Summary
Zebrafiskar är en populär djurmodell att studera mekanismer av retinal degeneration/regeneration hos ryggradsdjur. Det här protokollet beskriver en metod för att framkalla lokaliserad skada störa yttre näthinnan med minimal skada på inre näthinnan. Därefter, övervakar vi i vivo näthinnans morfologi och Müller glia svaret i hela retinal regenerering.
Abstract
En fascinerande skillnad mellan Benfisk och däggdjur är livslångt potentialen för lever näthinnan för retinal neurogenes och förnyelse efter allvarliga skador. Undersöka de regenerering vägarna i zebrafiskar kan föra nya insikter att utveckla innovativa strategier för behandling av retinala degenerativa sjukdomar hos däggdjur. Häri, fokuserade vi på induktion av en fokal lesion på yttre näthinnan i vuxen zebrafisk genom en 532 nm diode laser. En lokaliserad skada kan undersöka biologiska processer som äger rum under retinal degeneration och regeneration direkt på området av skador. Använda icke-invasiv optisk koherenstomografi (OCT), vi skulle kunna definiera platsen för den skadade området och övervaka efterföljande regenereringen invivo. Faktiskt, OCT imaging producerar högupplösta, tvärsnittsdata bilder av zebrafisk näthinnan, som tillhandahåller information som var tidigare bara tillgänglig med histologiska analyser. För att bekräfta data från realtid OCT, histologiska sektioner utfördes och regenerativ svar efter induktion av retinal skadan undersöktes av immunohistokemi.
Introduction
Vision är förmodligen den mest grundläggande känslan av människan och dess nedskrivning har en hög socioekonomiska inverkan. I den industrialiserade världen står retinala degenerativa sjukdomar för majoriteten av synnedsättning och blindhet bland den vuxna befolkning1. Retinitis pigmentosa (RP) är den vanligaste ärftliga orsaken till blindhet hos personer i åldrarna 20 till 60, som drabbar cirka 1,5 miljoner människor världen över2,3. Det är en heterogen familj av ärftlig näthinnesjukdom kännetecknas av progressiv förlust av fotoreceptorer (PRs) följt av degeneration av pigmentepitelet och därefter gliosis och ombyggnad av inre nervceller4. Loppet av sjukdomen kan förklaras av inkrementella förlusten av de två PR-celltyper, vanligtvis börjar med stavar, som ansvarar för akromatisk vision i svagt ljus och kottar, som är väsentliga för färg vision och synskärpa5. En enda gendefekt är tillräcklig för att orsaka RP. Hittills har mer än 130 mutationer i gener som över 45 förknippats med sjukdom6. Detta leder till varierande sjukdom fenotyper och är en anledning till att genterapi är icke-generaliserbara och thus en intrikat terapeutisk metod. Därför finns det ett brådskande behov att utveckla nya allmänna terapeutiska tillvägagångssätt för att behandla retinal degeneration i bländande sjukdomar.
Retinal degeneration ofta innebär PR förlust; Därför är PR celldöd ett kännetecken för de degenerativa processerna i näthinnan7. Det har redan visat att PR celldöd stimulerar Müller glia cell (MC) aktivering och spridning8. MCs, den stora gliaceller Celltypen i ryggradsdjur näthinnan, en gång ansågs vara inget annat än ett ”klister” mellan näthinnans nervceller. Under de senaste åren har många studier visat att MCs agera som mer än enbart strukturella stöd9. Bland de olika funktionerna, MCs delta också i neurogenes och reparera10. Verkligen, som svar på diffusible faktorer från degenererande näthinnan, MCs avsevärt öka glial fibrillary sura (Fredsgenomförande) proteinuttryck. Fredsgenomförande märkning kan därför användas som en markör för MC aktivering som en sekundär reaktion på skada och degeneration11.
Nyligen har utvecklat vi en ny anpassning av fokal skada med hjälp av en laser för att inducera retinal degeneration i zebrafisk (Danio rerio). Fokal skada är fördelaktigt för att studera vissa biologiska processer såsom migration av cellerna i den skada platsen och exakta tidpunkten för händelser som äger rum under retinal regenerering12. Dessutom blivit zebrafiskar viktigt i visuella forskning på grund av likheterna mellan dess visuella systemet och andra ryggradsdjur. Brutto morfologiska och histologisk funktioner i mänskliga och lever retinae visar några skillnader. Följaktligen, mänskliga och zebrafiskar retinae innehåller samma stora cell klasserna organiserade i samma lager mönster, där ljus-sensing fotoreceptorer ockupera det yttersta lagret, medan retinal projektion nervceller, ganglioncellerna, bor i innerst neuronala lager, proximalt linsen. De retinala interneuroner, amakrina, bipolär, och horisontella celler, lokalisera mellan ljusmätare och ganglion cell lager13. Dessutom är Sebrafisken näthinnan kon-dominerade och därför närmare mänskliga näthinnan än, exempelvis intensivt studerat gnagare näthinnan. En fascinerande skillnad mellan Benfisk och däggdjur är den ihållande neurogenes i fisk näthinnan och retinal regeneration efter skador. I zebrafiskar, kan MCs dedifferentiate och förmedlar förnyelse i skadade näthinnan14,15. I kyckling har MCs viss kapacitet också att återinträda på cellcykeln och dedifferentiate. Efter skada i vuxen fisk, MCs anta vissa egenskaper hos stamceller och stamceller, migrera till den skadade retinala vävnaden och producerar nya nervceller16. Gen uttryck profilering av däggdjur MCs avslöjat oväntade likheter med retinal stamfäder och belägg för neurogen inneboende potential för MCs i kyckling, gnagare och även mänskliga näthinnan växer17. Ändå, varför regenerativ svaret i fåglar och däggdjur är lägre jämfört med den robust svaren på fisk är ännu inte förstått. Därför kan förstå den endogena reparationsmekanismer i zebrafiskar föreslå strategier för stimulerande retinal förnyelse i däggdjur och människor. Anställa den endogena reparation mekanismen för MCs som ett terapeutiskt verktyg för behandling av patienter med retinal degeneration skulle påverka utestående för vårt samhälle.
Häri, ger vi stegen för att anställa degeneration/regenerering av modellen i oftalmologiska forskning. Först fokuserade vi på inducerande fokala skador i sensorineural näthinnan, sedan på bildtagning av händelser utvecklar vid skadan webbplats och slutligen visualisera medverkan av intilliggande MCs. Det allmänna protokollet är relativt enkelt att utföra och öppnar ett brett utbud av möjligheter för att bedöma näthinnan efteråt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla experiment följs uttalande om användning av djur i oftalmologiska och Vision forskning av föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) och respektera närstående reglementet av de statliga myndigheterna.
1. djur
- hålla TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafiskar 167 (AB) stam i åldern 6-9 månader under standart villkorar i vatten med en temperatur på 26,5 ° C och 14/10 h ljus/mörk cykel 18.
- Följ riktlinjerna för djurens vård av de involvera institutionerna för djurförsök efter godkännande av de statliga myndigheterna.
2. Reversibel systemisk anestesi
- Förbered stamlösning etyl 3-aminobensoat methanesulfonate salt (tricaine) genom upplösning 400 mg tricaine pulver i 97,9 mL tank vatten och 2,1 mL 1 m av Tris buffrad koksaltlösning (TBS). Justera till pH 7.0 med 1 M Tris (pH 9) och butik vid 4 ° C i mörker på upp till en månad.
Obs: Tricaine bör förberedas i vatten som de naturliga levnadsförhållandena djuret, helst original tank vatten ska användas. - Späd stamlösningen 1:25 i tank vatten och Använd omedelbart.
- Placera zebrafiskar till en 10 cm petriskål innehållande 50 mL anestesi lösning tills de blir orörliga och inte svarar på yttre stimuli (cirka 2-5 min, beroende på vikt och ålder).
- Överföra varje fisk för hand till en skräddarsydd silikon pin hållare för laserbehandling ( figur 1A).
FÖRSIKTIGHET! Fisken kan förbli sövda utanför tanken för upp till 10 min bara. - För att vända anestesi efter av behandling eller imaging, placera zebrafiskar i behållare som innehåller tank vatten.
- För att stödja återhämtningen, skapa ett flöde av färska tank vatten över gälarna genom att flytta zebrafiskar och tillbaka i vattnet.
3. Laser fokal skada på näthinnan
Obs: A 532 nm diode laser används för att skapa fokal lätta skador på näthinnan av zebrafiskar. Experimental set-up av laser möjliggör inrättandet av en reproducerbar fokal skada i vuxen zebrafiskar.
- Ställa in uteffekten av laser: 70 mW; Antenn diameter: 50 µm, pulslängd: 100 ms.
försiktighet! Användningen av laserljus kräver lämplig personlig skyddsutrustning och märkning av området. - Applicera 1-2 droppar 2% hydroxypropylmetylcellulosa lokalt i ögat innan behandling och använda en 2,0 mm fundus laserlinsen för att fokusera laser-syfte balken på näthinnan.
FÖRSIKTIGHET! hydroxypropylmetylcellulosa droppar är trögflytande och kan orsaka problem i andningen om det går på gälarna. - Plats fyra laser ställen runt synnerven på vänster öga och använda rätt, obehandlade ögat som internkontroll.
4. In vivo Avbildning av Retinal morfologi
- på dag 0, visualisera zebrafiskar näthinnan direkt efter laser induktion utan återuppliva dem från anestesi. Vid alla andra tidpunkter, anställa narkos (se avsnitt 2: reversibel systemisk anestesi). Placera den immobiliserade zebrafiskar på en skräddarsydd silikon PIN-hållare ( figur 1 B, B.1).
- Att erhålla optimala bilder, skär en kommersiellt tillgänglig hydrogel kontaktlinser att passa zebrafiskar ögat (Ø = 5,2 mm, r = 2.70 mm, centrum tjocklek = 0,4 mm) med hjälp av ett hålslag. Fyll den konkava ytan av linsen med metylcellulosa och placera den över hornhinnan.
- Utrusta OCT systemet med en 78D beröringsfri slit lamp lins.
- Fokusera infraröd (IR) bilden i IR + OCT-läge ( figur 2A) för att visualisera fundus i ögat och ta IR bilder genom att klicka på den " förvärva " knapp ( figur 2B) för att lokalisera den Laser fläckar på näthinnan använder systemet ' s programvara.
- Visualisera en tredimensionell avsnitt av retinala lagren i IR + OCT-läge och ta bilder genom att klicka på den " förvärva " knapp ( figur 2B). Iaktta svårighetsgraden av skada i det yttre nukleära lagret (Onlinekanaler) (se avsnitt 3: Laser fokal skada på näthinnan) i dessa bilder.
- Att vända anestesi efter av behandling eller imaging placera zebrafiskar i en behållare som innehåller tank vatten.
- För att stödja återhämtningen, skapa ett flöde av färska tank vatten över gälarna genom att flytta zebrafiskar och tillbaka i vattnet.
- Utför liknande i vivo imaging av näthinnans morfologi på dag 1, 3, 7, 14 och vecka 6.
5. Hematoxylin & Eosin (H & E) färgningen
- Euthanize zebrafisk genom nedsänkning i kall (4 ° C) anestesi lösning på is i minst 10 min och enucleate ögonen omedelbart med hjälp av små böjda pincetten.
- Fixa hela ögonen i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C under 20 h och sedan torkar proverna i en graderad alkohol serie (xylen 100% för 5 min två gånger, etanol 100% för 5 min två gånger, etanol 96% i 3 min två gånger och etanol 70% 3 mi n en gång).
FÖRSIKTIGHET! PFA kan vara irriterande för ögon, näsa och övre luftvägarna spår. PFA är en känd cancerorsak och en misstänkt reproduktiv fara. - Bädda in proverna i paraffin, klippa 5 µm sektioner på nivån av synnervspapillen och montera dem på glasskivor.
- Fläcken i deparaffinized avsnitt med 0,1% syra hematoxylin lösning för 5 min och doppa glasen två gånger i destillerat vatten efter doppa glasen i saltsyra mix (2 mL 25% HCl i 250 mL destillerat vatten) och ammoniak blanda (2 mL 25% ammoniak i 250 mL destillerat vatten). Fläcken avsnitten med eosin G vattenlösning 0,5% i 3 min efter utvecklingen av den hematoxylin färgning av kranvatten i minst 10 min.
- Montera uttorkad bilder i akrylharts monteringsmedium och observera glasen under ljusmikroskop.
6. Immunhistokemi för MC aktiveringen
- hetta i deparaffinized avsnitt i antigen retrieval buffert (Tris-EDTA + 0,05% icke-joniskt rengöringsmedel, pH 9,0) för 3 min i en lämplig ångbåt eller mikrovågsugn för 10-15 min och tvätta tre gånger med TBS för 5 min varje.
- Circle avsnitten med en silikon penna och tillsätt 100 µL blockerande lösning (TBS + 10% get normalt serum + 1% bovint serumalbumin, pH 7,6) i rumstemperatur i 1 h.
- Fläcken med anti-glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) kanin polyklonala antikroppar och anti glutamin kväveoxidsyntas (GS) mus monoklonal antikropp, både i en spädning 1: 200 (40 µL per prov). Inkubera i bilden i en fuktig kammare vid 4 ° C över natten. Tvätta tre gånger med TBS + 0,1% Tween-20 för 5 min varje.
- Finish visualisering med lämpliga sekundära antikroppar. Detta protokoll används en get-anti-kanin IgG H & L grön sekundär antikropp för Fredsgenomförande och en get antimus IgG H & L klarröd för GS, både i en 1: 500 utspädning i rumstemperatur i 1 h.
- Montera bilderna med monteringsmedium innehållande DAPI och observera glasen under mikroskopet fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Realtid OCT: för att kunna analysera MCs roll i näthinnans reparation, använde vi en laser skada förmå en väl avgränsad zon av skador i näthinnan zebrafiskar. Platsen för skador fotograferades genom in-vivo OCT för första gången (dag 0) inom 60 minuter efter skadan (figur 3). För att kompensera för optiken av fisk ögat, placerades en skräddarsydd kontaktlins på hornhinnan. Omedelbart efter laserbehandling, var en diffus hyper-reflekterande signal lokaliserad till yttre näthinnan (pilar). Det sträckte sig från retinala pigmenterade epitel (RPE) till det yttre plexiform lagret (OPL). En liknande signal var också upptäckas på dag 1. Efter dag 3 blev denna diffusa signal mer organiserade och tät. Det sågs konsekvent i det yttre nukleära lagret (Onlinekanaler) utvidga till lagrets ljusmätare. Efter den första veckan (dag 7), det fanns en signifikant minskning av genomsnittligt lesionsstorlek och endast en liten hyper-reflekterande signal upptäcktes. Start från dag 14 tills den senaste tidpunkten undersökt (vecka 6), var laser fläckarna inte längre synlig i IR och ULT bilder.
Histologisk utvärdering av Retinal Degeneration/regenerering: för att undersöka omfattningen och kinetik av retinal degeneration/regenerering, H & E färgning var anställd vid olika tidpunkter efter skada induktion (dag 0, 1, 3, 7, 14 och vecka 6) (figur 4). Experimenten utfördes på tre ögon av tre fiskar. Dock utfördes ingen statistisk analys eftersom målet med detta manuskript är att demonstrera metoden. Subtila förändringar i det inre nukleära lagret (INL) och Onlinekanaler kan ses omedelbart efter laser (t.ex. lätt ödem i Onlinekanaler) och minskad intercellulära utrymmet i INL inom 60 minuter efter laserbehandling. Degeneration följdes under 6 veckor efter induktion av laser skada. Morfologiska förändringar observerades konsekvent efter 1 dag med desorganisation av den offentliga destrueringstjänsten och med en hålighet formation i Onlinekanaler och i subretinalområdet. Det var verkligen en förlust av atomkärnor inom Onlinekanaler i området skada mellan dag 1 och 7. Den maximala PR-förlusten hittades på dag 3. Från 14 dagar till 6 veckor, hade yttre näthinnan återupprättade dess normala morfologi.
Gliaceller engagemang under Retinal Degeneration/regenerering: att bedöma MC aktivering vid olika tidpunkter (dag 0, 3, 14) efter induktion av retinal degeneration, vi utfört immunhistokemiska analyser på glial cell markörer GS och Fredsgenomförande (figur 5). Experimenten utfördes igen på tre ögon tre fisk utan kvantitativ analys. GS spelar en viktig roll i att kontrollera nivån av extracellulära glutamat och anses uteslutande uttrycks i MC soma och dess processer19,20. Fredsgenomförande är uppreglerad under åldrande och när näthinnan skadas eller stressad. Det är lokaliserad i MC slutet-fötter och bearbetar21. Svag Fredsgenomförande uttryck hittades också i den inre delen av oskadd-kontroll näthinnan märkning andra typer av glial celler, exempelvis astrocyter. Autofluorescens PR yttre segment tillhandahålls också en signal i Onlinekanaler men detta kunde särskiljas. Fredsgenomförande signalen var uppreglerad på dag 3 efter skada. Därmed, analyser utförs på dag 3 efter laserbehandling visade Fredsgenomförande-positiv MCs endast inom skadan webbplats i Onlinekanaler av näthinnan. Från dag 14, förnyelse var i stort sett komplett och Fredsgenomförande signalen var nedreglerade till basnivån i området skada. Till skillnad från Fredsgenomförande fanns det ingen betydande förändring av GS uttryck. Dock kan det ha varit en lokaliserad nedreglering av GS på platsen för skadan.
Figur 1: inställning för induktion av laser skadan av zebrafisk näthinnan och OCT avgiftbelagda. (A) arrangemang av Lasersystemet innan behandling. (A.1) zebrafiskar placeras på silikon pin hållare med fundus kontakt linsen på plats strax före tillämpning av laserstrålen. (B) arrangemang av OCT systemet innan imaging. (B.1) zebrafiskar placeras före 78D slit lamp linsen innan upptäckt av skada webbplatser med hjälp av OCT. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Setup för att förvärva IR och ULT bilderna. (A) skärmdump av fönstret programvara under imaging. IR och ULT lägen skildras. (B) Översikt över panelen används för att förvärva bilderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: IR (vänster) och OCT (höger) bilder av de skadade och oskadd platserna av näthinnan i samma öga vid annan tidpunkt pekar (dag 0, 1, 3, 7, 14 och vecka 6) efter laserinducerad näthinneförtvining. I de IR-bilderna, en grön ruta anger del av näthinnan som har analyseras och den gröna linjen visar var OCT bilder på näthinnan. Pilarna anger platser av laser fläckar identifieras som hyper-reflekterande signaler i OCT. skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: H & E färgning av skadade och den kontralaterala oskadd zebrafiskar ögat vid olika tid pekar (dag 0, 1, 3, 7, 14 och vecka 6) efter laserinducerad näthinneförtvining. GC, ganglion celllagrar; INL, inre nukleära lagret; Onlinekanaler, yttre nukleära lagret. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: immunhistokemisk detektion av MC aktiveringen. Fredsgenomförande (grön) och GS (röd) färgning i skadade och oskadd zebrafiskar näthinnan vid olika tid punkter (dagar 0, 3, 14) efter laserinducerad retinal degeneration. Grön signal i Onlinekanaler beror på autofluorescens av PR odator-segment. Cellkärnan är färgade med DAPI (blå). Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förnyelse/näthinneförtvining i zebrafisk har undersökts genom olika metoder såsom cellgift-medierad cell död22, mekanisk skada23och termisk skada24. Vi anställt en 532 nm diode laser skada zebrafiskar näthinnan. Därmed, erbjuder vår modell flera fördelar. Exempelvis skapade vi snabbt ett väldefinierat område skada lokaliserade i yttre näthinnan, särskilt i PRs lagret. Dessutom kan denna experimentella set-up modifieras för att producera större områden av skada att studera andra biologiska processer, exempelvis genom att skada Bruchs membran att inducera koroidal kärlnybildning. Det finns minimal kollateral skada och tidpunkten för regenerativ svaret kan anpassas exakt och reproducibly.
För att följa de fenotypiska förändringarna över tid, anställt vi Heidelberg Spectralis systemet och programvaran Heidelberg ögat Explorer. Således, fundus IR imaging befanns vara speciellt användbart i zebrafiskar. Till skillnad från fundus autofluorescens (AF), som visar låg kontrast mellan laser plats och det omgivande området, är de skadada webbplatserna lättare att lokalisera av IR imaging. Detta tillåter oss att upptäcka förändringar och övervaka förnyelse i vivo, vilket inte skulle vara möjligt med AF-läge. Som tidigare rapporterats25, kan ULT användas för att övervaka degenerativa/regenererande processer i zebrafiskar näthinna. I vår modell upptäcktes retinal laser skada som en hyper-reflekterande band i Onlinekanaler (figur 3), som är liknande till det som har rapporterats i däggdjur26. Under regenerering minskade hyper-reflekterande signalen tills det försvann helt vid dag 14.
OCT bilderna var korrelerade med morfologiska förändringar ses inom laser lesioner (figur 4). Den diffusa hyper-reflekterande signalen i OCT bilder (dag 0) representerar de efter laser förändringar ses i INL av zebrafisk euthanized inom 1 timme efter laserbehandling. Den subtila och väl avgränsade hyper-reflekterande signal upptäckt på dag 3 motsvarar hålighet bildandet i Onlinekanaler tack vare rod förlusten. Start från dag 14, båda OCT och histologiska analyser bekräfta att yttre näthinnan hade återupprättade dess normala morfologi.
I den aktuella studien utvärderat vi också MC svaret under retinal regenerering (figur 5). Många grupper har redan undersökt aktivering av gliaceller, särskilt för MCs, som ett första regenerativ svar att skada. Mer specifikt, föreslog de att patofysiologiska MC aktivering kan inducera MCs att anta stamceller egenskaper, vilket ger en endogen källa till nya fungerande celltyper som kan integreras i skadade områden i näthinnan27. Som förväntat, hittade vi att retinal laser skada stimuleras MC aktivering som indikeras av uppreglering av förpliktelserna. Faktiskt ökat Fredsgenomförande uttryck var anmärkningsvärt upptäckts på 3 dagar efter skada och var begränsad till området skada. Start från dag 14, förnyelse var i stort sett komplett och Fredsgenomförande signalen var nedreglerade till originalplan nivå i området skada. Vi har således visat att MCs spela en aktiv roll i näthinnans omorganisation och potentiellt regenerering, efter skada.
Sammanfattningsvis, laserinducerad retinal degeneration/regenerering modellen är ett mångsidigt verktyg för att producera snabba och fokala skador på zebrafiskar näthinnan och följande regenerering kan visualiseras av icke-invasiva OCT imaging. Dessutom kunde vi visa att laser-retinal degeneration åtföljs av MC aktivering och att den efterföljande gliosis är omvänd vid regenerering. En detaljerad undersökning av de inblandade celltyper (t.ex. mikroglia, makrofager) och vägar måste dock utföras. Kritiska ändringar kan behövas, särskilt levande spårning av MCs att bättre förstå hur de beter sig under regenerativ process (t.ex. migration från sin ursprungliga plats i INL in yttre näthinnan, särskilt i PRs lagret) och deras differentiering mot PR celler. Alternativt kunde lätta skador paradigm användas för att inducera utbredd och konsekvent förlust av både spö och kon PRs28. Fördelen med den beskrivna modellen är dock en mer definierad skada området där man kan studera lokala interaktioner mellan degenererande fotoreceptorer och aktiverade MCs.
I allmänhet, tror vi att modellen kommer att bidra till att bättre förstå degenerativa/regenererande processer i sensoriska näthinnan och kan möjliggöra jämförelse av dessa utvecklingar med däggdjur systemet. Det kunde också användas för att studera påverkan av det medfödda immunsystemet och effekterna av neuroactive ämnen. I framtiden skulle man kunna använda dessa resultat för att ändra det urartar mänskliga visuella systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tacka Martin Zinkernagel, MD, PhD och Miriam Reisenhofer, PhD för hennes vetenskapliga insats på om upprättandet av modell och Federica Bisignani för hennes utmärkta tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
