Summary
الزرد نموذج حيوان شعبية لدراسة آليات تنكس الشبكية/التجدد في الفقاريات. ويصف هذا البروتوكول وسيلة للحث على إصابة مترجمة تعطيل الشبكية الخارجي مع الحد الأدنى من الضرر للشبكية الداخلية. وفي وقت لاحق، نقوم بمراقبة في فيفو مورفولوجية الشبكية ورد إطلاق مولر في جميع أنحاء التجدد الشبكية.
Abstract
فرق رائعة بين تيليوست والثدييات هي إمكانية مدى الحياة الشبكية تيليوست للخلايا الشبكية وتجديدها بعد أضرارا جسيمة. التحقيق في سبل التجدد في الزرد قد تجلب أفكاراً جديدة لتطوير استراتيجيات مبتكرة لعلاج الأمراض التنكسية الشبكية في الثدييات. هذه الوثيقة، ركزنا على تقلد الآفة تركيزه على شبكية العين الخارجي في الزرد الكبار عن طريق ليزر صمام ثنائي 532 نانومتر. ويسمح بإصابة مترجمة التحقيق في العمليات البيولوجية التي تحدث أثناء تنكس الشبكية وتجديدها مباشرة في المجال الأضرار. باستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية غير الغازية (OCT)، كنا قادرين على تحديد موقع تلف المنطقة ورصد التجديد اللاحقة المجراة في. في الواقع، تنتج أكتوبر تصوير الصور ذات الدقة العالية، مستعرضة الشبكية الزرد، تقديم المعلومات التي كانت متاحة في السابق إلا بالتحليل النسيجي. من أجل تأكيد البيانات من أكتوبر في الوقت الحقيقي، أجريت مقاطع نسيجية وحققت استجابة التجدد بعد تنصيب إصابة الشبكية إيمونوهيستوتشيميستري.
Introduction
الرؤية هو على الأرجح بمعنى الأكثر أساسية للإنسان وبه ضعف أثر اقتصادية عالية. في العالم الصناعي، والأمراض التنكسية الشبكية تمثل الأغلبية من فقدان البصر والعمى بين السكان البالغين1. التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو السبب الأكثر شيوعاً للعمى في الأشخاص بين سن 20 و 60، التي تؤثر على حوالي 1.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم2،3الموروثة. أنها عائلة غير متجانسة من اضطرابات الشبكية الموروثة التي تتميز بالفقدان التدريجي ل photoreceptors (الحد من الفقر) متبوعاً بانحطاط ظهارة صباغ الشبكية، وفي وقت لاحق، الدباق ويعيد البناء من الخلايا العصبية الداخلية4. ويمكن تفسير مسار المرض عن فقدان تزايدي لهذين النوعين خلية العلاقات العامة، عادة بدءاً من قضبان، التي تعتبر مسؤولة عن الرؤية متعامي في ضوء خافت، والأقماع، التي تعتبر أساسية ل الرؤية والبصر لون5. عيب واحد من جينات كافية لتتسبب في البرنامج العادي. حتى الآن أكثر من 130 من الطفرات في الجينات ما يزيد على 45 كانت مرتبطة ب المرض6. وهذا يؤدي إلى اختلاف المرض تعمل وهو أحد الأسباب أن العلاج الجيني عدم التعميم ونهج علاجية معقدة وبالتالي. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير النهج العلاجية العامة الجديدة لعلاج تنكسات الشبكية في الأمراض المسببة للعمى.
ضمور الشبكية وكثيراً ما ينطوي على خسارة العلاقات العامة؛ ولذلك، موت الخلية العلاقات العامة السمة مميزة للعمليات التنكسية في الشبكية7. وقد ثبت فعلا أن موت الخلية PR يحفز مولر إطلاق الخلية (MC) تنشيط وانتشار8. الرصد والمراقبة، واعتبرت نوع الخلية الدبقية الرئيسية في الشبكية الفقارية، مرة واحدة إلى شيء أكثر من "غراء" بين الخلايا العصبية الشبكية. في السنوات الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات أن الإشراف تعمل أكثر من مجرد الهيكلية ودعم9. من بين وظائف مختلفة، المشاركة أيضا في الخلايا MCs وإصلاح10. في الواقع، استجابة لعوامل ديفوسيبلي من تردي الشبكية، زيادة MCs كبيرة التعبير الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني). ولذلك، يمكن استخدام توصيني وسمها كعلامة للتنشيط MC كاستجابة ثانوية لإصابة الشبكية وضمور11.
في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير رواية تكيف لإصابة التنسيق باستخدام ليزر لحمل تنكس الشبكية في الزرد (دانيو rerio). إصابة التنسيق مفيد لدراسة بعض العمليات البيولوجية مثل هجرة الخلايا في الموقع المتضرر والتوقيت الدقيق للأحداث التي تجري أثناء التجديد الشبكية12. وعلاوة على ذلك، أصبحت الزرد هامة في الأبحاث البصرية بسبب أوجه التشابه بين نظامها البصرية وغيرها من الفقاريات. السمات المورفولوجية وغذائها الإجمالي من ريتيناي البشرية وتيليوست عرض الاختلافات القليلة. وبناء على ذلك، ريتيناي الإنسان والزرد تحتوي على نفس الفئات الرئيسية الخلية نظمت في نفس النمط الطبقات، حيث تحتل استشعار الضوء photoreceptors الطبقة الأبعد، بينما الإسقاط الشبكية الخلايا العصبية، خلايا العقدة، يقيم في الأعمق طبقة الخلايا العصبية والدانية للعدسة. إينتيرنيورونس الشبكية، أماكريني، بين القطبين، والخلايا الأفقية، ترجمة ما بين مستقبله والعقدة طبقات الخلية13. وعلاوة على ذلك، الشبكية الزرد يهيمن عليها مخروط وذلك أقرب إلى شبكية العين البشرية من، على سبيل المثال، في دراسة مكثفة الشبكية القوارض. فرق رائعة بين تيليوست والثدييات هي الخلايا الثابتة في الشبكية الأسماك والتجدد الشبكية بعد الضرر. في الزرد، يمكن الإشراف ديديفيرينتياتي والتوسط من أجل التجديد في الشبكية الجرحى14،15. وقد الإشراف في الدجاج، بعض القدرة أيضا على إعادة إدخال دورة الخلية وديديفيرينتياتي. عقب إصابة الشبكية في الأسماك الكبار، تعتمد بعض الخصائص للسلف والخلايا الجذعية MCs وتهاجر إلى نسيج الشبكية التالفة وإنتاج الخلايا العصبية الجديدة16. التنميط التعبير الجيني من الثدييات MCs كشفت عن أوجه التشابه غير متوقع إلى فروعه الشبكية، وتزايد الأدلة على إمكانات العصبية الذاتية للرصد والمراقبة في الدجاج، والقوارض، وشبكية العين البشرية حتى17. ومع ذلك، لماذا رد التجدد في الطيور والثدييات هي أقل مقارنة مع استجابة قوية في الأسماك هو لم تفهم بعد. ولذلك، فهم آليات الإصلاح الذاتية في الزرد قد اقترح استراتيجيات لحفز التجدد الشبكية في الثدييات والبشر. تستخدم إليه إصلاح الذاتية للإشراف كأداة علاجية لعلاج المرضى الذين يعانون من تنكس الشبكية سيكون له أثر غير المسددة لمجتمعنا.
هنا، نحن نقدم الخطوات اللازمة لتوظيف نموذج الانحطاط/التجديد في أبحاث العيون. نحن ركز أولاً على أحداث الضرر المحورية في الشبكية الحسية، ثم على تصوير الأحداث النامية في موقع الإصابة، وأخيراً نحققها مشاركة MCs المتاخمة. من السهل نسبيا لتنفيذ البروتوكول العام ويفتح مجموعة متنوعة واسعة من الإمكانيات لتقييم الشبكية بعد ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي انضمت إلى البيان "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك والبحوث رؤية الرابطة للبحث في الرؤية و "طب العيون" (آرفو) واحترام اللوائح ذات الصلة للسلطات الحكومية-
1-الحيوانات
- "تجباك الحفاظ على" (gfap:gfap-التجارة والنقل) الزرد 167 سلالة (AB) الذين تتراوح أعمارهم بين 6-9 أشهر تحت الظروف القياسية في الماء بدرجة حرارة 26.5 درجة مئوية و دورة الضوء/الظلام 14/10 ح 18.
- اتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان للمؤسسات المعنية للتجارب على الحيوانات بعد الحصول على موافقة من السلطات الحكومية.
2. التخدير الجهازية عكسها
- تحضير الحل الأسهم إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي الملح (تريكيني) بتذويب 400 ملغ مسحوق تريكيني مل 97.9 لخزان المياه ومل 2.1 متر واحد من تريس مخزنة المالحة (تبس). ضبط على درجة الحموضة 7.0 مع 1 "م تريس" (pH 9) ومخزن في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة شهر واحد.
ملاحظة: ينبغي إعداد تريكيني بالمياه مثل ظروف الحياة الطبيعية للحيوان، يفضل أن يتم ذلك ينبغي أن تستخدم الأصلي خزان المياه- - تمييع في حل الأسهم 01:25 في خزان المياه واستخدامها على الفور.
- مكان في الزرد إلى 10 سم طبق بتري يحتوي على 50 مل من محلول التخدير حتى تصبح قادرة على الحركة ولا تستجيب للمؤثرات الخارجية (حوالي 2-5 دقائق، تبعاً للوزن والعمر)-
- نقل كل الأسماك باليد إلى حامل دبوس سيليكون مصنوعة خصيصا للعلاج بالليزر ( الشكل 1A).
تحذير! يمكن أن تظل الأسماك أنيسثيتيزيد خارج الخزان لمدة تصل إلى 10 دقائق فقط. - على عكس التخدير بعد العلاج و/أو التصوير، ضع في الزرد في حاوية تحتوي على خزان المياه-
- لدعم الانتعاش، خلق تدفق مياه خزان جديد عبر الخياشيم بتحريك الزرد ذهابا وإيابا في الماء-
3. إصابة تركيزه على شبكية العين بالليزر
ملاحظة: 532 ألف نانومتر صمام ثنائي ليزر يستخدم لإنشاء الأضرار الخفيفة التركيز على شبكية الزرد. الإعداد التجريبية من الليزر يسمح بإنشاء إصابة الشبكية المحورية استنساخه في الزرد الكبار-
- بإعداد إنتاج الطاقة من الليزر: 70 ميغاواط؛ وقطر الجوية: 50 ميكرون؛ ومدة النبضة: السيدة 100
تنبيه! يتطلب استخدام ضوء الليزر الحماية الشخصية المناسبة، ووضع العلامات للمنطقة- - تطبيق 1-2 قطرات هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي 2% موضعياً في العين قبل العلاج واستخدام عدسة ليزر النظارة 2.0 مم بتركيز شعاع الليزر تهدف على الشبكية.
تحذير! قطرات هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي لزوجة وقد يسبب مشاكل في التنفس وإذا سارت الأمور على الخياشيم. - مكان أربع ليزر البقع حول العصب البصري على اليسار العين واستخدام العين اليمنى، غير المعالجة كالمراقبة الداخلية-
4. في فيفو التصوير من "مورفولوجية الشبكية"
- في اليوم 0، تصور الشبكية الزرد مباشرة بعد تنصيب الليزر دون أحياء منهم من التخدير. تستخدم في جميع النقاط الزمنية، التخدير العام (انظر القسم 2: التخدير الجهازية عكسها). ضع الزرد المعطل تداولها على حامل دبوس سيليكون مصنوعة خصيصا ( الشكل 1 باء، باء-1)-
- للحصول على صور أفضل، قطع عدسات اللاصقة المائية متاحة تجارياً لتناسب العين الزرد (Ø = 5.2 ملم، r = 2.70 ملم، مركز سمك = 0.4 مم) عن طريق لكمه ثقب. ملء سطح العدسة مقعرة مع ميثيلسيلولوسي ووضعه على القرنية.
- تجهيز نظام أكتوبر مع عدسة مصباح شق عدم الاتصال 78 د.
- التركيز صورة الأشعة تحت الحمراء (IR) في الأشعة تحت الحمراء + صور أكتوبر وضع ( الشكل 2A) لتصور النظارة للعين وأخذ الأشعة تحت الحمراء بواسطة النقر فوق " الحصول على " زر ( الشكل 2) إلى ترجمة ليزر للبقع على الشبكية باستخدام النظام ' البرمجيات s- وضع
- تصور مقطع ثلاثي الأبعاد من طبقات الشبكية في الأشعة تحت الحمراء + أكتوبر والتقاط الصور عن طريق النقر " الحصول على " زر ( الشكل 2). مراقبة مدى خطورة إصابة في طبقة النووي الخارجي (ONL) (انظر القسم 3: إصابة تركيزه على شبكية العين بالليزر) في هذه الصور.
- على عكس التخدير بعد العلاج و/أو التصوير في الزرد في حاوية تحتوي على خزان المياه-
- لدعم الانتعاش، خلق تدفق مياه خزان جديد عبر الخياشيم بتحريك الزرد ذهابا وإيابا في الماء-
- إجراء مماثل في فيفو تصوير مورفولوجيا الشبكية في اليوم 1، 3، 7، 14 والأسبوع 6-
5. توضع & ويوزين (ح & ه) ستينينج
- Euthanize الزرد التي غمر في البرد (4 درجة مئوية) الحل التخدير على الجليد لمالا يقل عن 10 دقيقة وانوكليتي العيون مباشرة عن طريق الملقط منحنية صغيرة.
- إصلاح العيون كله في بارافورمالدهيد 4% (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية عن ح 20 ويذوي ثم العينات في سلسلة متدرجة من الكحول (زيلين نفط 100% لمدة 5 دقائق مرتين، الإيثانول 100% لمدة 5 دقائق مرتين، الإيثانول 96% لمدة 3 دقائق مرتين والايثانول 70% مي 3 n مرة).
تحذير! منهاج العمل يمكن أن تكون مزعجة للعيون والأنف، وتعقب الجهاز التنفسي العلوي. منهاج عمل بيجين هو مسرطن بشري معروف وخطرا الإنجابية المشتبه فيهم. - تضمين العينات في البارافين وقطع 5 ميكرومتر الأقسام على مستوى رأس العصب البصري وجبل لهم على الشرائح الزجاجية.
- وصمة عار المقاطع ديبارافينيزيد مع 0.1% حمض الهيماتوكسيلين حل لمدة 5 دقائق وتراجع الشرائح مرتين في الماء المقطر بعد غمس الشرائح في مزيج حمض الهيدروكلوريك (2 مل 25% HCl في 250 مل المقطر المياه) والأمونيا مزيج (2 مل 25% الأمونيا في 250 مل الماء المقطر). وصمة عار المقاطع مع محلول مائي ويوزين ز 0.5% لمدة 3 دقائق بعد تطوير توضع تلطيخ بماء الصنبور لمالا يقل عن 10 دقيقة
- جبل الشرائح المجففة في وسط تصاعد راتنج اﻷكريليك ومراعاة الشرائح تحت المجهر الخفيفة-
6. إيمونوهيستوتشيميستري لتفعيل MC
- الحرارة المقاطع ديبارافينيزيد في استرجاع مستضد العازلة (تريس يدتا + 0.05% المنظفات غير الأيونية، pH 9.0) لمدة 3 دقيقة باخرة مناسبة أو فرن ميكروويف لمدة 10-15 دقيقة ويغسل ثلاث مرات مع تبس ل 5 دقيقة كل.
- دائرة الفروع مع سيليكون القلم وإضافة 100 ميليلتر عرقلة الحل (TBS + المصل العادي الماعز 10% 1% ألبومين المصل البقري، درجة الحموضة 7.6) في درجة حرارة الغرفة حاء – 1
- وصمة عار مع مكافحة الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني) أرنب [بولكلونل] جسم ومع الجلوتامين المضادة سينثاتيز (ع) الماوس [مونوكلونل] جسم، سواء في تمييع 1: 200 (40 ميكروليتر كل عينة). احتضان الشريحة في دائرة هوميديفيد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. أغسل ثلاث مرات مع TBS + 0.1% 20 توين لمدة 5 دقائق- الأجسام المضادة الثانوية
- التصور الانتهاء مع المناسبة. هذا البروتوكول يستخدم أرنب ماعز المضادة IgG ح & جسم الثانوي ل الأخضر توصيني وماوس ماعز المضادة IgG ح & ل أحمر لفئة الخدمات العامة، سواء في تمييع 1: 500 في درجة حرارة الغرفة حاء – 1
- جبل الشرائح مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI ومراعاة الشرائح تحت المجهر fluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أكتوبر في الوقت الحقيقي: من أجل تحليل دور الإشراف في إصلاح الشبكية، استخدمنا نموذج ضرر ليزر الذي يحفز منطقة تحديداً جيدا من تلف في الشبكية الزرد. موقع الضرر تم تصويرها خلال في فيفو أكتوبر للمرة الأولى (يوم 0) خلال 60 دقيقة بعد الإصابة (الشكل 3). للتعويض عن البصريات العين الأسماك، أولى عدسات اللاصقة مصنوعة خصيصا للقرنية. فورا بعد العلاج بالليزر، كان المترجمة إشارة فرط الانعكاسية منتشر إلى الشبكية الخارجي (الأسهم). أنه مدد من ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE) إلى الطبقة الخارجية بليكسيفورم (المناضل). أيضا كان إشارة مماثلة يمكن اكتشافها في يوم 1. وبعد يوم 3، أصبح هذا إشارة منتشر أكثر تنظيماً وأكثر كثافة. كان ينظر إليه دائماً في الطبقة الخارجية النووية (ONL) تمتد إلى طبقة مستقبله. وبعد الأسبوع الأول (يوم 7)، كان هناك انخفاض كبير في حجم الآفة متوسط وتم الكشف عن إشارة فرط عاكسة صغيرة فقط. ابتداء من يوم 14 حتى آخر نقطة وقت التحقيق (الأسبوع 6)، بقع الليزر لم تعد مرئية في صور الأشعة تحت الحمراء وأكتوبر.
التقييم النسيجي تنكس الشبكية/التجديد: من أجل التحقيق في مدى وحركية تنكس الشبكية/التجدد، ح & ه تلطيخ كان يعمل في نقاط زمنية مختلفة بعد الأضرار التعريفي (اليوم 0، 1، 3، 7، 14 وفي الأسبوع 6) (الشكل 4). وأجريت تجارب على ثلاثة عيون الأسماك الثلاثة. ومع ذلك، أجرى لا تحليل إحصائي كما الهدف من هذه المخطوطة إظهار الأسلوب. بعض التغييرات الطفيفة في الطبقة النووية الداخلية (المكتب) ويمكن ONL شهدت الليزر بعد فورا (مثلاً، تورم طفيف في ONL) وانخفاض المساحة بين الخلايا في المكتب خلال 60 دقيقة بعد العلاج بالليزر. وأعقبت الانحطاط لمدة 6 أسابيع بعد تنصيب ضرر الليزر. ولوحظت تغييرات السمات دائماً بعد يوم واحد مع الفوضى للحد من الفقر، ومع تشكيل تجويف في ONL وفي الفضاء سوبريتينال. وفي الواقع، كان هناك خسارة في النوى داخل ONL في منطقة الضرر بين 1 و 7 أيام. تم العثور على فقدان العلاقات العامة كحد أقصى في اليوم 3. بدءاً من 14 يوما إلى 6 أسابيع، الشبكية الخارجي قد أعادت لها مورفولوجيا العادي.
الدبقية مشاركة خلال الشبكية الانحطاط/التجديد: لتقييم تفعيل MC في نقاط زمنية مختلفة (اليوم 0، 3، 14) بعد إدخال تنكس الشبكية، أجرينا تحليلات المناعي لعلامات الخلية الدبقية GS و توصيني (الشكل 5). وأجريت تجارب مرة أخرى على ثلاثة عيون الأسماك الثلاثة دون تحليل كمي. ع يلعب دوراً مهما في التحكم في مستوى غلوتامات خارج الخلية، ويعتبر أن يعبر حصرا في سوما MC ولها19،العمليات20. هو توصيني upregulated أثناء الشيخوخة وعند تلف الشبكية أو أكد. هو مترجم في النهاية MC-القدمين والعمليات21. ووجد أيضا ضعف توصيني التعبير في الجزء الداخلي من الشبكية يصب لمراقبة وضع العلامات الأخرى أنواع الخلايا الدبقية، مثلاً، أستروسيتيس. أوتوفلوريسسينسي الجزء الخارجي للعلاقات العامة قدمت أيضا إشارة في ONL ولكن يمكن أن يكون هذا التمييز بوضوح بين. وكان إشارة توصيني أوبريجولاتيد في اليوم الثالث بعد الإصابة. وبالتالي، إجراء تحاليل في اليوم الثالث بعد العلاج بالليزر أظهرت MCs توصيني الإيجابية فقط داخل موقع الإصابة في ONL الشبكية. من يوم 14، التجديد قد اكتمل إلى حد كبير وإشارة توصيني دوونريجولاتيد إلى مستوى خط الأساس في مجال الأضرار. على عكس توصيني لم يطرأ أي تغيير كبير في مستوى التعبير من فئة الخدمات العامة. ومع ذلك، قد تكون هناك downregulation مترجمة من فئة الخدمات العامة في موقع الإصابة.
رقم 1: الإعداد لتنظيم دورات تعريفية لإصابة ليزر الشبكية الزرد وعقب تحليل OCT. (أ) ترتيب نظام ليزر قبل العلاج. الزرد (أ-1) توضع على حامل دبوس سيليكون مع العدسات اللاصقة النظارة في المكان قبل تطبيق شعاع الليزر. (ب) ترتيب نظام أكتوبر قبل التصوير. وضع الزرد (باء-1) قبل د 78 فتحه العدسة مصباح قبل الكشف عن مواقع الضرر عن طريق أكتوبر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الإعداد للحصول على صور الأشعة تحت الحمراء وأكتوبر. (أ) لقطة نافذة البرنامج أثناء التصوير. يصور أوضاع الأشعة تحت الحمراء وأكتوبر. (ب) نظرة عامة على لوحة تستخدم للحصول على الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الأشعة تحت الحمراء (يسار) والصور (يمين) أكتوبر من المواقع المتضررة ويصب من الشبكية في نفس العين في وقت مختلف النقاط (أيام 0، 1، 3، 7، 14 و 6 أسبوع) بعد انحلال الشبكية المستحثة بالليزر- في صور الأشعة تحت الحمراء، مربع أخضر يشير إلى جزء الشبكية التي يتم تحليلها والخط الأخضر تبين موقع الصور أكتوبر على الشبكية. تشير الأسهم إلى مواقع البقع الليزر الكشف عن الإشارات فرط الانعكاسية في شريط مقياس أكتوبر = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: ح & ه تلطيخ المصابين و contralateral يصب العين الزرد في وقت مختلف النقاط (أيام 0، 1، 3، 7، 14 و 6 أسبوع) بعد انحلال الشبكية المستحثة بالليزر- GC، طبقة خلايا العقدة؛ المكتب، الطبقة النووية الداخلية؛ ONL، طبقة النووي الخارجي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: كشف المناعي للتنشيط MC. توصيني (الأخضر) وفئة الخدمات العامة (أحمر) تلطيخ في الشبكية الزرد الجرحى ويصب في وقت مختلف النقاط (أيام 0، 3، 14) بعد انحلال الشبكية المستحثة بالليزر. إشارة خضراء في ONL سبب أوتوفلوريسسينسي س العلاقات العامةشرائح أوتير. نواة الخلية هي ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تجديد/تنكس الشبكية في الزرد كانت قد أجرت التحقيق نهج مختلفة مثل موت الخلية بوساطة سيتوتوكسين22والإصابة الميكانيكية23إصابة الحرارية24. استخدمنا 532 نانومتر ليزر صمام ثنائي تلف الشبكية الزرد. وبالتالي، لدينا نموذج يوفر العديد من المزايا. على سبيل المثال، أنشأنا سرعة منطقة محددة جيدا من إصابة مترجمة في الشبكية الخارجي، على وجه التحديد في طبقة للحد من الفقر. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا التشكيل التجريبي لإنتاج مساحات أكبر من الضرر لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى، على سبيل المثال، بإتلاف غشاء بروخ لحمل neovascularization تشورويدال. هناك الحد الأدنى من الأضرار الجانبية ويمكن التضمين توقيت الاستجابة التجدد بدقة وتكاثر.
لمتابعة التغييرات الشكلية على مر الزمن، استخدمنا النظام "سبيكتراليس هايدلبرغ" وبرنامج Explorer العين هايدلبرغ. وهكذا، تم العثور على تصوير قاع الأشعة تحت الحمراء لتكون مفيدة بشكل خاص في الزرد. على عكس النظارة أوتوفلوريسسينسي (AF)، مما يدل على النقيض منخفضة بين بقعة ليزر والمنطقة المحيطة بها، المواقع المتضررة أسهل لتعريب بالتصوير بالأشعة تحت الحمراء. وهذا يسمح لنا بالكشف عن التغييرات ورصد التجديد في فيفو، الذي لن يكون ممكناً مع وضع AF. كما ذكر سابقا25، يمكن استخدام OCT لرصد العمليات التنكسية/التجدد في الشبكية الزرد. في نموذجنا، تم الكشف عن إصابة ليزر الشبكية كعصابة فرط الانعكاسية في ONL (الشكل 3)، ومماثل لما تم الإبلاغ عنه في الثدييات26. أثناء التجديد، انخفضت إشارة فرط الانعكاسية حتى أنه اختفى تماما في 14 يوم.
الصور أكتوبر كان يرتبط بالتغييرات الشكلية التي ينظر إليها ضمن الآفات الليزر (الشكل 4). يمثل إشارة فرط الانعكاسية منتشر في أكتوبر الصور (يوم 0) الليزر بعد التغييرات في المكتب الزرد euthanized 1 ساعة بعد العلاج بالليزر. يناظر دهاء ومحددة المعالم فرط الانعكاسية تم الكشف عن إشارة في يوم 3 تشكيل تجويف في ONL سبب فقدان رود. ابتداء من يوم 14، كلا OCT وتؤكد التحليلات النسيجي أن شبكية العين الخارجي قد أعادت لها مورفولوجيا العادي.
في الدراسة الحالية، ونحن أيضا تقييم استجابة MC أثناء التجديد الشبكية (الشكل 5). وحققت العديد من المجموعات الفعل تنشيط الخلايا الدبقية، ولا سيما من الإشراف، كاستجابة أولية التجديدي للتلف. وبشكل أكثر تحديداً، واقترحوا أن الفيزيولوجية المرضية MC التنشيط قد حمل الإشراف على اعتماد خصائص الخلايا الجذعية، توفير مصدر ذاتية لأداء الخلية الأنواع الجديدة التي يمكن دمجها في المناطق المتضررة من الشبكية27. كما هو متوقع، وجدنا أن الإصابة ليزر الشبكية وحفز MC التنشيط كما هو مبين من قبل upregulation توصيني. والواقع أن زيادة توصيني التعبير اكتشفت ملحوظ في الإصابة بعد 3 أيام وكان يقتصر على مجال الضرر. ابتداء من يوم 14، التجديد قد اكتمل إلى حد كبير وكان إشارة توصيني دوونريجولاتيد إلى مستوى خط الأساس في مجال الأضرار. وهكذا، لقد أظهرنا أن MCs تضطلع بدور نشط في إعادة التنظيم الشبكية، ويحتمل أن التجدد، بعد إصابة.
وفي الختام، الطراز المستحثة بالليزر تنكس الشبكية/التجديد أداة متعددة الاستخدامات لإنتاج التلف السريع والتنسيق للشبكية الزرد، ويمكن تصور التجديد التالية بتصوير أكتوبر غير الغازية. بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على إظهار أن تنكس الشبكية الليزر مصحوبا بالتنشيط MC وأن عكس الدباق التي تلت ذلك على التجدد. ومع ذلك، يحتاج تحقيق مفصل لأنواع الخلايا المعنية (مثلاً، ميكروجليا، الضامة) والممرات التي يتعين القيام بها. قد يلزم التعديلات الهامة، لا سيما لايف تتبع للإشراف فهم كيف تتصرف أثناء عملية التجدد (مثل الهجرة من موقعها الأصلي بالمكتب في الشبكية الخارجي، لا سيما في طبقة استراتيجية الحد من الفقر) وعلى التمايز تجاه الخلايا للعلاقات العامة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام نماذج الأضرار الخفيفة للحث على نطاق واسع ومتسقة فقدان رود ومخروط28من استراتيجيات الحد من الفقر. استفادة نموذج وصف غير منطقة إصابة أكثر تحديداً حيث واحدة يمكن دراسة التفاعلات المحلية بين تردي photoreceptors والإشراف المنشط.
بشكل عام، نعتقد أن النموذج سوف يساعد على فهم أفضل للعمليات التنكسية/التجدد في شبكية العين الحسية وقد تمكن المقارنة بين هذه التطورات مع نظام الثدييات. ويمكن استخدامه أيضا لدراسة تأثير نظام المناعة الفطرية وآثار المواد نيورواكتيفي. في المستقبل، واحدة قد تكون قادرة على استخدام هذه النتائج لتعديل نظام البصرية تردي الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر مارتن زنكيرناغل، دكتوراه في الطب ودكتوراه وميريام ريسينهوفير، دكتوراه لبلدها المدخل العلمي في وضع النموذج ونشهده فريدريكا لها المساعدة التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
