Summary
For zebrafisk er en populær animalsk model til at studere mekanismer af retinale degeneration eller regenerering i hvirveldyr. Denne protokol beskriver en metode til at fremkalde lokaliserede skade forstyrre den ydre retina med minimal skade på den indre nethinde. Efterfølgende, overvåger vi i vivo retinal morfologi og Müller glia svar i hele retinal regenerering.
Abstract
En fascinerende forskellen mellem teleost og pattedyr er livslang potentialet i teleost nethinden for retinal neurogenese og regeneration efter alvorlige skader. Undersøge regenerering veje i zebrafisk kan bringe nye indsigt til at udvikle innovative strategier til behandling af retinale degenerative sygdomme i pattedyr. Heri, fokuserede vi på induktion af en fokal læsion på ydre nethinden i voksen zebrafisk ved hjælp af en 532 nm diodelaser. En lokaliseret skade giver mulighed for at undersøge biologiske processer, der finder sted under retinal degeneration og regeneration direkte på området af skader. Bruger ikke-invasiv optisk kohærens tomografi (OCT), vi var i stand til at definere placeringen af det beskadigede område og overvåge efterfølgende regenerering in vivo. Faktisk, OCT imaging producerer høj opløsning, tværsnitsdata billeder af zebrafisk nethinden, at give oplysninger, som var tidligere kun tilgængelig med histologiske analyser. For at bekræfte data fra real-time OLT, histologiske sektioner blev udført og regenerativ svar efter induktion af den retinale skade blev undersøgt af Immunhistokemi.
Introduction
Vision er sandsynligvis den mest afgørende følelse af mennesket og dets værdiforringelse har en høj socioøkonomisk virkning. I den industrialiserede verden tegner retinal degenerative sygdomme sig for størstedelen af synstab og blindhed blandt den voksne befolkning1. Retinitis pigmentosa (RP) er den mest almindelige arvelige årsag til blindhed i mennesker i alderen mellem 20 og 60, der påvirker omkring 1,5 millioner mennesker på verdensplan2,3. Det er en heterogen familie af arvelig retinal lidelser karakteriseret ved gradvis tab af fotoreceptorer (PRs) efterfulgt af degeneration af retinale pigment epitel og efterfølgende, gliosis og ombygning af indre neuroner4. Løbet af sygdommen kan forklares ved den gradvise tab af de to PR celletyper, som regel starter med stænger, som er ansvarlige for akromatisk vision i svagt lys, og kegler, som er afgørende for farve vision og synsskarphed5. En enkelt gendefekt er tilstrækkeligt til at forårsage RP. Mere end 130 mutationer i over 45 gener har hidtil været forbundet med sygdom6. Dette fører til varierende sygdom fænotyper og er en af grundene til at genterapi er ikke noget generaliserbart og dermed en indviklet terapeutisk tilgang. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye generelle terapeutiske tilgange til behandling af retinale degenerations i blændende sygdomme.
Retinal degeneration ofte indebærer PR tab; Derfor er PR celledød kendetegnende for de degenerative processer i nethinden7. Det er allerede blevet påvist, at PR celledød stimulerer Müller glia cell (MC) aktivering og spredning8. MCs, den store glial celletype i hvirveldyr nethinden, var engang anset for at være intet mere end en "lim" mellem retinal neuroner. I de seneste år, har mange undersøgelser vist, at MCs fungere som mere end blot strukturel støtte9. Blandt de forskellige funktioner, MCs deltager også i neurogenese og reparere10. Faktisk svar på diffusible faktorer fra udarter nethinden øge MCs betydeligt glial fibrillære sure protein (GFAP) udtryk. GFAP mærkning kan derfor bruges som markør for MC aktivering som en sekundær reaktion på retinal skader og degeneration11.
For nylig har udviklet vi en roman tilpasning af fokale skade ved hjælp af en laser til at fremkalde retinal degeneration i zebrafisk (Danio rerio). Fokale skade er en fordel for at studere visse biologiske processer såsom migration af celler i det skadede sted og den præcise timing af begivenheder, der finder sted under retinal regenerering12. Desuden, zebrafisk er blevet vigtigt i visuelle forskning på grund af ligheder mellem dens visuelle system og andre hvirveldyr. Brutto morfologiske og histologiske funktioner af menneskelige og teleost retinae vise nogle forskelle. I overensstemmelse hermed, menneskelige og zebrafisk retinae indeholder de samme store celle klasser organiseret i det samme lag mønster, hvor oplyse-sensing fotoreceptorer besætte det yderste lag, mens de retinale projektion neuroner, ganglion celler, opholder sig i inderste neuronal lag, proksimalt for linsen. De retinale interneurons, amacrine, bipolar, og horisontale celler, lokalisere i mellem den fotoreceptor og ganglion celle lag13. Desuden er zebrafisk nethinden kegle-domineret og derfor tættere på den menneskelige nethinde end eksempelvis intensivt undersøgt gnavere nethinden. En fascinerende forskellen mellem teleost og pattedyr er den vedvarende neurogenese i fisk nethinden og retinal regenerering efter en skade. I zebrafisk, kan MCs dedifferentiate og mægle regenerering i sårede nethinden14,15. I kylling har MCs nogle kapacitet også genindtræde cellecyklus og dedifferentiate. Efter retinal skade i voksne fisk, MCs vedtage visse karakteristika af stamceller og stamceller, overflytte til det beskadigede retinale væv og producere nye neuroner16. Gen expression profilering af pattedyr MCs afslørede uventede ligheder til retinal progenitorceller, og beviser for iboende neurogen potentiale af MCs i kylling, gnaver og endda menneskelige nethinde vokser17. Ikke desto mindre, hvorfor den regenerative svar i fugle og pattedyr er lavere sammenlignet med den robuste svar i fisk er endnu ikke forstået. Derfor kan forstå de endogene reparation mekanismer i zebrafisk foreslå strategier for stimulerende retinal regenerering i pattedyr og mennesker. Ansætte den endogene reparation mekanisme af MCs som et terapeutisk redskab til behandling af patienter med retinal degeneration ville have en fremragende effekt for vores samfund.
Heri, giver vi de nødvendige skridt til at ansætte degeneration eller regenerering af modellen i oftalmologiske forskning. Vi fokuserer først på inducerende fokale skader i neurosensory nethinden, derefter på billeddannelse af begivenhederne udvikler sig skaden site, og endelig visualisering inddragelse af tilstødende MCs. Den generelle protokol er relativt nemme at udføre og åbner en bred vifte af muligheder for at vurdere en retina bagefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle eksperimenter levet op til erklæringen om brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning af foreningen for forskning i Vision og oftalmologi (ARVO) og respektere de relaterede forordninger af de statslige myndigheder.
1. dyr
- Vedligehold TgBAC (gfap:gfap-NGL) zebrafisk 167 (AB) stamme i alderen 6-9 måneder under standardbetingelser i vand med en temperatur på 26,5 ° C og en 14/10 h lys/mørke cyklus 18.
- Følg retningslinjerne dyrs pleje af de involverede institutioner for de dyreforsøg efter godkendelse af de statslige myndigheder.
2. Vendbar systemisk anæstesi
- Forbered stamopløsning ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate salt (tricaine) ved at opløse 400 mg af tricaine pulver i 97,9 mL tank vand og 2,1 mL 1 M af Tris bufferet saltvand (TBS). Justeres til pH 7,0 med 1 M Tris (pH 9) og opbevares ved 4 ° C i mørke op til en måned.
Bemærk: Tricaine skal forberedes i vandet som dyrets naturlige livsbetingelser, originale tank vand skal bruges fortrinsvis. - Fortyndes stamopløsning 1:25 i tank vand og bruge straks.
- Placere zebrafisk i en 10 cm petriskål med 50 mL af anæstesi løsning indtil de bliver immobil og reagerer ikke på ydre stimuli (ca 2-5 min, afhængig af vægt og alder).
- Overføre hver fisk i hånden til en skræddersyet silikone pin holder til Laserbehandling ( figur 1A).
FORSIGTIG! Fiskene kan forblive bedøvede uden for tanken i op til 10 min. kun. - For at vende anæstesi efter behandling og/eller imaging, placere zebrafisk i beholder indeholdende tank vand.
- Til støtte for nyttiggørelse, skabe en strøm af frisk tank vand over gæller ved at flytte zebrafisk frem og tilbage i vandet.
3. Laser fokale skade på nethinden
Bemærk: A 532 nm diodelaser bruges til at oprette fokale lys skader på nethinden af zebrafisk. Den eksperimentelle set-up af laser giver mulighed for etablering af en reproducerbar fokale retinal skade i voksen zebrafisk.
- Oprettet laser udgangseffekt: 70 mW; antenne diameter: 50 µm; impulslængde: 100 ms.
forsigtighed! Brugen af laserlys kræver passende personlige beskyttelse og mærkning af området. - Påfør 1-2 dråber af 2% hydroxypropylmethylcellulose topisk i øjet inden behandlingen og bruge en 2,0 mm fundus laserlinse til at fokusere strålen laser-sigte på nethinden.
FORSIGTIG! hydroxypropylmethylcellulose dråber er tyktflydende og kan forårsage problemer i vejrtrækning hvis det går på gællerne. - Sted fire laser steder omkring synsnerven på venstre øje og bruge de rigtige, ubehandlet øje som intern kontrol.
4. In vivo Imaging af Retinal morfologi
- på dag 0, visualisere zebrafisk nethinden direkte efter laser induktion uden genoplive dem fra anæstesi. På alle andre tidspunkter, ansætte generel anæstesi (Se afsnit 2: Vendbar systemisk anæstesi). Placer de immobiliserede zebrafisk på et specialfremstillet silikone pin indehaveren ( figur 1 B, B.1).
- At få optimale billeder, skåret en kommercielt tilgængelig hydrogel kontaktlinse til at passe zebrafisk øjet (Ø = 5,2 mm, f = 2.70 mm, center tykkelse = 0.4 mm) ved hjælp af en hulning. Udfylde konkav overfladen af linsen med methylcellulose og Placer det over hornhinden.
- Udstyre OCT system med en 78D berøringsfrie slit lamp linse.
- Fokusere infrarød (IR) billedet i IR + OCT tilstand ( figur 2A) til at visualisere fundus i øjet og tage IR billeder ved at klikke på den " erhverve " knappen ( figur 2B) at lokalisere den laser steder på nethinden ved hjælp af systemet ' s software.
- Visualiser en tre-dimensionel sektion af de retinale lag i den IR + OCT tilstand og tage billeder ved at klikke på den " erhverve " knappen ( figur 2B). Observere sværhedsgraden af skaden i det ydre nukleare lag (ger) (Se afsnit 3: Laser fokale skade på nethinden) i disse billeder.
- At vende anæstesi efter behandling og/eller imaging sted zebrafisk i en beholder, der indeholder tank vand.
- Til støtte for nyttiggørelse, skabe en strøm af frisk tank vand over gæller ved at flytte zebrafisk frem og tilbage i vandet.
- Udføre lignende i vivo billeddannelse af retinale morfologi på dag 1, 3, 7, 14 og uge 6.
5. Hæmatoxylin & Eosin (H & E) farvning
- Euthanize zebrafisk ved neddykning i kolde (4 ° C) anæstesi løsning på køl i mindst 10 min og enucleate øjnene straks ved hjælp af små buet pincet.
- Rette de hele øjne i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 4 ° C i 20 h og derefter dehydrere prøver i en gradueret alkohol serie (xylen 100% for 5 min to gange, ethanol 100% for 5 min to gange, ethanol 96% i 3 min. to gange og ethanol 70% 3 mi n når).
FORSIGTIG! PFA kan være irriterende for øjne, næse og øverste luftveje spor. PFA er et kendt kræftfremkaldende og en mistanke om reproduktiv hazard. - Integrere prøverne i paraffin, skær 5 µm sektioner på niveauet af synsnerven hoved og montere dem på glas dias.
- Pletter i deparaffinized afsnit med 0,1% syre hæmatoxylin løsning for 5 min og dyppe dias to gange i destilleret vand efter dypning dias i saltsyre mix (2 mL 25% HCl i 250 mL destilleret vand) og ammoniak mix (2 mL 25% ammoniak i 250 mL destilleret vand). Pletten sektioner med eosin G vandig opløsning 0,5% for 3 min efter udviklingen af hæmatoxylin farvning af vand fra hanen i mindst 10 min.
- Montere dehydreret dias i akryl harpiks montering medium og observere dias under den lysmikroskop.
6. Immunhistokemi for MC aktivering
- varme i deparaffinized afsnit i antigen hentning buffer (Tris-EDTA + 0,05% nonionisk detergent pH 9,0) i 3 min. i en passende damper eller en mikrobølgeovn til 10-15 min og vaskes tre gange med TBS for 5 min hver.
- Cirkel sektioner med en silikone pen og tilsæt 100 µL blokerende løsning (TBS + 10% ged normale serum + 1% bovint serumalbumin, pH 7,6) ved stuetemperatur for 1 h.
- Plet med anti-glial fibrillære sure protein (GFAP) kanin polyklonale antistof og anti-glutamin syntetase (GS) monoklonalt muse-antistof, både i en 1:200 fortynding (40 µL pr. prøve). Inkuber dias i en fugtig kammer ved 4 ° C natten over. Vaskes tre gange med TBS + 0,1% Tween 20 til 5 min.
- Finish visualisering med den relevante sekundære antistoffer. Denne protokol anvendes en ged anti-kanin IgG H & L grøn sekundær antistof til GFAP og en ged anti-mus IgG H & L lyse rødt for GS, både i en 1: 500 fortynding ved stuetemperatur for 1 h.
- Montere dias med montering medium indeholdende DAPI og observere dias under fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Real-time OCT: for at analysere rollen af MCs i retinal reparation, vi brugte en laser skade model inducere en vel afgrænset zone af skader i zebrafisk nethinden. Stedet, hvor skaden blev afbildet med i vivo OCT for første gang (dag 0) inden for 60 minutter efter skade (figur 3). For at kompensere for optikken i at fiskeøje, blev en skræddersyet kontaktlinse placeret på hornhinden. Umiddelbart efter laserbehandling, blev en diffus hyper-reflekterende signal lokaliseret til den ydre retina (pile). Det udvidet fra de retinale pigmenteret epitel (ÅV) til det yderste plexiform lag (OPL). En lignende signal var også påvises på dag 1. Efter dag 3 blev denne diffuse signal mere organiseret og tæt. Det var konsekvent set i den ydre nukleare lag (ger.) strækker sig ind fotoreceptor laget. Efter den første uge (dag 7), der var en betydelig nedgang i gennemsnitlige læsion størrelse og kun en lille hyper-reflekterende signal blev opdaget. Startende fra dag 14 indtil den seneste tidspunkt undersøgte (uge 6), laser steder ikke længere synlige i IR og OCT billeder.
Histologisk vurdering af Retinal Degeneration eller regenerering: for at undersøge omfanget af og kinetik af retinal degeneration eller regenerering, H & E farvning var ansat på forskellige tidspunkter efter skader induktion (dag 0, 1, 3, 7, 14 og uge 6) (figur 4). Forsøgene blev udført på tre øjne af tre fisk. Dog blev ingen statistisk analyse udført som målet med håndskriftet er at dokumentere metoden. Subtile ændringer i det inderste nukleare lag (INL) og ger. kan ses umiddelbart efter laser (fx lille ødem i ger.) og reduceret intercellulære rum i INL inden for 60 minutter efter laserbehandling. Degeneration blev fulgt til 6 uger efter induktion af laser skade. Morfologiske ændringer blev konsekvent observeret efter 1 dag med forstyrrelser af den offentlige destruktionstjeneste og med et hulrum dannelse i ger og i de subretinal plads. Der var faktisk et tab af kerner i ger. i området skader mellem dage 1 og 7. Den maksimale PR tab blev fundet på dag 3. Startende fra 14 dage til 6 uger, havde den ydre retina igen etableret sin normale morfologi.
Glial inddragelse under Retinal Degeneration eller regenerering: at vurdere MC aktivering på forskellige tidspunkter (dag 0, 3, 14) efter induktion af retinal degeneration, vi udførte immunhistokemiske analyser til glial celler markører GS og GFAP (figur 5). Eksperimenter blev igen udført på tre øjne af tre fisk uden kvantitativ analyse. GS spiller en vigtig rolle i at kontrollere niveauet af ekstracellulære glutamat og anses for at være udelukkende udtrykt i MC soma og dens processer19,20. GFAP er upregulated under aldring og når nethinden er beskadiget eller stresset. Det er lokaliseret i MC ende-fødder og behandler21. Svage GFAP udtryk blev også fundet i den indre del af uskadt kontrol nethinden mærkning andre glial celletyper, f.eks., astrocytter. Autofluorescence af PR ydre segmenter gav også et signal i ger. men dette kunne være klart adskilt. GFAP signal var upregulated på dag 3 efter skade. Dermed analyser udført på dag 3 efter Laserbehandling viste GFAP-positive MCs kun inden for den skade site i ger. af nethinden. Fra dag 14, regenerering var stort set afsluttet og GFAP signal var downregulated til basisniveauet i området skader. I modsætning til GFAP var der ingen betydelige ændringer i omfanget af GS udtryk. Men der kunne have været en lokaliseret downregulation af GS i stedet for skaden.
Figur 1: opsætning til induktion af laser skade af zebrafisk nethinden og efter OCT analyse. (A) arrangement af laser system før behandling. (A.1) zebrafisk placeret på silikone pin indehaveren med fundus kontaktlinse sted lige før anvendelse af laserstrålen. (B) arrangement af OCT systemet før billeddannelse. (B.1) zebrafisk placeres foran 78D slit lamp linse før påvisning af skade websteder ved hjælp af oktober venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: opsætning for at erhverve IR og OCT billeder. (A) Screenshot af vinduet software under imaging. IR og OCT tilstande er afbildet. (B) oversigt over panelet bruges til at erhverve billederne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: IR (venstre) og OCT (højre) billeder af de sårede og uskadt lokaliteter af nethinden i det samme øje på andet tidspunkt point (dag 0, 1, 3, 7, 14 og uge 6) efter laser-induceret retinal degeneration. En grøn boks angiver del af nethinden, der analyseres i IR-billeder, og den grønne linje viser placeringen af OCT billeder på nethinden. Pilene angiver websteder af laser steder opdaget som hyper-reflekterende signaler i oktober skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: H & E farvning af de sårede og de kontralaterale uskadt zebrafisk øje på andet tidspunkt point (dag 0, 1, 3, 7, 14 og uge 6) efter laser-induceret retinal degeneration. GC, ganglion cellelag; INL, nukleare inderst; GER, ydre nukleare lag. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: immunhistokemisk påvisning af MC aktivisering. GFAP (grøn) og GS (rød) farvning i sårede og uskadt zebrafisk nethinden på andet tidspunkt point (dage 0, 3, 14) efter laser-induceret retinal degeneration. Det grønne signal i ger. skyldes autofluorescence af PR ocomputeren segmenter. Cellekerner farves med DAPI (blå). Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retinal regenerering/degeneration i zebrafisk har været undersøgt af forskellige tilgange som cytotoxin-medieret celle død22, mekanisk skade23og termisk skade24. Vi ansat en 532 nm diodelaser skade zebrafisk nethinden. Dermed giver vores model flere fordele. For eksempel, skabt vi hurtigt et veldefineret område af skade lokaliseret i den ydre retina, specielt i laget PRs. Desuden, denne eksperimentelle set-up kan ændres til at producere større områder af skader til at studere andre biologiske processer, for eksempel ved at beskadige Bruchs membran til at fremkalde choroidal neovascularization. Der er minimal følgeskaderne og timingen af de regenerative svar kan moduleres netop og reproducerbar.
For at følge de phenotypical ændringer over tid, ansat vi Heidelberg Spectralis system og Heidelberg øje Explorer software. Således fandtes fundus IR imaging for at være særligt nyttigt i zebrafisk. I modsætning til fundus autofluorescence (AF), som viser lav kontrast mellem laser spot og det omkringliggende område, er de beskadigede steder lettere at lokalisere af IR imaging. Dette giver os mulighed for at registrere ændringer og overvåge regenerering i vivo, som ikke ville være muligt med AF mode. Som tidligere rapporteret25, kan OCT bruges til at overvåge degenerative/regenerative processer i zebrafisk nethinden. I vores model, blev retinal laser skade opdaget som en hyper-reflekterende band i ger. (figur 3), som er lig hvad er blevet rapporteret i pattedyr26. Den hyper-reflekterende signal faldt i regenerering, indtil det forsvandt helt på dag 14.
OCT billeder var korreleret med morfologiske ændringer set inden for laser læsioner (figur 4). Den diffuse hyper-reflekterende signal i OCT billeder (dag 0) repræsenterer efter laser ændringer set i INL af zebrafisk aflives inden for 1 time efter laserbehandling. Den subtile og vel afgrænsede hyper-reflekterende signal registreret på dag 3 svarer til hulrummet dannelsen i ger. på grund af rod tabet. Med udgangspunkt i dag 14, begge OCT og histologiske analyser bekræfter, at den ydre retina havde genoprettet sin normale morfologi.
I den foreliggende undersøgelse vurderet vi også MC svar under retinal regenerering (figur 5). Mange grupper har allerede undersøgt aktivering af glial celler, især af MCs, som et første regenerativ svar til skade. Mere specifikt, foreslog de, at patofysiologiske MC aktivering kan fremkalde MCs at vedtage stamcelle karakteristika, der giver en endogen kilde til nye fungerende celletyper, der kan integreres i beskadigede områder af nethinden27. Som forventet fandt vi, at retinal laser skade stimuleret MC aktivering som angivet af opregulering af GFAP. Faktisk øgede GFAP udtryk var bemærkelsesværdigt opdaget på 3 dage efter skade og var begrænset til området skader. Startende fra dag 14, regenerering var stort set afsluttet og GFAP signal var downregulated til basisniveauet i området skader. Dermed, vi har vist, at MCs spille en aktiv rolle i retinal reorganisering, og potentielt regenerering, efter skade.
Afslutningsvis, laser-induceret retinal degeneration eller regenerering model er et alsidigt værktøj til at udarbejde hurtige og fokale skader zebrafisk nethinden og de følgende regeneration kan visualiseres ved non-invasiv OCT billeddannelse. Derudover kunne vi vise at laser-retinal degeneration er ledsaget af MC aktivering og at den efterfølgende gliosis er vendt efter regenerering. En detaljeret undersøgelse af de involverede celletyper (fx mikroglia, makrofager) og veje skal dog udføres. Kritiske ændringer kan være nødvendig, især live tracking af MCs til bedre at forstå, hvordan de opfører sig i løbet af regenerativ processen (f.eks. overflytning fra deres oprindelige placering i INL ind i den ydre retina, især i laget PRs) og deres differentiering mod PR celler. Alternativt kunne lette skader paradigmer bruges til at fremkalde omfattende og konsekvent tab af både stang og kegle PRs28. Fordelen ved den beskrevne model er dog en mere defineret skade område hvor man kan studere lokale interaktioner mellem udarter fotoreceptorer og aktiveret MCs.
Vi mener generelt, at modellen vil hjælpe til bedre for at forstå degenerative/regenerative processer i de sensoriske nethinden og kan aktivere sammenligning af disse udviklinger med pattedyr systemet. Det kunne også bruges til at studere indflydelse af det medfødte immunforsvar og virkningerne af neuroactive stoffer. I fremtiden, måske man kunne bruge disse resultater for at ændre det udarter menneskelige visuelle system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke Martin Zinkernagel, MD, ph.d.- og Miriam Reisenhofer, ph.d. for hendes videnskabelige input på oprettelse af model og Federica Bisignani for hendes fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
