Summary
Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.
Abstract
Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è il potenziale permanente della retina Teleostei per neurogenesi retinica e la rigenerazione dopo gravi danni. Studiando le vie di rigenerazione in zebrafish potrebbe portare a nuove comprensioni di sviluppare strategie innovative per il trattamento di malattie degenerative retiniche nei mammiferi. Qui, ci siamo concentrati sull'induzione di una lesione focale a retina esterna in zebrafish adulto per mezzo di un laser a diodo 532 nm. Una lesione localizzata permette di indagare i processi biologici che avvengono durante la degenerazione retinica e rigenerazione direttamente presso l'area di danno. Usando la tomografia a coerenza ottica non invasiva (OCT), siamo stati in grado di definire la posizione della rigenerazione successiva area e monitor danneggiata in vivo. Infatti, la formazione immagine OCT produce immagini ad alta risoluzione, a sezione trasversale della retina zebrafish, fornendo informazioni che era precedentemente disponibile solo con le analisi istologiche. Al fine di confermare i dati da ott in tempo reale, sono state eseguite sezioni istologiche e risposta rigenerativa dopo l'induzione della lesione retinica è stata studiata da immunohistochemistry.
Introduction
Visione è probabilmente il senso più essenziale dell'essere umano e la sua svalutazione ha un alto impatto socio-economico. Nei paesi industrializzati, le malattie degenerative retiniche rappresentano la maggior parte della perdita della vista e cecità fra la popolazione adulta1. Retinite pigmentosa (RP) è la causa ereditaria più comune di cecità nella gente fra le età di 20 e 60, che colpisce circa 1,5 milioni di persone in tutto il mondo2,3. È una famiglia eterogenea di malattie retiniche ereditarie caratterizzata da perdita progressiva dei fotorecettori (PRs) seguita da degenerazione dell'epitelio retinico del pigmento e, successivamente, il gliosis e il rimodellamento di neuroni interno4. Il corso della malattia può essere spiegato dalla perdita incrementale dei due tipi cellulari PR, solitamente a partire con i coni retinici, che sono responsabili della visione acromatico nella luce fioca e coni, che sono essenziali per la visione e l'acuità visiva del colore5. Un singolo difetto di gene è sufficiente per causare la RP. Finora più di 130 mutazioni in oltre 45 geni sono state associate con la malattia6. Questo conduce a diversi fenotipi di malattia ed è una ragione per cui la terapia genica è non generalizzabile e così un approccio terapeutico intricato. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di sviluppare nuove strategie terapeutiche generali per il trattamento di degenerazioni retiniche in accecante malattie.
Degenerazione retinica spesso comporta perdita di PR; Pertanto, la morte delle cellule di PR è un marchio di garanzia di processi degenerativi della retina7. Già è stato dimostrato che la morte delle cellule PR stimola Müller glia cella (MC) attivazione e proliferazione8. MCs, il tipo di cellule gliali principali nella retina dei vertebrati, una volta sono stati considerati per essere nient'altro che una "colla" tra neuroni retinici. Negli ultimi anni, molti studi hanno dimostrato che MCs agire come più di mera strutturali sostengono il9. Tra le diverse funzioni, MCs partecipare anche nella neurogenesi e10di riparazione. Infatti, in risposta a fattori diffusibili dalla degenerazione retina, MCs significativamente aumentare l'espressione di proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Di conseguenza, GFAP etichettatura può essere utilizzato come un indicatore per l'attivazione di MC come una risposta secondaria a lesioni retiniche e degenerazione11.
Recentemente, abbiamo sviluppato un adattamento del romanzo di lesioni focali usando un laser per indurre la degenerazione retinica in zebrafish (Danio rerio). Lesione focale è vantaggioso per lo studio di alcuni processi biologici come la migrazione delle cellule nel sito di feriti e la tempistica precisa degli eventi che si svolgono durante la rigenerazione della retina12. Inoltre, il pesce zebra è diventato importante nella ricerca visiva a causa delle somiglianze tra il sistema visivo e quello di altri vertebrati. Lorda caratteristiche morfologiche ed istologiche di retine umane e Teleostei visualizzano alcune differenze. Di conseguenza, retine umane e zebrafish contengono le stesse classi principali delle cellule organizzate nello stesso modello a strati, dove la luce-sensing fotorecettori occupano lo strato più esterno, mentre i neuroni di proiezione retinica, le cellule del ganglio, risiedono nella parte più interna un neurone strato, prossimale alla lente. Gli interneuroni retinici, amacrine, bipolare e cellule orizzontali, localizzano tra strati di cellule del fotoricettore e del ganglio13. Inoltre, la retina di zebrafish è dominata dal cono e quindi più vicino alla retina umana che, ad esempio, la retina del roditore intensamente studiata. Un'affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è la persistente neurogenesi nella retina di pesce e rigenerazione della retina dopo danni. In zebrafish, MCs può dedifferentiate e mediare la rigenerazione in retina feriti14,15. Nel pollo, MCs hanno alcune capacità anche di inserire nuovamente il ciclo cellulare e di dedifferentiate. A seguito di lesione retinica in pesci adulti, MCs adottare determinate caratteristiche di cellule staminali e progenitrici, la migrazione verso il tessuto retinico danneggiato e produrre nuovi neuroni16. Profili di espressione genica di mammiferi MCs ha rivelato somiglianze inaspettate ai progenitori della retina, e prova per potenziale neurogenico intrinseco di MCs nella pollo, roditore e nella retina umana sta sviluppandosi17. Tuttavia, perché la risposta rigenerativa negli uccelli e nei mammiferi è inferiore rispetto con la risposta robusta nel pesce non è ancora capito. Di conseguenza, la comprensione dei meccanismi di riparazione endogena in zebrafish può suggerire strategie per stimolare la rigenerazione della retina in mammiferi ed esseri umani. Impiegando il meccanismo di riparazione endogena di MCs come strumento terapeutico per il trattamento dei pazienti con degenerazione retinica avrebbe un impatto eccezionale per la nostra società.
Qui, forniamo i passaggi necessari per utilizzare il modello di degenerazione/rigenerazione nella ricerca oftalmica. Prima ci siamo concentrati sulla induzione del danno focale nella retina neurosensoriale, quindi sulla formazione immagine degli eventi in via di sviluppo presso il sito di lesione e infine visualizzante coinvolgimento di MCs adiacente. Il protocollo generale è relativamente facile da effettuare e si apre una vasta gamma di possibilità per la valutazione della retina in seguito.
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Protocol
tutti gli esperimenti aderito all'istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e il rispetto dei relativi regolamenti delle autorità governative.
1. animali
- TgBAC mantenere (gfap:gfap-GFP) ceppo di zebrafish 167 (AB) di età compresa tra 6-9 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un ciclo luce/buio di 14/10 h 18.
- Seguire le istruzioni di cura degli animali delle istituzioni coinvolte per esperimenti sugli animali dopo l'approvazione da parte delle autorità governative.
2. Anestesia sistemica reversibile
- preparare la soluzione stock di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate sale (tricaina) sciogliendo 400 mg di polvere di tricaina in 97,9 mL di serbatoio acqua e 2,1 mL di 1 M di Tris buffered saline (TBS). Regolare il pH 7.0 con 1 M Tris (pH 9) e conservare a 4 ° C nel buio fino a un mese.
Nota: Tricaina dovrebbe essere preparato in acqua come le condizioni di vita naturale dell'animale, dovrebbe essere usato preferibilmente acqua serbatoio originale. - Diluire la soluzione di riserva 01:25 in serbatoio di acqua e utilizzare subito.
- Inserire un 10cm di Petri contenente 50 mL di soluzione di anestesia, fino a quando diventano immobile e non rispondono agli stimoli esterni (circa 2-5 min, a seconda del peso e l'età) di zebrafish.
- Trasferire ogni pesce a mano a un titolare di pin del silicone su misura per il trattamento laser ( Figura 1A).
ATTENZIONE! Il pesce può rimanere anestetizzato di fuori del serbatoio per solo fino a 10 min. - Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o formazione immagine, posizionare il danio zebrato nel contenitore contenente acqua serbatoio.
- Per supportare il ripristino, creare un flusso di fresco serbatoio acqua attraverso le branchie spostando zebrafish avanti e indietro nell'acqua.
3. Lesione focale sulla Retina del laser
Nota: A 532 nm diodo laser viene utilizzato per creare danno luce focale sulla retina di zebrafish. Il set-up sperimentale del laser consente la creazione di una lesione retinica focale riproducibile in zebrafish adulto.
- Impostare la potenza di uscita del laser: 70 mW; diametro antenna: 50 µm; durata impulso: 100 ms.
attenzione! L'utilizzo della luce laser richiede protettivi appropriati ed etichettatura dell'area. - Applicare 1-2 gocce di 2% idrossipropilmetilcellulosa topicamente nell'occhio prima del trattamento e utilizzare una lente del laser del fondo 2,0 mm per focalizzare il fascio di puntamento laser sulla retina.
ATTENZIONE! idrossipropilmetilcellulosa gocce sono viscosi e può causare problemi di respirazione se si va sulle lamelle. - Posto quattro laser macchie intorno al nervo ottico sulla sinistra dell'occhio e usare l'occhio destro, non trattato come controllo interno.
4. In vivo Imaging della morfologia retinica
- il giorno 0, visualizzare la retina di zebrafish direttamente dopo l'induzione di laser senza riportarli dall'anestesia. A tutti gli altri punti di tempo, impiegare l'anestesia generale (vedere sezione 2: anestesia sistemica reversibile). Posizionare il zebrafish immobilizzato su un supporto di pin del silicone su misura ( Figura 1 B, b. 1).
- Per ottenere immagini ottimali, tagliare una lente a contatto idrogel commercialmente disponibili per adattare l'occhio di zebrafish (Ø = 5,2 mm, r = 2.70 mm, spessore centro = 0,4 mm) per mezzo di un punzone di foro. Riempire la superficie concava della lente con metilcellulosa e metterlo sopra la cornea.
- Dotare il sistema di OCT con una lente di lampada fessura senza contatto 78D.
- a fuoco l'immagine ad infrarosso (IR) in IR + OCT mode ( Figura 2A) per visualizzare il fondo dell'occhio e l'IR foto cliccando il " Acquire " pulsante ( Figura 2B) per localizzare il macchie sulla retina utilizzando il sistema del laser ' software s. Modalità di
- Visualize una sezione tridimensionale degli strati retinici in IR + OCT e scattare le foto cliccando il " Acquire " pulsante ( Figura 2B). Osservare la gravità delle lesioni nello strato nucleare esterno (ONL) (vedere sezione 3: Laser lesione focale sulla retina) in queste immagini.
- Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o formazione immagine posto zebrafish in un recipiente contenente acqua serbatoio.
- Per supportare il ripristino, creare un flusso di fresco serbatoio acqua attraverso le branchie spostando zebrafish avanti e indietro nell'acqua.
- Eseguire simili in vivo imaging della morfologia retinica il giorno 1, 3, 7, 14 e settimana 6.
5. Ematossilina & eosina (H & E) colorazione
- eutanasia zebrafish di immersione in freddo (4 ° C) soluzione di anestesia sul ghiaccio per almeno 10 min ed enucleare gli occhi immediatamente per mezzo di piccola pinzetta.
- Fissare gli occhi tutto in paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per 20 h e quindi disidratare i campioni in una serie di graduali alcool (xilene 100% per 5 min due volte, etanolo 100% per 5 min due volte, etanolo 96% per 3 min due volte ed etanolo 70% 3 mi n una volta).
ATTENZIONE! PFA può essere irritante per gli occhi, il naso e la traccia delle vie respiratorie superiore. PFA è un agente cancerogeno umano conosciuto e un sospetto rischio riproduttivo. - Incorporare i campioni in paraffina, tagliare 5 µm sezioni a livello della testa del nervo ottico e montarli sulle lastre di vetro.
- Macchia le sezioni Sparaffinatura con soluzione di Ematossilina acida di 0,1% per 5 min e immergere i vetrini due volte in acqua distillata dopo l'immersione le diapositive nel mix di acido cloridrico (2 mL 25% HCl in 250 mL di acqua distillata acqua) e mescolare (2 mL 25% di ammoniaca in 250 mL di ammoniaca acqua distillata). Macchia le sezioni con Eosina G soluzione acquosa allo 0,5% per 3 minuti dopo lo sviluppo dell'intensità dell'ematossilina macchiatura di acqua del rubinetto per almeno 10 min.
- Montare i vetrini disidratati in mezzo di montaggio di resina acrilica e osservare i vetrini al microscopio luce.
6. Immunohistochemistry per l'attivazione di MC
- scaldare le sezioni Sparaffinatura nel buffer di recupero di antigene (Tris-EDTA + 0.05% detergente non ionico, pH 9.0) per 3 minuti in un piroscafo appropriato o un forno a microonde per 10-15 min e lavare tre volte con TBS per 5 ogni min.
- Blocco cerchio le sezioni con un silicone penna e aggiungere 100 µ l soluzione (TBS + siero normale di capra 10% + 1% albumina di siero bovino, pH 7.6) a temperatura ambiente per 1 h.
- Macchia con anticorpo policlonale di coniglio anti-proteina fibrillare acida (GFAP) e con l'anticorpo monoclonale del mouse anti-glutamina sintetasi (GS), entrambi in una diluizione di 1: 200 (40 µ l per campione). Incubare il vetrino in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Lavare tre volte con TBS + 0.1% Tween 20 per 5 minuti ciascuno.
- Visualizzazione di finitura con l'appropriato anticorpi secondari. Questo protocollo utilizzato un anti-coniglio di capra IgG H & anticorpo secondario L verde per GFAP e un anti-topo di capra IgG H & L rosso brillante per GS, entrambi in una diluizione di 1: 500 a temperatura ambiente per 1 h.
- Montare i vetrini con mezzo di montaggio contenente DAPI e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
OCT in tempo reale: al fine di analizzare il ruolo di MCs in riparazione retinica, abbiamo usato un modello di lesione laser inducendo una zona ben delineata di danno nella retina zebrafish. Il sito del danno era imaged mediante OCT in vivo per la prima volta (giorno 0) entro 60 minuti dopo l'infortunio (Figura 3). Per compensare l'ottica del fish eye, una lente a contatto su misura è stato disposto sulla cornea. Immediatamente dopo il trattamento laser, un segnale di iper-riflettente diffuso è stato localizzato la retina esterna (frecce). Si è esteso da dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) allo strato plexiform esterno (OPL). Un segnale simile era inoltre rilevabile il giorno 1. Dopo 3 giorni, questo segnale diffuso è diventato più organizzata e densa. Lo si vede costantemente nello strato nucleare esterno (ONL) che si estende nello strato dei fotorecettori. Dopo la prima settimana (giorno 7), c'era una diminuzione significativa nella dimensione della lesione medio e solo un piccolo segnale di iper-riflettente è stato rilevato. A partire dal giorno 14 fino a quando l'ultimo punto di tempo indagato (6 settimane), i punti laser non erano più visibili nelle immagini IR e OCT.
La valutazione istologica di retinico degenerazione/rigenerazione: al fine di indagare l'estensione e la cinetica di retinico degenerazione/rigenerazione, H & E colorazione è stato impiegato in diversi momenti dopo induzione di danno (giorno 0, 1, 3, 7, 14 ed alla settimana 6) (Figura 4). Gli esperimenti sono stati eseguiti su tre occhi di tre pesci. Tuttavia, nessuna analisi statistica è stata eseguita come l'obiettivo di questo manoscritto è quello di illustrare il metodo. Sottili cambiamenti nello strato nucleare interno (INL) e ONL può essere visto immediato post-laser (ad es., lieve edema nella ONL) e ridotto spazio intercellulare nell'INL entro 60 minuti dopo il trattamento laser. La degenerazione è stata seguita per 6 settimane dopo l'induzione della lesione laser. I cambiamenti morfologici sono stati costantemente osservati dopo 1 giorno con disorganizzazione del PRs e con una formazione di cavità nella ONL e nello spazio subretinal. Infatti, c'era una perdita di nuclei all'interno il ONL in zona danni fra i giorni 1 e 7. La massima perdita di PR è stata trovata il giorno 3. A partire da 14 giorni a 6 settimane, la retina esterna aveva ristabilito la sua morfologia normale.
Glial coinvolgimento durante retinico degenerazione/rigenerazione: per valutare l'attivazione di MC in diversi momenti (giorno 0, 3, 14) dopo l'induzione di degenerazione retinica, abbiamo effettuato le analisi di immunohistochemical per gli indicatori delle cellule glial GS e GFAP (Figura 5). Gli esperimenti sono stati ancora eseguiti su tre occhi di tre pesci senza analisi quantitativa. GS svolge un ruolo importante nel controllare il livello di glutammato extracellulare ed è considerato esclusivamente espressi in MC soma e relativi processi19,20. GFAP è aumentato durante l'invecchiamento e quando la retina è danneggiata o stressata. Esso è localizzato nei MC fine-piedi e processi21. Espressione di GFAP debole inoltre è stato trovato nella parte interna della retina illeso-controllo etichettatura altri tipi di cellule gliali, ad esempio, gli astrociti. L'autofluorescenza dei segmenti esterni PR anche fornito un segnale nella ONL ma questo potrebbe essere chiaramente distinto. Il segnale GFAP era sovraregolati a alberino-ferita di giorno 3. In tal modo, le analisi effettuate al giorno 3 dopo il trattamento laser ha mostrato MCs GFAP-positive solo all'interno del sito di lesione in ONL della retina. Dal giorno 14, la rigenerazione era in gran parte completa e il segnale GFAP downregulated a livello della linea di base nel settore danni. A differenza di GFAP non ci era cambiamento considerevole del livello di espressione di GS. Tuttavia, ci potrebbe sono stati un downregulation localizzato del GS al luogo della ferita.
Figura 1: programma di installazione per l'induzione della lesione laser della retina di zebrafish e seguito analisi OCT. (A) disposizione del sistema laser prima del trattamento. Zebrafish (a. 1) posizionato sul supporto di pin del silicone con lenti a contatto del fondo in luogo appena prima dell'applicazione del fascio laser. (B) disposizione del sistema OCT prima di formazione immagine. Zebrafish (b. 1) posizionato prima 78D fessura lampada lente prima della rilevazione dei siti danno per mezzo di ottobre Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: installazione per acquisire le immagini IR e OCT. (A) Screenshot della finestra del software durante la formazione immagine. Modalità IR e OCT sono raffigurate. (B) Panoramica del pannello utilizzato per acquisire le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: IR (a sinistra) e immagini (a destra) di ottobre dei feriti e illesi siti della retina nello stesso occhio in tempi diversi punti (giorni 0, 1, 3, 7, 14 e 6 settimane) dopo la degenerazione retinica indotta da laser. Nelle immagini IR, una casella verde indica la parte della retina che ha essere analizzati e la linea verde indica la posizione delle immagini OCT sulla retina. Le frecce indicano siti dei punti laser rilevati come iper-riflettente segnali nella barra della scala ott. = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: H & E colorazione dei feriti e il controlaterale indenne zebrafish occhio in tempi diversi punti (giorni 0, 1, 3, 7, 14 e 6 settimane) dopo la degenerazione retinica indotta da laser. GC, strato delle cellule del ganglio; INL, strato nucleare interno; ONL, strato nucleare esterno. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: rilevazione Immunohistochemical dell'attivazione di MC. GFAP (verde) e GS (rosso) colorazione nella retina zebrafish feriti e illeso in tempi diversi punti (giorni 0, 3, 14) dopo degenerazione retinica indotta da laser. Il segnale verde nel ONL è dovuto l'autofluorescenza della PR osegmenti di uter. Nuclei delle cellule sono macchiati con DAPI (blu). Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Rigenerazione/degenerazione retinica in zebrafish è stata studiata da diversi approcci quali citotossina-mediata delle cellule morte22, danno meccanico23e lesione termica24. Abbiamo impiegato un laser a diodo 532 nm per danneggiare la retina di zebrafish. In tal modo, il nostro modello offre diversi vantaggi. Per esempio, abbiamo creato rapidamente un'area ben definita di lesioni localizzate in retina esterna, in particolare nello strato PRs. Inoltre, è possibile modificare questo set-up sperimentale per produrre più grandi aree di danno per studiare altri processi biologici, ad esempio, danneggiando la membrana di Bruch per indurre il neovascularization coroidico. Ci sono danni collaterali minimi e i tempi della risposta rigenerativa possono essere modulato in modo preciso e riproducibile.
Per seguire le modifiche fenotipiche nel corso del tempo, abbiamo impiegato il sistema di Heidelberg Spectralis e il software di Heidelberg occhio Explorer. Così, la formazione immagine del fondo IR è stata trovata per essere particolarmente utile in zebrafish. A differenza di autofluorescence del fondo (AF), che mostra il basso contrasto tra il punto di laser e la zona circostante, i siti danneggiati sono più facili da localizzare da formazione immagine IR. Questo ci permette di rilevare i cambiamenti e di monitorare rigenerazione in vivo, che non sarebbero possibili con la modalità AF. Come precedentemente segnalato25, OCT può essere utilizzato per monitorare i processi degenerativi/rigenerativi nella retina di zebrafish. Nel nostro modello, lesioni retiniche laser è stato rilevato come una banda iper-riflettente in ONL (Figura 3), che è simile a quello che è stato segnalato in mammiferi26. Durante la rigenerazione, il segnale di iper-riflettente è diminuito fino a scomparire totalmente al giorno 14.
Le immagini di ottobre sono state correlate con i cambiamenti morfologici visti all'interno delle lesioni di laser (Figura 4). Il diffusa iper-riflettente del segnale nelle immagini di ottobre (giorno 0) rappresenta le modifiche post-laser vista in INL di zebrafish eutanasia entro 1 ora dopo il trattamento laser. Il segnale di iper-riflettente sottile e ben delineato rilevato al giorno 3 corrisponde alla formazione di cavità in ONL a causa della perdita di asta. A partire dal giorno 14, entrambi OCT e analisi istologiche confermano che la retina esterna aveva ristabilito la sua morfologia normale.
Nello studio presente, abbiamo valutato anche la risposta di MC durante la rigenerazione della retina (Figura 5). Molti gruppi hanno già studiato l'attivazione delle cellule gliali, specialmente di MCs, come una risposta rigenerativa iniziale ai danni. Più in particolare, ci hanno suggerito che fisiopatologico MC attivazione può indurre MCs di adottare caratteristiche delle cellule staminali, fornendo una fonte endogena di nuovi tipi di cella funzionante che può essere integrato in aree danneggiate della retina27. Come previsto, abbiamo trovato che la lesione retinica laser stimolato MC attivazione come indicato dal upregulation di GFAP. Infatti, espressione di GFAP aumentata notevolmente è stato rilevato all'alberino-ferita di 3 giorni ed è stato limitato alla zona di danni. A partire dal giorno 14, la rigenerazione era in gran parte completa e il segnale GFAP downregulated al livello della linea di base nella zona di danni. Così, abbiamo dimostrato che MCs gioca un ruolo attivo nella riorganizzazione della retina e, potenzialmente, rigenerazione, dopo la lesione.
In conclusione, il modello di degenerazione/rigenerazione retinica indotta da laser è uno strumento versatile per la produzione rapido e focali danni alla retina di zebrafish e la rigenerazione seguente possa essere visualizzata da imaging non-invasivo di OCT. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare che la degenerazione retinica-laser è accompagnata dall'attivazione di MC e che il conseguente gliosis è invertito dopo la rigenerazione occorre. Tuttavia, deve essere eseguita un'indagine dettagliata delle vie e tipi cellulari coinvolti (ad es., microglia, macrofagi). Possono essere necessarie modifiche critiche, soprattutto live tracking di MCs per capire meglio come si comportano durante il processo rigenerativo (ad esempio, la migrazione dalla loro posizione originale nell'INL in retina esterna, soprattutto nello strato PRs) e la loro differenziazione verso le cellule PR. In alternativa, paradigmi danno leggero potrebbero essere utilizzati per indurre la perdita diffusa e coerenza della canna e del cono PRs28. Tuttavia, il vantaggio il modello descritto è un'area di lesioni più definita, dove si possono studiare interazioni locali tra degenerazione fotorecettori e MCs attivato.
In generale, riteniamo che il modello vi aiuterà a comprendere meglio i processi degenerativi/rigenerativi nella retina sensoriale e può consentire il confronto di questi sviluppi con il sistema dei mammiferi. Potrebbe anche essere usato per studiare l'influenza del sistema immunitario innato e gli effetti di sostanze neuroattive. In futuro, uno potrebbe essere in grado di utilizzare questi risultati per modificare il sistema visivo umano degenerazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD per il suo contributo scientifico a stabilire il modello e Federica Bisignani per la sua eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
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