Summary
Questo protocollo descrive come produrre cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) da cellule staminali pluripotenti. Il metodo utilizza una combinazione di fattori di crescita e di piccole molecole per indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in RPE immaturi in quattordici giorni e RPE maturo, funzionale dopo tre mesi.
Abstract
Descriviamo un metodo affidabile per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in retinico del pigmento cellule epiteliali (RPE). Lo scopo di fornire un protocollo dettagliato e approfondito è dimostrare con chiarezza ogni passaggio e per rendere questo prontamente disponibili ai ricercatori nel campo. Questo protocollo si traduce in uno strato omogeneo di RPE con dissezione minima o no manuale necessaria. Il metodo presentato qui ha dimostrato di essere efficace per indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSC) e cellule staminali embrionali umane. Inoltre, descriviamo i metodi per la crioconservazione di banche di cellule intermedie che consentono la memorizzazione a lungo termine. RPE generato utilizzando questo protocollo potrebbe essere utile per la modellazione di malattia-in-un-piatto iPSC o applicazione clinica.
Introduction
L'epitelio pigmentato retinico è un monostrato di cellule pigmentate che fornisce il supporto cruciale per fotorecettori. Cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) hanno numerose funzioni in visione, compreso assorbimento della luce, trasporto di nutrienti e ioni, retinoide, escursioni in bicicletta, la fagocitosi di segmento esterno dei fotorecettori, e1di secrezione di fattore di crescita. Ci sono una varietà di distrofie retiniche che influenzano la funzione di RPE e risultano in una perdita di visione, compreso degenerazione maculare senile e la retinite pigmentosa. Generazione di RPE da cellule staminali pluripotenti può facilitare la ricerca per capire queste malattie dell'occhio e può fornire una fonte illimitata di RPE per cella terapie2. Infatti, molteplici test clinici sono in corso utilizzando RPE derivato da cellule staminali di pluripotent3.
Questo protocollo di differenziazione è stata originariamente descritta da Buchholz4 ed era basato sul metodo precedentemente pubblicato da Clegg5. La procedura imita il processo inerente allo sviluppo normale in vivo per dirigere le cellule staminali indifferenziate pluripotenti verso un destino RPE tramite manipolazione dei fattori di crescita dell'insulina (IGF), fattore di crescita di base del fibroblasto (FGF-2; FGF-basic), trasformando il fattore di crescita beta (TGF-β) e WNT percorsi4,5. Il protocollo è stato significativamente migliorato tramite l'aggiunta di un agonista di pathway WNT tardi nel protocollo, che ha reso 97,77% ± 0,1% pre-melanosome le cellule positive della proteina (PMEL) ed è stato adattato a condizioni privo di xeno6,7. RPE risultante sono stati indicati per esprimono marcatori RPE ai livelli della proteina e di trascrizione, di secernere fattori di crescita conosciuti RPE con polarità appropriato e svolgere fagocitosi di fotorecettore segmenti esterni8. Questo protocollo è più rapida e affidabile di "spontaneo" protocolli di differenziazione che coinvolgono la semplice rimozione del fattore di crescita di base del fibroblasto8. Inoltre, i dati mostrano che RPE ottenuti usando questo protocollo del RNA 16S sono molto simili a quelli ottenuti utilizzando il più comune approccio spontaneo8. Il metodo di 14 giorni genera RPE che corrispondono al "5p" citato da Mazzoni9 (pigmentate, polarizzata, fagocitaria, post-mitotici, poligonale)9. Mentre questa procedura ha dimostrato di essere riproducibile in vari laboratori, vogliamo riconoscere diversi metodi di differenziazione diretto aggiuntivi che sono stati pubblicati in anni recenti10,11,12 , 13.
Protocol
1. preparazione dei reagenti per giorno 0 al giorno 14 del protocollo
- preparare i seguenti componenti medi:
- fare 100 mL di differenziazione retinica medio (RDM) aggiungendo 1 mL di supplemento di x N2 100, 2 mL di 50 x B27 supplemento e 1 mL di aminoacidi non essenziali (NEAA) a 96 mL di Dulbecco: 100x ' s per volta essenziale medio/nutriente miscela F12 9 (DMEM/F12).
- Fare 10 mL di 1 M nicotinammide (NIC) di dissoluzione 1,221 g di NIC in 8 mL di acqua sterile, Vortex e portando il volume a 10 mL con acqua sterile. La soluzione del filtro sterile.
- Preparare i seguenti fattori di crescita e piccole molecole:
- noggin ricombinante del mouse ricostituire, inibitore di dickkopf umano WNT segnalazione via 1 (DKK-1) e di IGF-1 a 100 µ g/mL ogni in 0,1% albumina di siero bovino (BSA) in soluzione tampone fosfato (PBS). Aliquotare se necessario e conservare a-20 ° C fino a 3 mesi.
- Ricostituire FGF-basic a 10 µ g/mL e ricombinante umani/mouse/ratto activina A e 100 µ g/mL ogni in 0,1% BSA in PBS. Aliquotare se necessario e conservare a-80 ° C fino a 1 anno.
- Ricostituire SU 5402 (inibitore della chinasi della tirosina del recettore specifico FGF) e CHIR99021 (chinasi di synthase del glicogeno 3, GSK-3beta, inibitore) a 10 mM ogni di solfossido dimetilico (DMSO). Aliquotare e conservare a-20 ° C per fino a 1 anno o 6 mesi, rispettivamente.
- Ottenere il seguente giorno 0 e/o soluzione di giorno 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic acido (EDTA) (0,2 g EDTA per 1 L di PBS), 1x PBS- / - dell'enzima tripsina-simile dissociazione a (PBS senza calcio o magnesio, pH 7.4), 1x (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE sostegno medio (RSM) e Y-27632 dicloridrato (uso a 10 µM).
2. : Giorno 0 passaggio di cellule staminali pluripotenti per differenziazione
- Grow colonie di cellule staminali in condizioni privo di alimentatore, privo di siero per circa l'80% confluenza prima passaggio.
Nota: Vedi discussione per dettagli su come ottimizzare questo passaggio. - Cappotto una piastra 12-pozzetti con idrogel basato su matrice extracellulare (ECMH) conforme alle raccomandazioni del produttore. Permette di impostare per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
- Aliquota del volume di RDM e PBS- / - necessari per giorno 0 e caldo a bagnomaria a 37 ° C prima dell'aggiunta di fattori di crescita. Portare EDTA a temperatura ambiente.
- Aggiungere i fattori di crescita necessari per giorno 0 per la RDM riscaldato con 10mm NIC, zucca di 50 ng/mL, 10 ng/mL DKK-1 e 10 ng/mL IGF-1. Provenienti dalle scorte descritte al punto 1.2, aggiungere 100 µ l di NIC, 5 µ l di zucca, 1 µ l di DKK-1 e 1 µ l di IGF-1 a 10 mL di RDM.
- Pick per rimuovere tutte le colonie differenziate sulla base della morfologia dalle cellule staminali che potranno essere attraversate per differenziazione. Per rimuovere manualmente le cellule differenziate usare una punta di pipetta P10.
Nota: Le cellule fibroblastiche tra colonie come pure le cellule opache all'interno di colonie indicano cellule differenziate per essere rimosso. Vedere la discussione per informazioni dettagliate sulle cellule differenziate. - Passage un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 4 pozzetti di una piastra 12-pozzetti (1:4).
Nota: Vedere discussione per informazioni dettagliate sul passaggio di cellule staminali in questa fase.- Il mezzo di cellule staminali dalle cellule staminali di aspirare e lavare i pozzetti una volta con 2 mL di PBS preriscaldata- / -.
- PBS aspirare- / - e sciacquare ogni ben tre volte con 1 mL di EDTA per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
- Delicatamente la piastra di inclinazione e aspirare l'EDTA. Non agitare la piastra in alcun modo per evitare di sollevare prematuramente le cellule.
- Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 1 mL di EDTA e incubare a temperatura ambiente nella cappa per 3-5 min. Non disturbare la piastra durante questa incubazione.
- Aspirare l'EDTA e aggiungere 1 mL di RDM per pozzetto che verrà effettuato il seeding con 0,5 mL di medium extra. Per esempio, lavare 1 bene di una piastra a 6 pozzetti con 4,5 mL di RDM alla piastra su 4 pozzetti di una piastra 12-pozzetti.
- Utilizzare un raschietto di cella per staccare delicatamente le cellule. Raccogliere tutte le cellule in un tubo conico e triturare le cellule in RDM pipettando su e giù per 5 volte. Dissociare grandi ciuffi di cellule, ma non triturare a sospensione unicellulare. Distribuire uniformemente le celle la pipetta. Completare questo passaggio rapidamente per evitare il reattachment alla piastra.
- Semi di cellule sulle piastre rivestite con ECM 12-pozzetti (1 mL di sospensione di cellule per pozzetto).
- Inclinare il piatto avanti e indietro per distribuire le cellule in modo uniforme in tutta la pozzi. Posizionare delicatamente in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 fino al successivo cambio medio.
- Nota l'ora esatta. Mezzo di cambiamento allo stesso tempo ogni giorno.
3. 1 al 14 ° giorno: aggiunta di fattori di crescita
- giorno 1: modificare il mezzo su tutti i pozzetti (1 mL per pozzetto) utilizzando RDM con la composizione di fattore di crescita per giorno 0 (Vedi punto 2.4).
- Day 2: cambiare il mezzo utilizzando RDM (1 mL per pozzetto) con 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic, zucca di 10 ng/mL, 10 ng/mL DKK-1 e 10 ng/mL IGF-1. Provenienti dalle scorte descritte al punto 1.2, aggiungere 100 µ l di NIC, 5 µ l di FGF-basic, 1 µ l di zucca, 1 µ l di DKK1 e 1 µ l di IGF1 a 10 mL di RDM.
- Day 4: modificare il mezzo utilizzando RDM (1 mL per pozzetto) con 100 ng/mL activina A, 10 ng/mL DKK-1 e 10 ng/mL IGF-1. Provenienti dalle scorte descritte al punto 1.2, aggiungere 10 µ l di activina A, 1 µ l di DKK1 e 1 µ l di IGF-1 a 10 mL di RDM.
Nota: Osservare che, in questa fase, le cellule sono confluenti. - Day 6: cambiare il mezzo utilizzando RDM (1 mL per pozzetto) con 100 ng/mL activina A e 10 µM SU 5402. Provenienti dalle scorte descritte al punto 1.2, aggiungere 10 µ l di activina A e 10 µ l di SU 5402 a 10 mL di RDM.
- Giorni 8, 10 e 12: modificare il mezzo utilizzando RDM (1 mL per pozzetto) con 100 ng/mL activina A, 10 µM SU 5402 e 3 µM CHIR99021. Provenienti dalle scorte descritte al punto 1.2, aggiungere 10 µ l di activina A, 10 µ l di SU 5402 e 3 µ l di CHIR99021 a 10 mL di RDM.
4. Giorno di arricchimento passaggio 0 di RPE
- cappotto una piastra a 6 pozzetti con fattore di crescita ridotta ECMH conforme alle raccomandazioni del produttore. Permette di impostare per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
- Aliquota del volume di DPBS necessari e 1 mL di RDM per pozzetto di arricchimento e riscaldare a bagnomaria a 37 ° C. Bring il TDE a temperatura ambiente e calda volume necessario di RSM, reagente antimicrobica e Y-27632 a 37 ° C.
- Aggiungi antimicrobica reagente e Y-27632 ottenere x 0,5 e 10 µM composizioni rispettivamente a RSM. Utilizzare questo mezzo per i primi 4-7 giorni per migliorare allegato.
- Aspirato medio speso da tutti i pozzetti e aggiungere 1 mL per pozzetto di RDM pre-riscaldato (senza fattori di crescita necessari).
- Manualmente usando un microscopio per dissezione, sezionare e raschiare via tutte le cellule non-RPE utilizzando una punta di pipetta P10.
Nota: Vedere la sezione risultati rappresentativi per esempi. - Dopo la dissezione, aspirare RDM e tutto cella di detriti. Lavare due volte con 1 mL di DPBS pre-riscaldato per pozzetto.
- Aggiungere 0,5 mL di TDE per pozzetto di una piastra 12-pozzetti e incubare a 37 ° C per 5 min, usare un raschietto di cella per rimuovere delicatamente le cellule dalla piastra. Utilizzare una pipetta da P1000 per triturare delicatamente la sospensione cellulare/TDE pipettando su e giù 3 - 4 volte a creare una sospensione uniforme.
- Diluire la sospensione cellulare/TDE 01:10 in RSM pre-riscaldato, senza Y-27632. Centrifugare la sospensione cellulare a 173 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il mezzo dal pellet e risospendere le cellule in Gestione archivi rimovibili con 10 µM Y-27632 (1 mL / arricchito bene).
- Ceppo le celle utilizzando un colino di cella di nylon mesh con 40 µm pori. Contare il numero di cellule in un volume specificato utilizzando un emocitometro e calcolare la concentrazione delle cellule nella soluzione sforzata.
- Cellule di seme al fattore di crescita ridotta piastre rivestite con ECM a 1 x 10 5 cellule/cm 2 in 4 mL di RSM con 10 µM Y-27632.
- Sostituire la RSM con 10 µM Y-27632 48 h dopo la semina delle cellule e continuare a sostituire ogni 3-4 giorni (ad es. il lunedì e il giovedì). Non sostituire il µM 10 Y-27632 dopo 4-7 giorni.
- Permettono alle cellule di maturare per 28 a 35 giorni a 37 ° C e 5% CO 2. Continuare a sostituire la RSM ogni 3-4 giorni (ad es. il lunedì e il giovedì).
5. Maturazione: Passaggio 1 e 2 del RPE
Nota: volumi sono indicate per 1 bene di una piastra a 6 pozzetti o un pallone T75 come indicato dalle parentesi.
- Tra i giorni 28 a 35 di passaggio 0, ricoprire una piastra a 6 pozzetti (T75 boccetta) con ECMH conforme alle raccomandazioni del produttore.
- Aliquota del volume di DPBS e RSM necessario e caldo a bagnomaria a 37 ° C. TDE portare a temperatura ambiente.
- Aspirato speso medio da pozzi e lavare ogni ben due volte con 2 mL (10 mL) di pre-riscaldato DPBS.
Nota: Non utilizzare 10 µM Y-27632. - Aspirare DPBS e aggiungere 1 mL (5 mL) di TDE. Posto in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 per 5 min. Dopo l'incubazione, Visualizza le cellule su un microscopio invertito per confermare le cellule sono contraenti e lo scollegamento.
- Con un raschietto in cella di dimensioni adeguate, rimuovere delicatamente le cellule dal fondo del pozzo o boccetta.
- Utilizzare una punta P1000 (pipetta sierologica da 10 mL) per delicatamente triturare la sospensione cellulare/TDE su e giù 3 - 4 volte a creare una sospensione uniforme.
- Diluire cella sospensione 01:10 in Gestione archivi rimovibili. Riserva di 2 mL (5 mL) di RSM per sciacquare bene/beuta e aggiungere alla sospensione cellulare diluito.
Nota: Non consentono di tempo di esposizione di enzima superare 25 min. - Centrifugare la sospensione cellulare a 173 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il mezzo dal pellet e risospendere le cellule in 1 mL (5 mL) di RSM
- Ceppo le celle utilizzando un colino di cella di nylon mesh con 40 µm pori. Contare il numero di cellule in un volume specificato utilizzando un emocitometro e calcolare la concentrazione delle cellule nella soluzione sforzata.
- Semi di cellule sulle piastre rivestite con ECMH a 1 x 10 5 cellule/cm 2 a 4 mL (15 mL) di RSM.
- Permettono alle cellule di maturare per 30 giorni. Continuano a cambiare la RSM ogni 3-4 giorni.
- Ripetere la procedura di cui sopra (punto 5.2-5.11) al giorno 30 varco le cellule dal passaggio 1 o 2.
6. Creazione di una banca di cellule intermedie: crioconservazione di Passage 2 giorni 3-5 RPE
Nota: crioconservare le cellule mentre sono subconfluent (~ 50%) e non hanno riacquistato pigmento.
- In base al numero di cellule, calcolare il volume del mezzo di crioconservazione con 10% DMSO necessaria per risospendere le cellule ad una concentrazione di 3 x 10 6 cellule/mL.
- Seguire i passi 5.2 a 5.8. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crioconservazione con 10% DMSO a 3 x 10 6 cellule/mL e trasferire 1 mL di sospensione cellulare in 1,2 mL fiale criogeniche.
- Luogo criogenici fiale in un contenitore di congelamento progettato per raffreddare a-1 ° C/min e posto a-80 ° C durante la notte. Trasferimento a azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.
Nota: Queste cellule saranno passaggio 3 dopo lo scongelamento. Per altri 30 giorni prima caratterizzazione della coltura delle cellule. Seme del passaggio 3 RPE a 1,5 x 10 5 a cm 2 dopo lo scongelamento. 2 , 4 , 6 , 7
Representative Results
Questo metodo provoca la produzione di un monostrato omogeneo, pigmentata e cuboidale di RPE. La timeline nella Figura 1 corrisponde alle immagini raffigurate in Figura 2. Come mostrato nella Figura 2A, le colonie di cellule staminali sono stipate con bordi definiti e nessun cellule fibroblastiche tra colonie o opache celle all'interno di colonie. Figura 2B fornisce una rappresentazione di RPE immaturi che sono subconfluent. Se le celle sono già confluenti in questa fase, essi non possono estendere le proiezioni che sono fondamentali per il processo di differenziazione. Le cellule che sono gravemente subconfluent non sarà in grado di stabilire un monostrato e formano giunzioni strette, caratteristiche dell'epitelio. Dettagli su come ottimizzare questa confluenza sono descritte nella sezione discussione. Figura 2 Mostra la morfologia dei due tipi più comuni di non-RPE che possono insorgere durante questo processo di differenziazione: patch neurale o fibroblastica. È importante notare che queste patch neurale appaiono particolarmente opache su un microscopio per dissezione, considerando che le patch definite, fibroblastico-come sono quasi traslucide su un microscopio per dissezione. Esso può essere utile segnare queste aree su una piastra di coltura del tessuto con una penna di etanolo a prova di laboratorio per identificarli più facilmente su un microscopio ottico composto e il microscopio da dissezione. Figure 2D-F mostrano i caratteristici bordi brillante, morfologia del cobblestone e pigmentazione che indicano una cultura sana, maturazione di RPE. Nella figura 3 è un'immagine di ingrandimento superiore per mostrare il diverso aspetto del RPE completamente maturo raffigurata da contrasto di fase e microscopia del campo luminoso. Al passaggio 3 giorno 30, le cellule sono pronte per la caratterizzazione che è stato descritto in precedenti pubblicazioni, tra cui espressione RNA, espressione della proteina, secrezione di fattore di crescita e fagocitosi2,4,6 ,7. Queste caratterizzazioni mostrano che le cellule rappresentate in queste immagini sono non solo pigmentate e cuboidali, ma anche fagocitica, post-mitotici e polarizzata.
Figura 1:. Timeline per l'aggiunta di fattori di crescita e maturazione della RPE. Fattori di crescita vengono aggiunti a 12 pozzetti dal giorno 0-14. Fare maturare RPE sono coltivate in piastre da 6 pozzetti o T75 beute da giorno di arricchimento a post-disgelo 30 giorni (passaggio 3 giorni 30). Le frecce indicano passaggio enzimatico delle cellule. (A-E) sotto le sequenze temporali corrispondono alle immagini nella Figura 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: morfologia rappresentativa e confluenza di maturazione RPE. Cellule staminali pluripotenti indotte, immediatamente prima di passaggio per differenziazione (A). Subconfluent di cellule RPE immaturo al giorno 2 (B) e prima di arricchimento pick-a-rimuove il giorno 14; macchie di non-RPE (indicati da frecce bianche) appaiono come macchie o opaco "nastri" (C). RPE alla passaggio 0, 1 e 3 il giorno 30 (D, E e F). Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Mature RPE al passaggio 3: 30 del giorno Cuboidale morfologia raffigurato in contrasto di fase (A) e pigmentazione raffigurato in campo chiaro (B). Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive come produrre da cellule staminali pluripotenti le cellule epiteliali del pigmento retinico. Il metodo è stato ottimizzato utilizzando entrambe le cellule staminali pluripotenti umane embrionali e indotto da un metodo di coltura privo di alimentatore, privo di siero. Poiché l'isolamento iniziale di cellule staminali embrionali umane nel 1998 e la derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) nel 2007, una moltitudine di coltura della cellula formativa metodi sono stati sviluppati14,15,16, 17. Questi metodi dovrebbero essere sufficienti per la produzione di colonie di cellule staminali che sono sensibili a questa differenziazione. Non ci sono limitazioni noti l'applicabilità di questo metodo per le cellule staminali pluripotenti derivate e mantenuto correttamente.
I passaggi più critici sono il passaggio delle cellule staminali al giorno 0 di differenziazione (punto 2.5) e la potenziale necessità di dissezione manuale al giorno 14 del processo (punto 4.5). Quando la raccolta per rimuovere cellule differenziate dalle colonie di cellule staminali, fare riferimento alle immagini in Kent18. Come indicato, le cellule fibroblastiche tra colonie e le cellule opache all'interno di colonie indicano cellule differenziate che devono essere rimossi prima di iniziare questo protocollo18. Solo indifferenziati, fitte colonie con bordi definiti devono essere attraversate per differenziazione.
Il numero di cellule staminali seminato per pozzetto (passo 2.6.7) è complicato dal fatto che le cellule staminali non può essere triturate in una sospensione unicellulare al passaggio e non può essere conteggiate con precisione utilizzando un emocitometro. Il ravvicinamento delle cellule staminali confluenti di 80% è indicato per il passaggio 1 bene di una piastra a 6 pozzetti in 4 pozzetti di una piastra 12-pozzetti. Differenze tra linee di cellule staminali, come il tasso di crescita, possono influenzare quanto velocemente il RPE immaturo raggiungere confluenza tra giorni da 0 a 4. Le cellule staminali produrrà RPE indipendentemente dalla confluenza di preciso, ma il rendimento delle celle sarà influenzato negativamente se le celle sono troppo sparse in questa fase. Le cellule RPE immature dovrebbero essere circa 40-50% confluenti il giorno 1 e quasi 100% confluenti di giorno 4. Se le cellule non stanno producendo un monostrato confluente di giorno 4 o 6, il protocollo deve essere ripetuto in un' più alta densità di semina al giorno 0. Ad esempio, se 1 bene di una piastra a 6 pozzetti era attraversate 4 pozzetti di una piastra 12-pozzetti al giorno 0 e RPE immaturo non sono 100% confluenti al giorno 4, ridurre la semina per un passaggio di 1:3 o 1:2 il giorno 0 o permettono alle cellule staminali di diventare più confluenti prima di passaggio. È fondamentale per stabilire una densità di semina uniforme quando si confrontano le linee cellulari multiple.
Il passo di dissezione manuale al giorno 14 è necessario solo quando le cellule non-RPE sono presenti nella cultura (Figura 2). Poiché l'aggiunta di CHIR99021 al protocollo, molte linee di cellule staminali pluripotenti non richiedono poca o nessuna dissezione manuale. Alcune preparazioni hanno una maggiore incidenza di patch neurale ed è fondamentale per rimuovere quelle cellule. Se l'EPR non è vitale al passaggio 0 attraverso passaggio 3, è possibile ripetere il protocollo di differenziazione prendendo tempo sufficiente per rimuovere tutte le cellule non-RPE. Questo non accade spesso, ma è menzionato qui notare che il passo di dissezione il giorno 14 può essere ottimizzato quando necessario.
Ci sono una varietà di protocolli di differenziazione di RPE che variano nel costo, nonché i metodi di coltura, efficienza, quantificazione e valutazione funzionale, l'ultimo dei quali è stata accuratamente esaminata2. Noi preferiamo il metodo 14 giorni dettagliato qui a causa della sua efficacia, adattabilità e applicabilità ad una vasta gamma di cellulari linee4,7,8. Il passo di crioconservazione in questo protocollo fornisce anche un grande vantaggio nella creazione di una banca di cellule intermedie per un utilizzo futuro, evitando di lotto--lotto variabilità negli esperimenti. A partire da solo 4 pozzetti di una piastra 12-pozzetti, è possibile espandere in piastre da 6 pozzetti al passaggio 0 e T75 matracci a passaggio 1 e 2. Al passaggio 2 giorni 3-5, quando le cellule sono ancora subconfluent e non hanno riacquistato il pigmento, è possibile crioconservare decine di milioni di cellule e quindi disgelo RPE maturo, indicato passaggio 3 giorno 30, per controllare l'espressione del RNA, espressione della proteina, il fattore di crescita secrezione, fagocitosi, ecc. Abbiamo anche stabilito protocolli per espandere RPE per fino a 13 passaggi 19.
Guardando al futuro, questo metodo sarà utile per iPSC modellazione della malattia oculare e per la generazione di RPE per terapia cellulare. Questo protocollo viene attualmente utilizzato in laboratorio per produrre RPE da linee CRISPR-rettificato con controlli non corretta dallo stesso paziente, per quanto riguarda la modellazione di malattia iPSC. Inoltre, questo protocollo è adattabile ai substrati sintetici e condizioni prive di xeno che sono utili per avere aderito alle pratiche di buona fabbricazione necessarie per una terapia cellulare.
Disclosures
Dr. Clegg è un co-fondatore di rigenerativa Patch Technologies LLC.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'iniziativa Garland per visione, al California Institute per la medicina rigenerativa (CIRM; sovvenzioni DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 e TG2-01151), The Vermont Community Foundation, la Fondazione Breaux e la Fondazione lotta cecità Wynn-Gund ricerca traslazionale programma di accelerazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet | Baker | model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 | 6' Baker laminar flow biosafety cabinet |
| Dissection Hood | Labconco | Model 3970405 | laminar flow bench top |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ 1500 | heated stage |
| air-jacketed CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | 37 oC and 5% CO2 |
| inverted phase contrast microscope | Olympus | IX53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factors and Reagents | |||
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Recombinant mouse noggin | R&D systems | 1967-NG-025 | |
| Recombinant human DKK-1 | R&D systems | 5439-DK-010 | |
| Recombinant IGF-1 | R&D systems | 291-G1-200 | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| SU5402 FGF inhibitor | Santa Cruz Biotechnology | sc-204308 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Substrates | |||
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free | Corning | 356237 | extracellular matrix-based hydrogel (ECMH) |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free | Corning | 354277 | growth factor reduced ECMH |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| 1X Versene (EDTA) | Gibco | 15040066 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| 1X PBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 10010023 | |
| TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) | Gibco | 12563011 | |
| X-VIVO 10 (RPE supporting medium) | Lonza | BW04-743Q | |
| Y-27632 | Tocris | 12-541-0 (1254) | |
| CryoStor CS10 | BioLife Solutions | 210102 | cryopreservation medium |
| 1.2 mL Cryogenic Vial | Corning | 430487 | |
| Mr. Frosty (freezing container) | Nalgene | 5100-0001 | freezing container |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-2 | antimicrobial reagent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Equipment | |||
| Pipet-aid | Drummond | 4-000-101 | |
| 12-well culture plate | Corning | CLS3516 | Used during differentiation. |
| T75 flask | Corning | 430641 | Used during RPE maturation. |
| 6-well culture plate | Corning | CLS3513 | Used during RPE maturation. |
| cell scraper | Corning | 08-771-1A | Used during passages. |
| cell strainer | Falcon | 352340 | Used during passages before cell count. |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
- Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
- Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
- Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
- Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
- Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
- Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).
