton-tige en exerçant une pression modérée.
Remarque : Suppression des résidus périoste augmentera adhérence et la durabilité de la prise de tES collée sur l’OS.- En cas de saignement imparable, utiliser une perceuse bone et touchez-le pour 1-3 s avec une légère pression sur l’OS. Ce procédé mécanique s’arrête le plus souvent le saignement sans chauffage significatif. N’utilisez jamais de bistouri électrique sur l’OS ; même brève application entraînera des lésions tissulaires cérébrales (électrocautérisation doit uniquement être utilisée pour plaie tissulaire saignement).
- Comme les vis de fixation vont améliorer l’adhérence de l’installation, choisissez une mèche à l’ajustement de la taille de la vis. Placez les deux trous de burr sur deux plaques de différents OS de pré-perçage avec une perceuse à main, puis par l’application légère pression verticale avec la perceuse bone. Éviter la proximité immédiate de la position désirée de la douille pour tES il pourrait gêner vissage dans l’électrode (par exemple, pour la gauche tES cortex moteur primaire, choisir la position de la vis pariétale droite frontale et postérieure).
- Dans le cas d’une contre-électrode implantés, burr un troisième trou situé dans l’os pariétal postérieur droit pour la future fixation du câble tunnelé.
- Placer les vis en plastique dans les trous de burr et visser jusqu'à ce que le premier frottement se fait sentir. Puis effectuez trois tours de vis supplémentaires à 180 °. Vérifiez avec une pince pour la stabilité de la vis et un tour de plus, si pas assez serré.
Remarque : Pour les rats adultes cela garantira péridurale mise en place des vis sans endommager la dura ou du cerveau (selon le modèle de filetage de la vis, le virage numéro peut varier). L’utilisation de vis en acier inoxydable devrait également être possible, puisque même à DCS les densités de courant au-dessus du seuil de neurodégénérescence, position des vis ne pas perturber la localisation de la lésion ou l’étendue sous les vis. - Tournant sur le fer à souder et préchauffer pendant environ 5 min. enrouler le câble sortant du tunnel occipitally autour de la vis pariétal droit et puis coupez-le, en laissant environ 1 cm de câble derrière l’enroulement. Soigneusement le dénuder le câble avec un scalpel fin.
- Fixer le câble poussif à la vis et l’OS avec de la colle PHOTOABSORBANTS.
- Appliquer une petite quantité de la soudure étain sans plomb au connecteur et aux fils dénudés du câble électrode compteur et raccorder les deux en appuyant brièvement sur les deux pièces de pré soudées ensemble tout en touchant la panne jusqu'à ce que la soudure étain fonde (environ 2-3 s). Retirer la panne immédiatement pour éviter un réchauffement excessif métallique du câble avec des lésions tissulaires subséquentes.
- Ramasser la prise d’électrode personnalisé fait tES ( Figure 1 b, en rouge) avec une pince pointe courbée et dentelée et appliquer une fine couche de colle de PHOTOABSORBANTS jusqu’au bord inférieur de la douille. Pour l’emplacement au-dessus du cortex moteur et à l’aide d’une douille de diamètre 4 mm, placer le point de prise milieu à 2 mm antérieure et latérale de 2 mm de la bregma. Pour ce poste, la frontière médiale de la douille doit finir directement la suture sagittale et la frontière caudale devrait se terminer à la hauteur du bregma. Appuyez sur la prise brièvement sur l’OS (la plupart des colles PHOTOABSORBANTS durcissent par pression).
NOTE : Placer une source lumineuse directement au-dessus de la douille peut soulager en plaçant la prise. - Veiller à ce que l’os dans la zone de la douille est libre de la colle (en vérifiant avec la lumière parce que la colle est le reflet). Dans le cas de colle déversements, retirer la douille, gratter la colle avec le scalpel et répétez l’étape 4.12.
- Après la prise de courant est en place et la zone de stimulation ultérieure est exempte de colle, tout d’abord sceller le bord latéral de la douille aux tissus voisins avec une petite goutte de colle PHOTOABSORBANTS pour éviter un pont liquide qui pourrait conduire à la manœuvre du courant à cet endroit. N’appliquez pas trop de colle car elle peut s’écoule dans la zone de stimulation (dans ce cas, retournez à l’étape 4.12).
NOTE : Garder la zone de stimulation exempte de colle est cruciale car une réduction de la zone de stimulation pourrait augmenter considérablement la densité de courant (A/m²). - Couvrir toutes les vis avec de la colle PHOTOABSORBANTS.
- Mélanger le ciment acrylique dentaire bi-composants dans un tube en silicone petits ou en verre. Dès qu’il devient visqueux, l’appliquer avec une spatule dentaire pour assurer l’étanchéité des frontières restants de la prise jusqu'à l’OS. Éviter tout écoulement de ciment acrylique dentaire dans la zone de stimulation.
- Enfin couvrir le crâne entier vis, câble d’électrode de compteur et la douille jusqu'à ⅓ de la douille avec ciment acrylique dentaire. Veiller à ce que le ciment ait la viscosité correcte : si trop liquide, il s’écoule dans les tissus environnants ; Si trop dur il est difficile de le distribuer uniformément.
- Quand tout l’OS est couvert et le ciment est durci, retirer les pinces de bouledogue ; la peau devrait toucher le ciment bâti pour que la suture n’est pas nécessaire. (Si la première coupe a été choisi trop long et le tissu conjonctif ou musculaire est visible, appliquer une suture comme indiqué au point 3.12).
- , Appliquer une couche d’iode avec un tampon de coton autour de la bordure de la peau coupée et injecter par voie sous-cutanée carprofène (5 mg/kg de poids corporel dissous dans 5 à 7,5 mL de sérum physiologique 0,9 % pour le remplacement de liquide et de traitement de douleur).
Remarque : Si vous utilisez l’anesthésie par inhalation, éteignez-le maintenant. - Placer le rongeur dans une boîte de réchauffement de la planète pour la récupération de l’anesthésie, jusqu'à ce que le rongeur est éveillé et la stabilité posturale est rétablie.
Remarque : Vérifier l’animal ' développement de s de poids, plaie critères de bien-être de l’État et générales par jour selon l’institution ' Recommandation s.
5. Procédure de Stimulation transcrânienne électrique
Remarque : anesthésie affectent les tES effets, effectuer la stimulation chez les rongeurs alertes chaque fois que possible est recommandée. Permettre le rongeur à récupérer pendant au moins 5 jours (la guérison de la plaie de la tête et la poitrine) avant de commencer les expériences. Expériences peuvent être effectuées aux périodes antérieures après la chirurgie, lorsque vous utilisez une contre-électrode externe fixé avec un gilet, car la plaie de la poitrine est plus irritable ; mais les animaux doivent être habitués à la veste de l’électrode pendant plusieurs jours et interférence avec des tâches comportementales peut-être se produire.
- Remplir la douille d’électrode de tES moitié avec la solution saline à 0,9 % et enlever les bulles d’air.
- Êtrefore tDCS cathodiques sessions, toujours vérifier la chloration et le cas échéant (par exemple, une surface argentée brillante), re-chlorer l’électrode Ag/AgCl. Avant les sessions tDCS anodiques, éliminer les possible excès AgCl dépôts des stimulations précédentes avec papier de verre pour permettre une bonne conductivité durant la stimulation. Visser le bouchon à vis tES électrode ( Figure 1 b, morceau gris).
ATTENTION : Défaut de ré-chlorer l’électrode entre les sessions tDCS cathodiques conduira jusqu'à épuisement de la chloration pendant la stimulation et à accumulation toxique par réaction électrochimique. Cela va entraîner des lésions tissulaires. La chloration n’est pas nécessaire dans une seule session si la durée de la stimulation est de moins de 20 min. - Connecter les câbles aux deux connecteurs sur la tête (pour la stimulation anodique, le câble anodique est connecté au connecteur sur le bouchon à vis, pour la stimulation cathodique, il est opposé).
Remarque : Lorsque vous utilisez une contre-électrode placés à l’extérieur, elle recouvre la contre-électrode avec gel conducteur et placez-les sur les rongeurs ' poitrine s. C’est plus facile si l’électrode est préalablement fixé dans un petit gilet de rongeur, qui le rongeur peut porter durant la stimulation. - Place le rongeur dans la cage expérimental, avec les câbles connecté à un émerillon au-dessus de la cage qui permet le mouvement gratuite.
- Allumez le stimulateur et ajustez les paramètres de stimulation (intensité de stimulation, la durée, rampe et descendre de temps).
- Quand ne pas utiliser un appareil de stimulation disponibles dans le commerce avec une sécurité arrêter et l’alarme de déconnexion, inclure un compteur dans le circuit pour vérifier le flux de courant constant.
Remarque : Avec cette configuration, la stimulation peut être appliquée au cours de performances ou de la formation de tâches comportementales. - Recherchez les signes de stress ou d’inconfort du rongeur pendant la stimulation.
- Après la fin de la stimulation, déconnectez les câbles, dévisser le bouchon de l’électrode sur la tête et nettoyer et sécher la prise avec un coton-tige. Retourner les rongeurs à l’environnement familial ou de procéder à une procédure comportementale si vous le souhaitez.
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Representative Results
La mise en œuvre décrit d’un set-up pour fiable tES répétées chez les rongeurs alertes peut être intégré facilement dans expériences mécanistes, études dose-réponse ou des expériences, y compris des tâches comportementales. A ce jour, la comparabilité des données provenant d’études animales à l’aide de tES (non invasif) est entravée par la variabilité des configurations de stimulation tES entre laboratoires et par des différences dans les paramètres de stimulation (par exemple, différentes densités de courant appliquées au exorbitants des niveaux élevés par rapport à l’application humaine). Par conséquent, la valeur informative de la recherche animale dans le domaine de tES est limitée. Cet article présente une configuration de tES facile à normaliser dans des laboratoires en mettant en œuvre le positionnement de l’électrode « actif » sur l’os au-dessus du cortex ciblé (ici, surtout le cortex moteur primaire (M1)) avec une solution saline comme préférable conductrice moyen et la contre-électrode placé sur la poitrine (à l’extérieur ou à implanter).
Étant donné la petite taille des rongeurs, plaçant l’électrode au-dessus du cortex ciblé sur la peau du rongeur peut entraîner d’accrochage excessive, particulièrement lorsque la contre-électrode est placée à proximité immédiate, par exemple, dans le cou (pour des exemples de modélisation actuelle Voir la Figure 3 (adoptée de référence1)). En outre, la stabilité et l’électrode de contact est moins fiable et rongeurs sont plus irrités par le placement des électrodes répétées sur le cuir chevelu lorsque vous utilisez une application transdermique. La fixation d’une installation non permanents peut-être aussi entraver le rongeur d’exercer librement. En revanche, les rongeurs adapter rapidement à cette configuration implantée présente en permanence.
L’estimation d’une intensité de stimulation équivalente par rapport aux paramètres de stimulation humaine est difficile car les modèles peuvent uniquement prendre en compte un nombre limité de facteurs et de rongeurs sont pachygyric (voir référence1 pour l’estimation d’un entartrage Factor). Collecte de données dose-réponse, y compris des courants de faible intensité peut donc être plus informatif. Avec l’installation chirurgicale présentée lors d’une étude de dose-réponse chez des rats anesthésiés, l’activation microgliale dose-dépendante qui survivra à la période de stimulation (stimulation après 24h) a été démontrée et dissociables de neurodégénérescence qui se produisent à haute intensité DCS (Figure 4; adopté de référence17). L’activation microgliale, évaluée par l’altération morphologique, s’est produite tout d’abord à 31,8 A/m² (Figure 4), tandis que les premiers signes de neurodégénérescence ont été détectés à 47,8 A/m². Dans ces expériences, l’anesthésie a clairement affecté l’ampleur de la réaction aux contrôleurs de domaine comme le pourcentage des tranches de cerveau avec fluorojade C (FJC) positif dégénérescentes les neurones chez les rats alertes était supérieur à 47,8 A/m² (Figure 4 a). Comme le seuil de ≥ 24 h durée d’activation microgliale est proche du seuil de la lésion, mais considérablement au-dessus les intensités qui font la promotion des processus cognitifs et plastique physiologiques chez l’homme, cette activation peut indiquer plutôt une inflammation pre-lesional induite par les contrôleurs de domaine. Par conséquent, des effets comportements ou moléculaires de DCS à ces fortes intensités sont censés être mécaniquement différents par rapport aux effets de faible intensité (voir le schéma résumant les effets et les intensités des expériences de CDV à la Figure 5).
Figure 1 : fournitures pour la chirurgie et le schéma technique de la prise de tES et l’électrode cap unité (A) 1. Coton-tiges, 2. désinfectant, 3. cadre stéréotaxique, 4. fer à souder, 5. analgésique (p. ex., carprofène), 6. & 7. anesthésiques (p. ex. xylazine & kétamine), 8. seringue, 9. Clipper, 10. perforateur de l’oreille, 11. pommade ophtalmique (p. ex., bepanthene), 12. étain sans plomb-étain, 13. deux composants dentaire ciment acrylique (DAC), 14. iode, 15. 3 % H2O2, 16. solution saline à 0,9 %, 17. synthétique tressée suture non résorbable (p. ex., Mersilene 4-0), 18. mèches, 19. colle de PHOTOABSORBANTS, 20. clamps Bulldog 21. forceps homéostatique, 22. pinces à pointe courbée et dentelée, 23. pinces de bout droit, pointu, 24. droite, forceps tissue, 25. dentaire spatule, 26. bistouri, 27. ciseaux, 28. Perceuse à main, 29. tournevis, 30. moteur de forage, 31. connecteurs femelles, 32. tES prise, 33. carré d’électrode de platine attaché au câble, joint de soudure recouvert de colle histoacrylic, 34. vis en plastique. (B) tES prise (rouge) pour la fixation sur le crâne de rongeur dont le diamètre intérieur de 4 mm ; l’unité de l’électrode (gris) est construite par un bouchon à vis et un tampon interne avec un trou central, laissant la place pour le câble de l’électrode Ag/Cl de disque, qui est collée au fond du timbre. Cela permet une stabilité maximale de l’installation et éviter les sauts de fil sur le point de connexion fil-électrode sensible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Rats équipée de tES établissement. Le rat sur la gauche est équipé d’une contre-électrode externe fixe sur la poitrine rasée. L’électrode de caoutchouc carbone est cousu au bas de la veste. Le rat sur le droit a une électrode implantée poitrine avec le câble en tunnel à la tête. Le connecteur femelle attaché au câble (caudal) est fixe au sein de l’unité de ciment acrylique dentaire construit derrière la prise pour l’électrode de tES (rostral). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : modélisation de la répartition du courant dans deux montages différents tES rongeurs. Modèles d’éléments finis prédire le débit actuel de cerveau en deux modèles de rat avec epicranial tDCS montages, modifiés avec autorisation1. En utilisant ces modèles, la densité de courant de seuil prévu cerveau pour induire des lésions corticales a 17,0 A/m² pour le montage utilisé par Fritsch, et al. 8 (A) et 6,3 A/m² pour le montage de Rohan, et al. 21 (B), correspondant aux champs électriques de 61 et 23 V/m, respectivement. Notez les différences dans la configuration actuelle de flux des deux montages différents. (A) une densité de courant plus élevée pendant une période plus courte est appliquée, ayant pour résultat une densité de charge inférieure à celle en (B). Surtout le placement de la contre-électrode (cou et poitrine) pourrait avoir un impact supplémentaire sur le flux de courant de cerveau qui en résulte. Pour l’interprétation des données de rongeurs, la spécification de la taille de l’électrode, le courant de placement (les deux électrodes), appliqué et durée de la stimulation est donc nécessaire. Notez que le courant réel dans le cerveau de rat ne peut être estimé à l’aide de ces modèles de calcul. Échelle de couleur indique la densité de courant de zéro à 11,6 A/m² et ci-dessus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : effets de Dose réponse des contrôleurs de domaine sur l’activation de la microglie et neurodégénérescence dans des tranches de cerveau obtient après des doses différentes d’anodiques tDCS appliqué au cortex moteur primaire. La figure est modifiée du17 résumant les conclusions d’une étude de dose-réponse tDCS immunohistological. (A) Relation entremorphologiquement activé microglie évalué par anti-CD11b/c coloration (voir note ci-dessous) et neurodégénérescence révélé par la positivité de la FJC. Tranches de cerveau cortical moteur de rat ont été évaluées par un détective aveugle soit comme anti-CD11b/c et FJC coloration négative, comme anti-CD11b/c positive seule (détection d’activation a déterminé morphologiquement) ou anti-CD11b/c et FJC positives. Notez que l’activation microgliale précédé occurrence de la neurodégénérescence. (B) les sections coronales représentant des tranches de cerveau cortical moteur gauche (à ou près de +1,56 mm à partir du bregma) chez des rats exposés à différentes intensités d’anodiques tDCS appliqué au cortex moteur primaire. Chez des rats anesthésiés, pas de signes de neurodégénérescence a eu lieu à 31,8 A/m², tandis que quelques neurones dégénérescentes étaient présents à 47,8 dommages A/m² et neuronaux encore augmenté avec la dose. De noter que DCS anodique à 47,8 A/m² chez les rats alertes a augmenté le pourcentage des tranches avec la neurodégénérescence. Barre d’échelle pour toutes les sections : 500 µm. grossissement entrée barre d’échelle pour toutes les sections : 20 µm. (C) histologique exemples d’images de la notation de l’activation de la microglie en immunohistochimie anti-CD11b/c, comprise entre 0 (non activé) et 4 (fortement activé ), 1-4 ont été notés comme « positif ». Barreaux de l’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : schéma illustrant la relation entre l’actuellement utilisé tDCS rongeurs des densités de courant par rapport à l’application humaine : seuils pour l’inflammation, neurodégénérescence et la modulation des processus physiologiques à des durées de stimulation de jusqu'à 30 min. Actuellement utilisé rongeurs DCS des densités de courant compris entre 1,3 et 143 A/m² avec la majorité des études à l’aide de plus de 20 A/m², tandis que les densités de courant dans la plupart des études sur les humains sont de 0,3 à 0,8 A/m²1,14. Paramètres de stimulation humaine sont au moins un ordre de grandeur inférieur au seuil d’une neurodégénérescence1. Seuil de neurodégénérescence est significativement plus élevée sous anesthésie, lors de l’excitabilité corticale est supprimé17. Une durée d’activation microgliale commence au-dessous mais proche les intensités induisant des lésions neuronales17. Enquête de moduler les effets des contrôleurs de domaine sur les processus cérébraux physiologiques à des intensités plus élevées sous le seuil de la lésion sont probablement différentes de thèses vus à de très faibles intensités (comparables à l’application humaine). La traduction exacte des paramètres de stimulation entre les espèces est sous enquête. Les estimations sont entravées par des facteurs comme la taille et l’anatomie (sillons et circonvolutions) passives, mais aussi par des sensibilités différentes possibles aux champs électriques des neurones, cellules gliales et réseaux selon les espèces (on ne sait pas si le débit du courant même conduirait à la même effet physiologique). Par conséquent, le plan d’étude plus informatif teste tES effets de manière dose réponse, y compris de très faibles intensités de courantes. Le régime est fondé sur les données de7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (durée de la stimulation maximale de 30 min par séance, données sont des modèles animaux de maladies exclues). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit les matériaux typiques et les étapes de la procédure chirurgicale réalisation d’une installation permanente de tES, ainsi que pour la stimulation ultérieure chez les rongeurs alertes. Au cours de la préparation d’un rongeur tES expériences, plusieurs aspects méthodologiques (innocuité et la tolérabilité du tES, paramètre de résultat) ainsi que des aspects conceptuels (comparaison avec la condition humaine, les effets attendus de la stimulation sur un cerveau particulière région) il fallait prendre en considération. D’un point de vue méthodologique, la mise en place chirurgicale de la douille de tES crânienne avec la contre-électrode poitrine implanté est avantageux pour les études longitudinales, puisqu’elle permet pour application en alerte, se déplaçant librement des rongeurs. L’accoutumance du rongeur à la connexion des câbles et la mise en place permanente est nécessaire, mais par la suite, il permet de tES même en combinaison avec des tâches comportementales. En outre, l’inconfort du rongeur pendant la stimulation est probablement inférieur avec ce set-up par rapport à porter une contre-électrode cousue dans un gilet, car les mouvements ne se limitent pas au contact de cas et tissu ancien de l’électrode implantée au cours la stimulation est assurée.
Le montage présenté tES a été utilisé pour des expériences 3 mois au maximum, sans discontinuité de câble d’électrode, instabilité matérielle ou une infection. Il est donc probable que la mise en place est également adapté pour des expériences plus de cette période.
Ce montage de stimulation epicranial empêche de triage excessif par l’intermédiaire de structures dermiques, qui se produit probablement à une plus large mesure chez les rongeurs, compte tenu de la relation d’électrode à la taille du corps (voir Figure 3 et référence1). Le set-up implanté pour la stimulation de l’epicranial chez les rongeurs permet de grande praticité pour expériences en se déplaçant librement des animaux, une définition claire des positions de l’électrode et la fiabilité de livraison actuel. Bien que ces facteurs représentent des atouts majeurs pour la normalisation des expériences, l’écart à la stimulation percutanée chez les humains ou les rongeurs (par exemple, fait référence à32,33) devrait garder à l’esprit. Cependant, pour la traduction des résultats, le montant réel du courant atteignant le cerveau (densité de courant de cerveau), indépendant du passage par le biais de différents tissus, est d’intérêt majeur pour34. Placement de la contre-électrode détermine généralement la direction et la distribution du débit actuel1. Ainsi, pour polarisation des neurones, un placement de la contre-électrode sur la poitrine (dorsoventral sens de circulation du courant) peut être plus efficace par rapport au placement dans le cou (Rostro direction de courant).
Études portant sur les mécanismes sous-jacents de tES ou ses effets sur le comportement devraient si possible être effectué chez les rongeurs alertes, puisque l’anesthésie significativement interagit avec (patho)-processus physiologiques, y compris l’activité neuronale35 ,36 et plasticité36,37et peut supprimer ou modifier tES efficacité17(et nos observations non publiées) ou nuire à1,17. Inversement, résultats obtenus chez les rongeurs anesthésiés ne permettent pas une conclusion directe à la condition d’alerte, potentiellement entraver une translation vers l’avant à la recherche chez l’humain. Un exemple des différences de tDCS appliqué au cortex moteur chez des rats anesthésiés et les rats alertes est illustré dans la section résultats représentatifs. tDCS appliqué à tout aussi fortes densités de courant induit un taux plus élevé de l’activation de la microglie et neurodégénérescence dans alertes rats contre les rats anesthésiés17. Alors que ces résultats font partie d’une expérience de la relation dose-effet dans laquelle tDCS effets sur les cellules microgliales et neurodégénérescence venu aux intensités élevées (pas recommandé pour une utilisation dans les études mechanistisch ou comportementales), que c’est tentant que spéculer à courant faible STD densités, le même détournement des résultats se ferait selon la vigilance du rongeur.
Enfin, un autre avantage du protocole fourni est la réduction des sources d’erreurs possibles. Stratégies de résolution des problèmes et des étapes critiques ont été soulignés dans le protocole. Ceux-ci incluent le choix de la densité de courant appropriée à la recherche fin (comme indiqué ci-dessus), la nécessité d’une préparation des électrodes tES avant que chacun applique une stimulation et le soigneusement et répété cocher pour la conductance fiable. En ce qui concerne la préparation de l’électrode, chloration de l’électrode avant la stimulation cathodique (c.-à-d., cathode au-dessus de la zone corticale cible) est absolument cruciale, étant donné que l’épuisement de la chloration pendant la stimulation conduira à une accumulation toxique de les réactions électrochimiques et secondairement cause des lésions tissulaires. Dans notre expérience, épuisement de chloration ne survient pas au cours des 20 premières minutes de stimulation. Au contraire, avant une stimulation répétée anodique, Ag/Cl des dépôts à l’anode doivent être enlevé pour éviter l’arrêt de la stimulation. La conductance est un point critique, qui n’a pas seulement trait à la préparation de l’électrode mais aussi à la séance de stimulation pratique de rongeur, ainsi que la qualité de l’implantation chirurgicale de la prise de tES. Fermeture du socket tES au crâne environnante et zone de tissu devrait être assurée pendant les interventions chirurgicales pour une estimation correcte de la densité de courant. D’accrochage le long des tissus adjacents conduit à une surestimation du courant appliqué au cerveau d’une part et peut modifier les résultats physiologiques basées sur la distorsion de la direction du flux actuel. En revanche, la réduction de la zone de stimulation — dépôts Ag/Cl (voir ci-dessus) ou par la couverture de la zone de stimulation pendant tES prise implantation (par exemple, de la colle acrylique, ciment ou histoacrylic) — peut conduire à une sous-estimation de la densité de courant et stimulation via une réduction de la superficie peuvent conduire à des lésions tissulaires simplement par des densités de courant crête élevée sans le vouloir. Enfin, il faut que le conducteur moyen, par exemple, une solution saline, idéalement répartie sur la zone de stimulation afin de permettre une stimulation continue. Pendant une expérience en cours, la conductance altérée peut devenir visible de la façon suivante : un comportement inattendu du rongeur (signes de stress, performance variable sur une tâche particulière), des variations dans la livraison actuelle affichée sur un ampèremètre de l’électrique circuit, ou une perte complète de la continuité de la stimulation. Dans ce cas, les électrodes doivent être nettoyés de dépositions et la zone de stimulation doit être inspectée à nouveau pour tous les débris. Connexions des câbles, placement des électrodes tES dans la prise et le milieu conducteur doivent être vérifiées et remplacées lorsque apparaissant dysfonctionnel. Si tES livraison ne correspondait pas, les données obtenues (p. ex., comportement, histologie) de cette session particulière peuvent doivent être exclus de l’analyse.
Le seuil de neurodégénérescence déterminée chez les rats alertes (nos données inédites) d’anodiques et cathodiques et sessions sont sûrs et bien tolérés chez les rongeurs alertes, lors de l’utilisation jusqu'à 20 min de stimulation continue à des intensités ci-dessous 31.8 A/m² (équivalent à 0,4 mA avec une électrode de transcrânienne de diamètre 4 mm) et en respectant les recommandations énoncées dans le présent protocole. Cependant, choisir des intensités plus faibles plus près pour les paramètres de stimulation humaine (0,3 à 1,6 A/m²) ou de préférence dose-responsales expériences se sont recommandés pour maximiser le caractère informatif de données obtenues et pour faciliter la traduction directe des résultats de l’application humaine.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche allemande (DFG RE 2740/3-1). Nous remercions Frank Huethe et Günther de Thomas de la production interne de la configuration de tES faits sur mesure et le DC-stimulateur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softasept N | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
3887138 | antiseptic agent |
| Ethanol 70 % | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | T913.1 | |
| arched tip forceps | FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland | 11071-10 | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 15914 | |
| Scalpel Handle #3, 13cm | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500236 | |
| Standard Scalpel Blade #10 | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500239 | |
| Zelletten cellulose swabs | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland | 13349 | 5 x 4 cm |
| Isoflurane | AbbVie Deutschland GmbH & Co | N01AB06 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501758 | small scissors |
| cotton swab/cotton buds | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | EH12.1 | Rotilabo |
| Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501241 | surgical clamp |
| electrode plate (platinum) | custom made | Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland | 10x6 mm, 0.15 mm thickness |
| insulated copper strands (~1 mm diameter) | Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany | LITZE BL | electrode cable |
| Weller EC 2002 M soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | EC2002M1D | |
| Iso-Core EL 0,5 mm | FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland | 20970510 | lead free solder |
| MERSILENE Polyester Fiber Suture | Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | R871H | nonabsorbable braided suture, 4-0 |
| Histoacryl | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
9381104 | cyanoacrylate |
| Ketamin 10% | Medistar GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
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