Summary
Denne protokollen beskriver et kirurgisk oppsett for en permanent epicranial elektrode socket og en implantert brystet elektrode i gnagere. Ved å plassere en andre elektrode kontakten, kan ulike typer Transkraniell elektrisk hjernestimulasjon leveres til motor systemet i alert dyr gjennom intakt skallen.
Abstract
Transkraniell elektrisk hjernen stimulering kan modulerer kortikale excitability og plastisitet i mennesker og gnagere. Den vanligste formen for stimulering hos mennesker er Transkraniell likestrøm stimulering (tDCS). Sjeldnere brukes Transkraniell vekselstrøm stimulering (tACS) eller Transkraniell tilfeldig støy stimulering (tRNS), en spesifikk form av tACS ved hjelp av en elektrisk strøm brukes tilfeldig i en forhåndsdefinert frekvensområdet. Økningen av noninvasive elektrisk stimulering hjerneforskning hos mennesker, både for experimental og klinisk, har gitt økt behov for grunnleggende, mekanistisk, sikkerhet studier på dyr. Denne artikkelen beskriver en modell for Transkraniell elektrisk hjernen stimulering (tES) gjennom intakt skallen målretting motor systemet i alert gnagere. Protokollen inneholder trinnvise instruksjoner for kirurgiske oppsettet av en permanent epicranial elektrode socket kombinert med en implantert counter elektrode på brystet. Ved å plassere en stimulering elektrode kontakten epicranial, kan ulike elektrisk stimulering typer, sammenlignes tDCS tACS og tRNS hos mennesker, leveres. Videre er praktiske skritt for tES i alert gnagere innført. Den anvendt nåværende tetthet, stimulering varighet og stimulering type kan velges avhengig eksperimentelle behov. Advarsler, fordeler og ulemper av dette oppsettet er diskutert, samt sikkerhet og toleranse aspekter.
Introduction
Transkraniell administrasjonen av elektrisk strøm til hjernen (tES) har blitt brukt i flere tiår å studere hjernefunksjon og endre atferd. Mer nylig søker direkte strøm eller sjeldnere vekslende strøm (tACS og tRNS), noninvasively gjennom intakt skallen ved bruk av to eller flere elektroder (anode(s) og cathode(s)) har fått vitenskapelig og klinisk interesse. Spesielt tDCS har blitt brukt i flere 33,200 sesjoner friske og pasienter med nevropsykiatriske sykdommer og har dukket opp som en trygg og enkel, kostnadseffektiv sengen program, med mulig terapeutiske potensial som varer lenge atferdsmessige effekter1. Dette tydelig gitt økt behov og vitenskapelig interesse i mekanistisk studier, inkludert sikkerhetsaspekter. Denne artikkelen fokuserer på den vanligste formen for stimulering, tDCS.
Tvers av arter modulerer tDCS kortikale excitability og synaptiske plastisitet. Excitability endringer er rapportert som polaritet avhengig av endring av spontane neuronal skyte rate i rotter og kattene2,3,4, eller som endringer i motor evoked potensial (MEP) amplituder i mennesker og mus ( både økt etter anodal og redusert etter cathodal tDCS: menneskelig5,6; musen7). Anodal DCS økt synaptic effekten av motor kortikale eller hippocampus synapser i vitro i flere timer etter stimulering eller lang sikt potensiering (LTP), når co brukes med et bestemt svak synaptic innspill eller når gitt før en plastisitet inducing stimulering,8,,9,,10,,11,,12. I samsvar, fordelene ved stimulering på motor eller kognitive opplæring suksess er ofte avslørte bare hvis tDCS er co anvendt med trening8,13,14,15. Mens disse tidligere funn hovedsakelig tilskrives til funksjoner av neurons, bør det bemerkes at ikke-neuronal celler (glia) kan også bidra til funksjonelle virkningene av tDCS. For eksempel økt astrocytic intracellulær kalsium nivåer under anodal tDCS i alert mus16. Tilsvarende indusert anodal tDCS på gjeldende tettheter under terskelen for neurodegeneration en dose avhengige aktivisering microglia17. Men trenger modulering av Nevron-glia interaksjon ved tDCS ytterligere bestemt etterforskning.
Tatt sammen, dyr forskning avanserte tydelig vår forståelse av modulatory effekten av tDCS på excitability og plastisitet. Men er det en "omvendt translasjonsforskning gapet" observerbare i eksplosive økningen i publikasjoner av menneskelig tDCS studier i motsetning til den langsomme og svak økning i undersøkelser av de underliggende mekanismene tES i i vitro og in vivo dyr modeller. I tillegg gnager tES modeller utføres med høye variasjon over forskningslaboratorier (alt fra transdermal til epicranial stimulering), og rapporterte stimulering prosedyrer er ofte ikke helt gjennomsiktig hindre sammenlignbarheten og Replicability grunnleggende forskningsdata samt tolkning av resultatene.
Her beskrive vi i detalj kirurgisk gjennomføringen av et Transkraniell hjernen stimulering oppsett målretting primære motorisk cortex, som lar oversettelse til betingelsen menneskelige tDCS samtidig minimere variasjon, og tillater gjentatte stimulering uten hindre atferd. En trinnvis protokoll for påfølgende tES i alert rotter er gitt. Metodisk og konseptuelle aspekter av trygg bruk av tES i alert gnagere diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
for forskning som involverer dyr, relevante (landsspesifikke) godkjenninger må hentes før eksperimenter. Alle dyreforsøk rapporterte her er utført i henhold til EUs direktiv 2010/63/EU oppdatert tyske Dyrevern loven (" Tierschutzgesetz ") av juli 2013, og oppdaterte tyske Forsøksdyrutvalget forskrift av August 2013. Dyr protokoller er godkjent av lokale myndigheter " kommisjon for dyr eksperimentering av Regional Council i Freiburg " og " kommisjon for dyr eksperimentering University Medical Center Münsterplatz ".
1. forberedelse av instrumentering og materiale for kirurgi
- at elementene som er oppført i figur 1 er tilgjengelig og allerede plassert for kirurgi.
- Forberede en tynn rektangulære platina plate (f.eks 10 mm x 6 x 0.15 mm), som vil tjene som counter elektroden plassert subcutaneously på brystet, og slå to små hull i to motstående hjørner i tallerkenen.
- Loddetinn et isolert kabel med en lengde på ~ 10 cm bruke en blyfri tin-lodd til ett av hjørnene (uten hull) av platina plate.
- Gjelder en liten dråpe histo-akryl lim på lodding felles isolering.
2. Utarbeidelse av gnager for kirurgi
- gi en studie nummer gnagere og merke til dette på forberedt kirurgi kort
- Veier gnagere og merke deg vekten på kortet for kirurgi. Beregne dosen av injeksjon bedøvelse (f.eks ketamin 100 mg/kg kroppsvekt pluss xylazine 70 mg/kg kroppsvekt for rotter).
- Indusere anestesi ved intraperitoneal (IP) injeksjon av det beregnede beløpet av bedøvelse.
Merk: Når du bruker innånding anestesi i stedet (f.eks isoflurane), plassere gnager i en induksjon kammer med kontinuerlig flyt av ~ 4% i 1-2 L/min oksygen. - Sjekk dybden av anestesi ved toe knipe refleks starter 5 min post injeksjon. Hvis tå knipe reflex er fortsatt til stede, nå forlengelse og styrkingen av anestesi ved injeksjon av 30% av den første dosen.
- Hvis på noe tidspunkt i eksperimentet tå knipe refleks returnerer, 30% av den første dosen av anestesi skal injiseres.
- Ved innånding anestesi, se etter tap av den postural refleks av gnagere i induksjon kammeret og sjekk dybden på anestesi for en tå knipe refleks. Hvis reflekser er fortsatt til stede, forlenge varigheten i anestesi kammeret. Gjennom hele eksperimentet, tilpasse andelen isoflurane til dybden av anestesi fram en vedlikehold konsentrasjon av ~1-1.5% isoflurane.
- Når frekvensen av puste reduserer og gisper oppstår, redusere prosentandelen; når gnagere gjenvinner tå knipe refleks eller viser spontan bevegelse, øke prosentandelen av innånding bedøvende.
- Så snart reflekser er fraværende, plasser gnager på lab-benken eller holde den i hånden.
Merk: Når du bruker innånding anestesi, gir fortsatt redusert isoflurane flyt (nå mellom 2-3%) ved hjelp av en dyse koblet til forstøveren. - Fjerne håret på rotte ' s leder ved barbering området fra øre til øre og mellom rostral øyehøyde bare bak ører med en clipper. Deretter fjerne håret på brystet ved barbering området mellom forelimbs fra xiphoid til clavicles.
Merk: Å holde huden under spenning Letter barbere. - Dekker øynene av rotte med en dråpe øye ointment å beskytte hornhinnen.
- Merke rotta ' s øre i henhold til tildelte studere antallet.
Merk: Avhengig av lengden av studien, en hale merke kan være nok, ellers standardisert øremerking anbefales.
3. Kirurgisk prosedyre: Brystet elektrode implantasjon
Merk: denne steg kan hoppet når telleren elektroden er plassert eksternt på barbert brystet med en vest.
- Plass gnagere utsatt (på brystet) på operasjonsbordet.
Merk: Ved innånding anestesi, holde rotta ' s snute plassert i anestesi munnstykket, ytterligere redusere isoflurane konsentrasjonen til 1,5-2%. - Desinfiser barbert hodebunnen med en desinfiserende spray eller en vattpinne dynket i antiseptisk middel (f.eks etanol 70%) og la air-dry. Gjenta to ganger.
- Kutte huden med en skalpell i en linje fra den rostral øyehøyde til midt øret nivå.
Merk: Dette tillater tunnelering til koble kabelen fra implantert brystet elektroden mot toppen av hodet og er også ønsket kuttet for DCS elektrode kontakten plassering. - Slå rotta til supine posisjon, slik at brystet blir utsatt.
- Rense huden på brystet som beskrevet i trinn 3.2.
- Heve lateral huden av det høyre brystet med en tissue tang og kuttet en knapphull med liten saks på ca 0,5 cm mediale fra i høyre armhulen. Deretter lage en rett sagittal kutt i skallen retning med saksen.
- Danner en subcutaneous pose med atraumatically koble huden fra venstre store pectoral muskler. Gjør dette ved å åpne flere ganger den liten saksen (eller saltvann gjennomvåt bomullspinne).
- Slå dyret på høyre side å tunnel kabel banen fra venstre occipital hjørne av åpnet hodet huden langs halsen ut i pectoral posen av gjennomtrengende fascia superficialis bruker homøostatisk tang.
- Nøye åpne homøostatisk tang å fange slutten av elektroden kabelen festet til platina elektroden uten at skarpe ledninger å bortkommen. Trekk kabelen gjennom tunnelen til elektroden i posen, orientert med lodding poenget mot gnagere venstre hindlimb. Slå gnager tilbake til liggende stilling.
- Fikse platina plate med et sterilt syntetiske flettet ikke-absorberbare Sutur til pectoral konseptkjedene på de to motsatte hjørnet hull (4-5 knop er anbefalt for stabilitet).
- På samme måte kobler kabelen til fascia av en løs knute, danner en liten sløyfe før inngangen av vev tunnelen.
- Nær huden med 3-4 kutan suturer avhengig av kuttet (samme Sutur materialet kan brukes som for elektrodeholderen og kabel).
4. Kirurgisk prosedyre: Plassering av Epicranial tES Socket
- sted dyr i en stereotactic ramme.
Merk: Hvis bruker innånding anestesi, lavere konsentrasjon av anesthetic til en vedlikehold isoflurane strøm av ~1.5-1%, justert til tå knipe refleks og pustemønster. - Desinfisere barbert hodebunnen som beskrevet i trinn 3.2.
- Kutte huden med en skalpell i en linje fra den rostral øyehøyde til midt øret nivå.
Merk: Hvis brystet elektrode placemENT ble utført, trinn 4.2 og 4.3 er allerede utført. - Skrape av periosteum (bindevev på skallen) til sidene med skalpell og grundig tørk av med bomull swaps. Fixate bindevevet i de 4 hjørnene av kuttet bulldog festing og la dem henge sidelengs for å holde feltet kirurgi åpen.
- Bruk 0,9% saltløsning rense bein overflaten og vev med bomull vattpinner. Rengjør Ben overflaten med 3% H 2 O 2. Unngå kontakt med vevet. Herved bein er mer grundig rengjort og underordnede blødning fra benet stoppes. Også rester av periosteum blir synlige. Fjerne disse resterende med en bomullspinne moderat pressmiddel.
Merk: Fjerning av periosteum resterende øker vedheft og holdbarhet av tES socket limt på benet.- Ved ustoppelig blødning, bruke en bein drill og ta det for 1-3 s med litt press på benet. Denne mekaniske prosedyren vil i de fleste tilfeller stoppe blødningen uten betydelig oppvarming. Bruk aldri electrocautery på benet; selv kort program vil resultere i vev hjerneskade (electrocautery bør kun brukes til sår vev blødning).
- Som fiksering skruene vil forbedre oppsett etterlevelse, velge en borekrone passer skruen størrelsen. Plass to burr hull på to forskjellige bein plater ved pre boring med en hånd drill og deretter lett loddrett trykk program med bein bore. Unngå nærhet til ønsket plassering av tES socket, som det kan hindre skru i elektroden (f.eks for venstre primære motor kortikale tES, velge rett frontal og posterior parietal skruen posisjon).
- Ved en implantert counter elektrode, burr tredje hull i høyre bakre parietal benet for fremtidige fiksering av tunnelert kabelen.
- Plasserer plast skruer i burr hullene og skru til første friksjon er følte. Deretter utføre tre ekstra 180 ° skruen svinger. Sjekk med tang for stabilitet på skruen og legge mer vri hvis ikke tett.
Merk: For voksne rotter vil dette sikre epidural plassering av skruer uten å skade den dura eller hjernen (avhengig av skruen tråden design, turn antallet kan variere). Bruk av rustfritt stål skruer bør også være mulig, siden selv på DCS gjeldende tettheter over neurodegeneration sperregrensen, ikke skruen plassering forurolige lesjon plassering eller langt under skruene. - Slå på loddebolt og pre varme i ca 5 min. vind kabelen avslutter vev tunnelen occipitally rundt rett parietal skruen og skjær, forlater ca 1 cm kabel bak svingete. Nøye stripe isoleringslaget på slutten av kabelen med skalpell.
- Fikse omstendelig kabelen til skruen og bein med cyanoacrylic lim.
- Gjelder en liten mengde blyfri tin-loddetråd kontakten og nakne ledningene av counter elektrode kabelen og koble begge ved å trykke kort på begge pre loddet deler sammen mens berører lodding tips til tin-loddetråd smelter (ca 2-3 s). Fjerne lodding tips umiddelbart for å unngå overdreven metal varme av kabelen med påfølgende vevsskade.
- Plukke opp egendefinerte laget tES elektrode socket ( figur 1B, i rødt) med bøyd, taggete tips tang og Påfør et tynt lag av cyanoacrylic lim til den nederste kanten av kontakten. For plassering over motorisk cortex og bruker en 4 mm diameter socket, plass midt kontakten poenget 2 mm fremre og 2 mm lateral fra bregma. For denne posisjonen, indre mediale grensen til kontakten bør ende direkte på sagittal suture og caudal grensen skal slutte på høyden av bregma. Trykk kontakten kort på benet (de fleste cyanoacrylic lim stivne ved press).
Merk: Plassere en lyskilde rett over socket kan lette å plassere kontakten. - Kontroller at benet innenfor det socket er gratis lim (ved å sjekke med lys fordi limet er reflekterende). Ved lim utslipp, fjerne kontakten, skrape limet med skalpell og gjenta trinn 4,12.
- Etter at socketen er på plass og fremtidige stimulering området er lim, først forsegle den laterale begrensning av kontakten til nærliggende vev med en liten dråpe cyanoacrylic lim å unngå en væske bro som kan føre til skifting av gjeldende på denne plasseringen. Gjelder ikke for mye lim som det strømme inn området stimulering (Hvis dette skjer, tilbake til trinn 4,12).
Merk: Å holde stimulering området gratis lim er avgjørende som en reduksjon av området stimulering kan dramatisk øke nåværende tetthet (A/m²). - Alle batteridekslet med cyanoacrylic lim.
- Blande to-komponent dental akryl sement i en liten silicon rør eller glass. Så snart det blir tyktflytende, bruke den med en tannlege slikkepott til å forsegle gjenværende grenser socket til benet. Unngå alle flyten av dental akryl sement i området stimulering.
- Endelig dekker hele skallen, skruer, counter elektrode kabelen og kontakten til ⅓ til kontakten med dental akryl sement. Sikre at sement har den riktige viskositeten: Hvis for flytende, vil det strømme inn de omkringliggende vev; Hvis det er for vanskelig det er vanskelig å fordele det jevnt.
- Når alle benet er dekket og sement er herdet, fjerne bulldog klemmer; huden bør bare ta bygget opp sement slik at suturing ikke er nødvendig. (Hvis den første kuttet var valgt for lang og connective vev eller muskel vises, gjelder en Sutur som beskrevet i trinn 3.12).
- Bruke ett lag av jod med en bomullspinne rundt grensen av kuttet huden og injisere subcutaneously carprofen (5 mg/kg kroppsvekt oppløst i 5-7,5 mL 0,9% saltløsning i smerte behandling og væske utskifting).
Merk: Hvis bruker innånding anestesi, slå den av nå. - Plasserer gnagere i en oppvarming for utvinning fra anestesi til gnagere er våken og postural stabilitet gjenopprettes.
Merk: Se dyr ' s vekt utvikling, sår statlige og generell velvære kriteriene daglig ifølge institusjonen ' s anbefaling.
5. Transkraniell elektrisk stimulering prosedyren
Merk: som anestesi påvirker tES effekter, utføre stimulering i alert gnagere mulig anbefales. La gnager å utvinne i minst 5 dager (helbredelsen av hodet og brystet såret) før du starter eksperimenter. Eksperimenter kan utføres på tidligere tidspunkt etter operasjonen når du bruker en ekstern counter elektrode fast med en vest, som brystet såret er mest irritabel; men dyr må bli habituated til elektroden Vesten i flere dager og interferens med atferdsdata oppgaver kan oppstå.
- Fylle tES elektrode socket halvparten med 0,9% saltvann og fjerne luftbobler.
- Værefore cathodal tDCS økter, alltid sjekke klorering, og om nødvendig (for eksempel en skinnende sølv overflate), nytt chlorinate Ag/AgCl elektroden. Før anodal tDCS økter, fjerne mulig overflødig AgCl innskudd fra tidligere stimulations med sandpapir å tillate for god ledningsevne under stimulering. Skru inn tES elektrode skrukork ( figur 1B, grå stykke).
FORSIKTIG: Feil å re chlorinate elektroden mellom cathodal tDCS økter vil føre til konsumpsjon av klorering under stimulering og giftige oppbygging av elektrokjemisk reaksjon. Dette vil indusere vevsskader. Re klorering er ikke nødvendig i en enkelt økt hvis stimulering varighet er kortere enn 20 min. - Koble kablene til de to kontaktene på hodet (for anodal stimulering, anodal kabelen er koblet til kontakten på skrukork, for cathodal stimulering, det er motsatt).
Merk: Når du bruker et eksternt plasserte counter elektrode, dekke counter elektroden med ledende geleen og plass på gnager ' s brystet. Det er enklest elektroden er pre fast i en liten gnager vest, som gnager kan bære under stimulering. - Sted gnager i eksperimentell buret, med kabler koblet til en svivel over bur som gir gratis bevegelse.
- Aktivere stimulator og justere parameterne stimulering (stimulering intensitet, varighet, rampe opp og ned gangen).
- Når du ikke bruker en kommersielt tilgjengelig stimulering enhet med et sikkerhetssystem stenge og frakobling alarm, inkluderer en meter i kretsen du konstant gjeldende flyt.
Merk: Med dette oppsettet, stimulering kan brukes under ytelse eller opplæring av atferdsmessige oppgaver. - Se etter tegn på stress eller ubehag av gnagere under stimulering.
- Etter slutten av stimulering, koble til kabler, skru elektrode hetten på hodet, og ren og tørr stikkontakten med en bomullspinne. Tilbake gnagere til hjemmet miljøet eller fortsette en opptreden prosedyre hvis ønskelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beskrevet gjennomføring av et oppsett for pålitelig gjentatte tES i alert gnagere kan enkelt integreres i mekanistisk eksperimenter dose-respons studier og eksperimenter inkludert opptreden. Hittil har hindret sammenlignbarheten data fra dyrestudier bruker (noninvasive) tES av variasjon av tES stimulering set-ups mellom laboratorier og forskjeller i stimulering parametere (f.eks ulike gjeldende tettheter brukes på urimelig høye nivåer i forhold til menneskelig programmet). Derfor er informativ verdien av dyr forskning innen tES begrenset. Denne artikkelen presenterer et tES oppsett som er enkelt å standardisere i hele laboratorier ved å implementere plasseringen av "aktiv" elektroden på benet over målrettede cortex (her, over primære motorisk cortex (M1)) med saltvann som de foretrekke ledende medium og counter elektroden plassert på brystet (eksternt eller implantert).
Gitt den lille størrelsen på gnagere, kan plassere elektroden over målrettede cortex på gnagere i huden føre til overdreven skifting, spesielt når mot elektroden er plassert i umiddelbar nærhet, f.eks i nakken (for eksempel gjeldende modellering se Figur 3 (adoptert fra referanse1)). I tillegg til stabilitet og elektroden kontakten er mindre pålitelig og gnagere er mer irritert av gjentatte elektrodeplassering i hodebunnen når du bruker en transdermal applikasjon. Fiksering av et ikke-permanente oppsett kan også hindre gnagere utføre fritt. I kontrast, innstille gnagere rask å dette permanent stede implantert oppsettet.
Estimering av en tilsvarende stimulering intensitet sammenlignet med menneskelige stimulering parametere er vanskelig, siden modeller kan bare ta hensyn til et begrenset antall faktorer og gnagere er pachygyric (se referanse1 ved beregning av en skalering faktor). Derfor kan datainnsamlingen dose-respons inkludert lav intensitet strømmer være mest informative. Bruker presentert kirurgisk oppsettet i en dose-respons studiet i bedøvet rotter, ble doseavhengig microglial aktivisering utspilte stimulering perioden (24 timer etter stimulering) demonstrert og dissociable fra neurodegeneration på høy intensitet DCS (Figur 4; adoptert fra referanse17). Microglial aktivisering, vurdert av morfologiske endring, oppstod først på 31,8 A/m² (figur 4C), mens de første tegnene til neurodegeneration ble funnet på 47,8 A/m². I disse eksperimentene påvirket av bedøvelsen tydelig omfanget av svar på domenekontrollere som prosentandelen av hjernen skiver med fluorojade C (FJC) positive degenereres nerveceller i alert rotter var høyere i 47.8 A/m² (figur 4A). Terskelen for ≥ 24 h varig microglial aktivisering er nær lesjon terskelen, men sterkt over intensiteten som fremmer fysiologiske kognitive og plast prosesser hos mennesker, slik aktivisering kan heller indikerer en pre-lesional betennelse indusert av DCS. Derfor er atferdsmessige eller molekylær virkningene av DCS på intensitetssonene høye forventet å være mechanistically forskjellige sammenlignet med lav intensitet effekter (se skjemaet summering effekter og intensiteter tDCS eksperimenter i figur 5).
Figur 1: forsyninger for kirurgi og teknisk ordningen tES socket og elektroden cap enhet (A) 1. Bomull vattpinner, 2. desinfeksjonsmiddel, 3. stereotactic ramme, 4. lodding jern, 5. smertestillende (f.ekscarprofen), 6. & 7. bedøvelse (f.eks xylazine & ketamin), 8. sprøyte, 9. Clipper, 10. øret puncher, 11. øye ointment (f.eksbepanthene), 12. blyfri tin-solder, 13. to-komponent dental akryl sement (DAC), 14. jod, 15. 3% H2O2, 16. 0,9% saltløsning, 17. syntetisk flettet ikke-absorberbare Sutur (f.eksMersilene 4-0), 18. borekroner, 19. cyanoacrylic lim, 20. Bulldog klemmer 21. homøostatisk tang, 22. bøyd, taggete tips tang, 23. rette, skarpe tips tang, 24. rett, tissue tang, 25. Dental slikkepott, 26. skalpell, 27. Sakser, 28. hånd drill, 29. skrujern, 30. motordrevet drill, 31. hunn-kontakter, 32. tES kontakten, 33. firkantet platina elektrode knyttet til kabel, lodding felles dekket med histoacrylic lim, 34. plast skruer. (B) tES kontakt (rød) for fiksering på gnager skallen med en diameter på 4 mm; elektroden enheten (grå) er bygget av skrukork og et indre stempel med en senterhullet plass kabelen til Ag/Cl plate elektroden, som er festet til bunnen av stempelet. Dette gir maksimal stabilitet i organisasjonen og unngåelse av wire bryter på sensitive wire-elektrode-koblingspunktet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: rotter utstyrt med tES oppsett. Rotta til venstre er utstyrt med en eksternt fast counter elektrode på barbert brystet. Karbon gummi elektroden er sydd til bunnen av Vesten. Rotta til høyre har en implantert brystet elektrode med kabelen tunnelerte til hodet. Kvinnelige kontakten koblet kabelen (caudal) er fast i dental akryl sement bygget enheten, bak socket for tES elektroden (rostral). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: modellering av nåværende fordelingen i to forskjellige gnager tES montasjer. Finite element modeller forutsi hjernen gjeldende flyt i to rotte modeller med epicranial tDCS montasjer, endret med tillatelse1. Bruk disse modellene, spådde terskelen hjernen nåværende tetthet å indusere kortikale lesjonene var 17.0 A/m² for montasjen brukes av Fritsch, et al. 8 (A) og 6.3 A/m² for montasje av Rohan, et al. 21 (B) tilsvarer elektrisk felt 61 og 23 V/m, henholdsvis. Merk gjeldende strømningsmønsteret av de to forskjellige montasjer avvik. (A) brukes en høyere nåværende tetthet for en kortere tid, noe som resulterer i en lavere kostnad tetthet enn med (B). Viktigst kan plasseringen av counter elektroden (nakken mot brystet) ha flere innvirkning på resulterende hjernen gjeldende flyt. Derfor for tolkning av gnager data er spesifisering av elektroden størrelse og plassering (begge elektrodene), brukes gjeldende stimulering varighet nødvendig. Merk at den faktiske gjeldende i rotte hjernen bare kan beregnes ved hjelp av disse datamodeller. Fargeskala angir nåværende tetthet fra null til 11,6 A/m², og over. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Dose svar effekter av DCS på microglia aktivisering og neurodegeneration i hjernen skiver innhentet etter ulike doser av anodal tDCS på primære motorisk cortex. Figuren er endret fra17 oppsummerer immunohistological resultatene av en dose-respons tDCS studie. (A) forholdet mellomMorphologically aktivert microglia vurdert av anti-CD11b/c flekker (vurdering se nedenfor) og neurodegeneration avslørt av FJC positivitet. Rotte motor kortikale hjernen stykker ble vurdert av en blendet etterforsker enten som anti-CD11b/c og FJC flekker negativ, som anti-CD11b/c bare (positiver aktivisering bestemt morphologically), eller som både anti-CD11b/c og FJC positive. Merk at microglial aktivisering innledes forekomsten av neurodegeneration. (B) representant framskaffet venstre motor kortikale hjernen skiver (på eller nær +1.56 mm fra bregma) fra rotter utsatt for forskjellige intensiteter av anodal tDCS på primære motorisk cortex. Bedøvet rotter, ingen tegn til neurodegeneration oppstod på 31,8 A/m², mens noen degenereres neurons var tilstede på 47.8 A/m² og neuronal skade ytterligere økt med økende dose. Av note, anodal DCS på 47,8 A/m² alert rotter økt andelen skiver med neurodegeneration. Skala bar for alle inndelinger: 500 µm. forstørrelse innløp skala bar for alle inndelinger: 20 µm. (C) histologiske eksemplar profilen av vurdering av microglia aktivisering i anti-CD11b/c immunohistochemistry, varierer fra 0 (ikke aktivert) til 4 (alvorlig aktivert ), 1-4 ble vurdert som "positiv". Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ordningen illustrere for øyeblikket brukes gnager tDCS gjeldende tettheter sammenlignet med menneskelige programmet: grenseverdier for betennelse og neurodegeneration modulering av fysiologiske prosesser på stimulering varigheten av 30 min. For øyeblikket brukes gnager DCS gjeldende tettheter området 1,3 til 143 A/m² med fleste studier med mer enn 20 A/m², mens de gjeldende tettheter i fleste menneskelige studier er mellom 0,3 og 0,8 A/m²1,14. Menneskelige stimulering er minst en størrelsesorden under terskelen for neurodegeneration1. Terskelen for neurodegeneration er betydelig høyere under narkose, når kortikale excitability er undertrykt17. Varig microglial aktivisering begynner under, men nær intensiteter inducing neuronal skade17. Undersøkelse av modulerende effekter av DCS på fysiologiske cerebral prosesser ved høyere intensiteter under lesjon terskelen er sannsynlig forskjellig fra teser sett på svært lav intensitet (sammenlignes menneskelige programmet). Nøyaktig oversettelse av stimulering mellom artene er under etterforskning. Beregninger er hindret av passiv faktorer som størrelse og anatomi (sulci og gyri), men også av mulig ulike følsomhet til elektrisk felt av neurons, glia og nettverk over arter (det ikke er kjent om det samme gjeldende flyten ville føre til samme fysiologisk effekt). Derfor tester mest informative studien design tES effekter på en dose svar måte, inkludert svært lav gjeldende intensiteter. Ordningen er basert på data fra7,12,16,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 (høyeste stimulering varigheten av 30 min per økt, dataene er fra sykdom dyremodeller utelukket). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver typiske materialer og prosessuelle skritt for kirurgiske realisering av et permanent tES oppsett og påfølgende stimulering i alert gnagere. Under utarbeidelsen av en gnager tES eksperimentere, flere metodologiske aspekter (sikkerhet og toleranse av tES, utfallet parameteren) samt konseptuelle aspekter (sammenliknbarhet med menneskelige tilstand, forventede virkningene av stimulering på bestemt hjernen region) må tas i betraktning. Fra en metodisk synspunkt er kirurgisk konfigureringen av skallen tES stikkontakten med implantert brystet counter elektroden fordelaktig for longitudinelle studier siden det gir programmet varselet om fritt flytte gnagere. Habituering av gnagere kabeltilkoblingene og permanent oppsett er nødvendig, men etterpå den lar tES selv i kombinasjon med atferdsdata oppgaver. Videre er ubehag av gnagere under stimulering sannsynligvis lavere med dette oppsettet sammenlignet iført en counter elektrode sydd inn en vest, siden bevegelser ikke er begrenset i tidligere sak og vev kontakt av implantert elektroden under stimulering er sikret.
Presentert tES opplegget er brukt for eksperimenter varer opptil 3 måneder, uten elektrode kabel diskontinuitet, materielle ustabilitet eller infeksjon. Det er derfor sannsynlig at oppsettet er også egnet for eksperimenter lenger enn denne perioden.
Denne epicranial stimulering montage hindrer overdreven skifting via dermal strukturer, som skjer sannsynligvis i større grad i gnagere gitt for elektrode kroppsstørrelse (se Figur 3 og referanse1). Implantert opplegget for epicranial stimulering i gnagere gir høy funksjonalitet for eksperimenter i fritt flytte dyr, en klar definisjon av elektroden posisjoner og stabiliteten til gjeldende levering. Mens disse faktorene representerer store fordeler for standardisering av eksperimenter, bør avviket til transdermal stimulering hos mennesker eller Red (f.eks refererer32,33) holdes i bakhodet. For oversettelse av resultater er imidlertid den faktiske mengden gjeldende nå hjernen (hjernen nåværende tetthet), uavhengig av passasje gjennom forskjellige vev, av stor relevans34. Plassering av counter elektroden generelt bestemmer retningen og distribusjon av gjeldende flyt1. Dermed for polarisering av neurons, kan en plassering på disken elektroden på brystet (dorsoventral ledelse av nåværende flyt) være mer effektiv i forhold til plasseringen i halsen (rostrocaudal ledelse av nåværende flyt).
Studier de underliggende mekanismene tES eller dens effekt på atferden bør når gjennomførbart utføres i alert gnagere, for anestesi betydelig samhandler med (patho)-fysiologiske prosesser inkludert neuronal aktivitet35 ,36 og plastisitet36,37, skjule eller endre tES effekt17(og våre upubliserte observasjoner) og kan skade1,17. Omvendt, tillater resultatene i bedøvet gnagere ikke en direkte slutning til alert tilstanden, hindre potensielt frem oversettelse til forskning på mennesker. Et eksempel på forskjellene i tDCS på motorisk cortex i bedøvet rotter og varsle rotter vises i delen representant resultater. tDCS brukt ved like høye gjeldende tettheter indusert et større antall microglia aktivisering og neurodegeneration i alert rotter sammenlignet bedøvet rotter17. Mens disse funnene er del av en dose-respons-eksperiment oppstod som tDCS effekter på microglia og neurodegeneration på høy intensitet (ikke anbefales for bruk i mechanistical eller atferdsmessige studier), er det fristende å spekulere at på lav tDCS gjeldende tettheter, samme avledning av resultatene ville oppstå avhengig av årvåkenhet av gnagere.
Endelig, en annen fordel med angitte protokollen er reduksjon av mulige feilkildene for. Feilsøking strategier og avgjørende skritt har blitt fremhevet i protokollen. Disse inkluderer valg av riktige nåværende tetthet for bestemt forskning formål (som omtalt ovenfor), behovet for forberedelser av tES elektrodene før hver brukt stimulering, og grundig og gjentatt sjekk for pålitelig konduktans. Med hensyn til elektroden forberedelse, klorering av elektroden før cathodal stimulering (dvs., katoden over kortikale målområdet) er helt avgjørende siden konsumpsjon av klorering under stimulering vil føre til giftige oppbygging av elektrokjemiske reaksjoner og secondarily forårsaker vevsskade. I vår erfaring finnes konsumpsjon av klorering ikke i de første 20 min på stimulering. Tvert imot, før gjentatte anodal stimulering, må Ag/Cl deponering ved anoden fjernes for å unngå seponering av stimulering. Konduktans er et kritisk punkt, som ikke bare knyttet til elektroden utarbeidelse, men også til den praktiske stimulering økten gnagere, samt kvaliteten på kirurgisk implantering av tES socket. Nedleggelsen av tES socket til omkringliggende skallen og vevet området bør sikres under kirurgiske prosedyrer for riktig vurdering av nåværende tetthet. Skifting langs tilstøtende vev fører til overvurdering av gjeldende på hjernen på den ene siden, og kan endre fysiologiske resultater basert på forvrengning av gjeldende flytretningen. På den annen siden, reduksjon av området stimulering, ved Ag/Cl avsetning (se ovenfor) eller ved dekning av stimulering området under tES socket implantasjon (f.eks av akryl sement eller histoacrylic lim)-kan føre til undervurdering av den brukte nåværende tetthet og stimulering via en redusert området kan føre til skade på vev ved utilsiktet high peak gjeldende tettheter. Til slutt, den ledende mediet, f.eks saltvann, må distribueres optimalt over stimulering området å tillate fortsatt stimulering. Under et pågående eksperiment, endret konduktans kan bli synlig som følgende: Uventet virkemåte av gnagere (tegn på stress, variabel ytelse på en bestemt aktivitet) variasjoner i gjeldende levering vises på en ampere meter den elektriske krets eller fullstendig tap av stimulering kontinuitet. I dette tilfellet elektrodene burde være renset fra avsetninger og stimulering området bør inspiseres igjen for alle partikler. Kabeltilkoblinger, plassering av tES elektrode i respektive socket, og ledende mediet bør være avkrysset og erstattet når vises dysfunksjonelle. Hvis tES var inkonsekvent, må innhentet data (f.eks atferd, histology) i denne spesielle økten skal utelates fra analyse.
Terskelen for neurodegeneration bestemmes i alert rotter (vår upubliserte data) både cathodal og anodal økter er trygt og godt tolerert i alert gnagere, når du bruker opptil 20 min til kontinuerlig stimulering på intensiteter under 31,8 A/m² (tilsvarende 0,4 mA med en 4 mm diameter Transkraniell elektrode), og følge anbefalingene i denne protokollen. Imidlertid velge lavere intensitet nærmere menneskelige stimulering parameterne (0,3-1.6 A/m²) eller helst dose-response eksperimenter anbefales å maksimere informativ karakter innhentet data og å lette frem oversettelse av resultatene til menneskelig program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation (DFG RE 2740/3-1). Vi takker Frank Huethe og Thomas Günther for in-house produksjon av skreddersydde tES oppsett og DC-stimulator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softasept N | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
3887138 | antiseptic agent |
| Ethanol 70 % | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | T913.1 | |
| arched tip forceps | FST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland | 11071-10 | |
| Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 15914 | |
| Scalpel Handle #3, 13cm | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500236 | |
| Standard Scalpel Blade #10 | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 500239 | |
| Zelletten cellulose swabs | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland | 13349 | 5 x 4 cm |
| Isoflurane | AbbVie Deutschland GmbH & Co | N01AB06 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501758 | small scissors |
| cotton swab/cotton buds | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland | EH12.1 | Rotilabo |
| Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, Straight | World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA | 501241 | surgical clamp |
| electrode plate (platinum) | custom made | Wissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland | 10x6 mm, 0.15 mm thickness |
| insulated copper strands (~1 mm diameter) | Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, Germany | LITZE BL | electrode cable |
| Weller EC 2002 M soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | EC2002M1D | |
| Iso-Core EL 0,5 mm | FELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland | 20970510 | lead free solder |
| MERSILENE Polyester Fiber Suture | Johnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | R871H | nonabsorbable braided suture, 4-0 |
| Histoacryl | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland |
9381104 | cyanoacrylate |
| Ketamin 10% | Medistar GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer GmbH, Germany | n/a | anesthetics |
References
- Bikson, M., et al. Safety of Transcranial Direct Current Stimulation: Evidence Based Update 2016. Brain Stimul. 9 (5), 641-661 (2016).
- Bindman, L. J., Lippold, O. C., Redfearn, J. W. The action of brief polarizing currents on the cerebral cortex of the rat (1) during current flow and (2) in the production of long-lasting after-effects. J Physiol. 172, 369-382 (1964).
- Gartside, I. B. Mechanisms of sustained increases of firing rate of neurones in the rat cerebral cortex after polarization: role of protein synthesis. Nature. 220 (5165), 382-383 (1968).
- Purpura, D. P., McMurtry, J. G. Intracellular activities and potential changes during polarization of motor cortex. Neurophysiol. 28 (1), 166-185 (1965).
- Nitsche, M., Paulus, W. Excitability changes induced in the human motor cortex by weak transcranial direct current stimulation. J Physiol. 527 (Pt 3), 633-639 (2000).
- Nitsche, M. A., Paulus, W. Sustained excitability elevations induced by transcranial DC motor cortex stimulation in humans. Neurology. 57 (10), 1899-1901 (2001).
- Cambiaghi, M., et al. Brain transcranial direct current stimulation modulates motor excitability in mice. Eur J Neuro. 31 (4), 704-709 (2010).
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).
- Ranieri, F., et al. Modulation of LTP at rat hippocampal CA3-CA1 synapses by direct current stimulation. J Neurophysiol. 107 (7), 1868-1880 (2012).
- Kronberg, G., Bridi, M., Abel, T., Bikson, M., Parra, L. C. Direct Current Stimulation Modulates LTP and LTD: Activity Dependence and Dendritic Effects. Brain Stimul. 10 (November), 51-58 (2016).
- Sun, Y., et al. Direct current stimulation induces mGluR5-dependent neocortical plasticity. Ann Neurol. 80 (2), 233-246 (2016).
- Podda, M. V., et al. Anodal transcranial direct current stimulation boosts synaptic plasticity and memory in mice via epigenetic regulation of Bdnf expression. Sci Rep. 6, 22180 (2016).
- Reis, J., Fritsch, B. Modulation of motor performance and motor learning by transcranial direct current stimulation. Curr opin Neurology. 24 (6), 590-596 (2011).
- Buch, E. R., et al. Effects of tDCS on motor learning and memory formation a consensus and critical position paper. Clin Neurophysiol. 128 (4), 589-603 (2017).
- Reis, J., Fischer, J. T., Prichard, G., Weiller, C., Cohen, L. G., Fritsch, B. Time- but not sleep-dependent consolidation of tDCS-enhanced visuomotor skills. Cerebral cortex. 25 (1), 109-117 (2015).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Comm. 7, 11100 (2016).
- Gellner, A. -K., Reis, J., Fritsch, B. Glia: A Neglected Player in Non-invasive Direct Current Brain Stimulation. Front Cell Neurosci. 10, 188 (2016).
- Takano, Y., Yokawa, T., Masuda, A., Niimi, J., Tanaka, S., Hironaka, N. A rat model for measuring the effectiveness of transcranial direct current stimulation using fMRI. Neurosci Lett. 491 (1), 40-43 (2011).
- Islam, N., Moriwaki, A., Hattori, Y., Hori, Y. Anodal polarization induces protein kinase C gamma (PKC gamma)-like immunoreactivity in the rat cerebral cortex. Neurosci Res. 21, 169-172 (1994).
- Islam, N., Aftabuddin, M., Moriwaki, A., Hattori, Y., Hori, Y. Increase in the calcium level following anodal polarization in the rat brain. Brain Res. 684 (2), 206-208 (1995).
- Rohan, J. G., Carhuatanta, K. A., McInturf, S. M., Miklasevich, M. K., Jankord, R. Modulating Hippocampal Plasticity with In Vivo Brain Stimulation. J Neurosci. 35 (37), 12824-12832 (2015).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Exp Neurol. 227 (2), 322-327 (2011).
- Koo, H., et al. After-effects of anodal transcranial direct current stimulation on the excitability of the motor cortex in rats. Rest Neurol Neurosci. 34 (5), 859-868 (2016).
- Liebetanz, D., et al. After-effects of transcranial direct current stimulation (tDCS) on cortical spreading depression. Neurosci Lett. 398 (1-2), 85-90 (2006).
- Fregni, F., et al. Effects of transcranial direct current stimulation coupled with repetitive electrical stimulation on cortical spreading depression. Exp Neurol. 204 (1), 462-466 (2007).
- Cambiaghi, M., et al. Flash visual evoked potentials in mice can be modulated by transcranial direct current stimulation. Neurosci. 185, 161-165 (2011).
- Dockery, C. A., Liebetanz, D., Birbaumer, N., Malinowska, M., Wesierska, M. J. Cumulative benefits of frontal transcranial direct current stimulation on visuospatial working memory training and skill learning in rats. Neurobiol Learn Mem. 96 (3), 452-460 (2011).
- Faraji, J., Gomez-Palacio-Schjetnan, A., Luczak, A., Metz, G. A. Beyond the silence: Bilateral somatosensory stimulation enhances skilled movement quality and neural density in intact behaving rats. Behav Brain Res. 253, 78-89 (2013).
- Pikhovych, A., et al. Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Neurogenesis and Microglia Activation in the Mouse Brain. Stem Cells In. , 1-10 (2016).
- Rueger, M. A., et al. Multi-session transcranial direct current stimulation (tDCS) elicits inflammatory and regenerative processes in the rat brain. PloS one. 7 (8), e43776 (2012).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiol. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Yoon, K. J., Oh, B. -M., Kim, D. -Y. Functional improvement and neuroplastic effects of anodal transcranial direct current stimulation (tDCS) delivered 1 day vs. 1 week after cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1452, 61-72 (2012).
- Spezia Adachi, L. N., et al. Exogenously induced brain activation regulates neuronal activity by top-down modulation: conceptualized model for electrical brain stimulation. Exp Brain Res. 233 (5), 1377-1389 (2015).
- Jackson, M. P., et al. Safety parameter considerations of anodal transcranial Direct Current Stimulation in rats. Brain, behavior, and immunity. , (2017).
- Ordek, G., Groth, J. D., Sahin, M. Differential effects of ketamine/xylazine anesthesia on the cerebral and cerebellar cortical activities in the rat. J Neurophysiol. 109 (5), 1435-1443 (2013).
- Sykes, M., et al. Differences in Motor Evoked Potentials Induced in Rats by Transcranial Magnetic Stimulation under Two Separate Anesthetics: Implications for Plasticity Studies. Front Neural Circ. 10, 80 (2016).
- Zhang, D. X., Levy, W. B. Ketamine blocks the induction of LTP at the lateral entorhinal cortex-dentate gyrus synapses. Brain Res. 593 (1), 124-127 (1992).
