Summary
Amyloid aflejring er kendetegnende for forskellige sygdomme og hjemsøger mange forskellige organer. Dette papir beskriver anvendelsen af selvlysende konjugeret oligothiophene fluorescens farvning i kombination med Fluorescens mikroskopi-teknikker. Denne farvning metode repræsenterer et kraftfuldt værktøj til afsløring og efterforskning af protein aggregater i både klinisk og videnskabelig opsætninger.
Abstract
Proteiner, der indbetaler som amyloid i væv i hele kroppen kan være årsag eller konsekvens af en lang række sygdomme. Blandt disse finder vi neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers og Parkinsons sygdom plager primært centralnervesystemet og Systemisk amyloidose hvor serum amyloid A, transthyretin og IgG Lyskæder depositum som amyloid i leveren, karpaltunnel tunnel, milt, nyre, hjerte og andre perifere væv. Amyloid har været kendt og undersøgt for mere end et århundrede, ofte ved hjælp af amyloid specifikke farvestoffer såsom Congo rød og Thioflavin T (ThT) eller Thioflavin (ThS). I dette papir præsenterer vi heptamer-formyl thiophen eddikesyre (hFTAA) som et eksempel på nyligt udviklede supplering af disse farvestoffer kaldet selvlysende konjugeret oligothiophenes (LCOs). hFTAA er nem at bruge og er kompatibel med co farvning i immunofluorescens eller andre cellulære markører. Omfattende forskning har vist, at hFTAA registrerer en bredere vifte af sygdom forbundet protein aggregater end konventionelle amyloid farvestoffer. Derudover kan hFTAA også anvendes for optisk tildeling af forskellige aggregerede morphotypes at tillade undersøgelser af amyloid fibril polymorfi. Mens den anvendte billedbehandling metode er valgfri, vi her vise hyperspectral imaging (HIS), laser scanning Konfokal mikroskopi og fluorescens levetid imaging (FLIM). Disse eksempler viser nogle af de billeddannende teknikker hvor LCOs kan bruges som værktøjer til at opnå mere detaljeret viden om dannelse og strukturelle egenskaber af amyloids. En vigtig begrænsning til teknik er for alle konventionelle Optisk mikroskopi-teknikker, kravet om mikroskopisk størrelse af aggregater til at tillade registrering. Endvidere bør samlet omfatte en gentagne β-plade struktur til at tillade hFTAA bindende. Overdrevne fiksering og/eller epitop eksponering, der ændrer den samlede struktur eller kropsbygning kan gøre fattige hFTAA binding og dermed udgøre begrænsninger til præcis billedbehandling.
Introduction
Deposition af amyloid i væv er en patologisk adelsmærke i et antal sygdomme såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, systemisk amyloidose og prionsygdomme. Trods forekomsten af amyloid-relaterede sygdomme, og det faktum, at tæt på 40 forskellige proteiner til dato har været klassificeret som amyloid prækursorer i menneskelige1, er lidt kendt om forholdet mellem amyloid aflejring og sygdom fænotype. Histologi prøver fra menneskelige patienter har været brugt både til diagnostiske og videnskabelige formål. Et stort antal dyremodeller har været etableret til at undersøge sammenhængen mellem amyloid byrde og adfærd, levetid og en række andre fænotypiske Læs outs sygdom progression2,3. Stor indsats laves også i drug discovery og design i kampen mod nogle af vores mest frygtede udbredte sygdomme. Men evalueringen af forbindelsen mellem genotype, fænotype, amyloid plaque belastning og drug administration er ikke ligetil. Værktøjer til farvning og imaging af amyloid i væv er ofte stumpt og give lav opløsning oplysninger om amyloid dannelse og struktur.
Congo rød dobbeltbrydning, ThT og ThS Fluorescens er eksempler på klassiske metoder til at opdage og analysere amyloid byrde i vævsprøver fra patient biopsier og post mortem prøver og sygdom4-dyremodeller. Disse teknikker har været brugt til flere årtier (Congo rød siden 1920erne og ThT og derivater siden i 1960 ' erne), og selvom instrumenteringen er blevet forfinet og giver mulighed for detaljeret analyse, farvning procedurer og analyse er stadig udføres på samme måde som næsten et århundrede siden.
I dette papir beskriver vi udnyttelsen af et stærkt følsomme roman amyloid farvestof, hFTAA5, der giver mulighed for påvisning af små umodne protein aflejringer med høj nøjagtighed, samt påvisning af modne amyloid. Sammenlignet med konventionelle farvestoffer, har hFTAA bevist at opdage en bredere vifte af sygdommen forbundet protein aggregater5,6,7. Derudover kan hFTAA også anvendes for optisk tildeling af forskellige aggregerede morphotypes8. Heri, beskriver vi hFTAA farvning og analyse af væv fra etablerede dyremodeller prion sygdom og Amyloid-β forløber Protein (APP) Transgene mus designet til at efterligne plaque udvikling i Alzheimers sygdom9,10 . Vi viser også analyse af diagnostiske og post mortem prøver fra patienter med systemisk amyloidose. LCOs har iboende egenskaber, der gør det muligt for dem at aflægge rapport om konformationelle forskelle inden for én plaque; og ved at kombinere to LCOs med forskellige egenskaber med hensyn til bindende og fluorescens, forskellen er endnu mere udtalt11. Et epifluorescensmikroskop udstyret med lang pass-filtre og en hyperspectral kamerahoved bruges til at muliggøre objektive klassificering af spektrale egenskaber og optagelse af micrographs for spektralanalyse. Konfokal Fluorescens mikroskopi med en afstemmelige laser som magnetisering kilde bruges til at evaluere de tredimensionale egenskaber af en amyloid plaque i større detalje. Afstemmelige laser giver mulighed for samling af excitation spektrum og en trin mindre udvalg af emission bølgelængder på mikroskopet kan Co billeddannelse af LCO fluorescens og immunfluorescens at bestemme Co lokalisering af target protein og amyloid. FLIM tilbyder hidtil uset følsomhed over for konformationel forskelle pålagt LCOs og afslører forskelle, der ikke kan registreres på fluorescens emission spektre.
De overordnede mål med metoden beskrevet farvning er at lette følsomme påvisning af små amyloid aflejringer og karakterisere konformationelle polymorfi inden for amyloid aflejringer. Denne viden er vigtig for den grundlæggende forståelse af protein sammenlægning sygdomme.
Protocol
Bemærk: LCO syntese er blevet udført i vores laboratorier i mere end et årti. Hovedsagelig anvender protokoller for elektrofil aromatisk substitution, krydskoblinger cross-kobling, AMID kobling og ester hydrolyse, tilpasser vi syntetisk sonder til forskellige formål 5 , 12. efter syntese, karakterisering og rensning, LCO produktet er frysetørret og opbevares ved stuetemperatur. Nogle af sonderne (blandt dem hFTAA) er nu kommercielt tilgængelige (Se Tabel of Materials).
1. LCO farvning løsning
NOTE: Hvis hFTAA er købt fra en kommerciel leverandør, skal du følge sælgeren ' s instruktioner i stedet for afsnit 1.
- Resuspend den frysetørrede hFTAA i 2 mM NaOH til at forberede en stamopløsning af 1 mg/mL. Holde bestanden i et hætteglas ved 4 ° C. Bestanden kan opbevares i et år.
- På dagen for farvning, forberede en arbejdsgruppe løsning ved at fortynde den stock 1:10,000 i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
2. Forberedelse af vævsprøver
Bemærk: mange vævstyper kan være afbildet ved hjælp af hFTAA som en amyloid markør. Se figur 1 for eksempler. hFTAA er følsom over for samlede kropsbygning. Farvning bør derfor helst udføres på undisrupted aggregater med ingen epitop eksponering. Optimal spektrale kvalitet opnås hvis væv fiksering er holdt på et minimum. Dermed foretrækkes friske frosne materiale, blidt fast i ethanol på tidspunktet for farvning. Det er dog muligt at påvise amyloid aflejringer også i væv, der er blevet rettet med fx formalin. hFTAA generelt trænger vævet godt. Vælg modellen tykkelse der er kompatibel med den påtænkte imaging teknik.
- Hvis formalin fast, parafinembedded afsnit bruges, deparafinize i xylen natten over. Dyp sektioner i træk bade af 99% ethanol, 70% ethanol, dH 2 O og PBS, 10 min i hver. Tillad afsnittene væv tørre omgivende betingelser.
Forsigtig: Xylen håndteres altid i en kemisk stinkskab. Xylen og andre organiske opløsningsmidler er sundhedsskadelige.- Tø snit frosset organmateriale i stuetemperatur. Fix afsnittene væv i 10% formalin natten over og Rehydrér ved at dyppe dem i træk bade af 99% ethanol, 70% ethanol, dH 2 O og PBS, 10 min i hver. Tillad afsnittene væv tørre omgivende betingelser.
- Tilføje dråber af hFTAA brugsopløsning (ca 200 µL) til afsnittene væv til at dække det. Denne droplet bør forblive på plads af overfladespænding. Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur til farvning.
- Skylles ud Farvningsopløsningen med 500 µL PBS ved hjælp af en pipette og derefter nedsænke diaset i PBS bad til 10 min. Tillad afsnittet tørre omgivende betingelser.
- Monteres ved hjælp af fluorescens montering medium. Tillader montering medium at bilægge natten.
Bemærk: hFTAA farvning kan være udført i kombination med andre farvning metoder såsom immunofluorescens, celle- eller organelle specifikke markører, osv. For at udføre farvning Co, køre din komplette farvnings-protokollen af valg og tilføje hFTAA farvning for enden, startende fra trin 2.2. Se figur 2 eksempler. Immunfluorescens, Vælg helst en sekundær antistof, der er spændt på 640 nm eller højere. I denne bølgelængdeområdet, hFTAA absorberer ikke og derfor ikke kan være glade for og vil ikke fluorescerer. Dette sikrer, at ingen bløder-gennem ses mellem hFTAA og antistof.
3. Mikroskopi
Bemærk: Brug et fluorescens mikroskop udstyret med lang pass-filtre. Alle indstillingerne nedenfor blev brugt til at generere billeder i figur 4. Justeringer skal gøres afhængig af amyloid type og væv prøven. Selv om hFTAA er bundet til amyloid er stabile mod blegning, det er tilrådeligt at slå fra lyskilden, når prøven ikke er undersøgt eller afbildet.
- Hans
Bemærk: eksperimentet blev udført ved hjælp af et epifluorescensmikroskop med lang pass emission filtre og et kamerahoved for hans (Se Tabel af materialer).- Brug en standard fluorescens mikroskop udstyret med lang pass-filtre og en hyperspectral kamera. Kontroller at den spektrale kamera er kalibreret.
- i softwaren, navngive projektet, vælge " spektrale billede " og starte erhvervelse.
- Vælg genstand for interesse gennem okulær bruger filteret 436-nm excitation og flytte den lette vej til kameraet.
- i the Case Data Manager (CDM), Vælg prøvetypen røde, etiket prøven, og tryk på erhverve. Erhvervelse åbnes.
- i vinduet erhvervelse " spektrale imaging ", åbne indstillingsmenuen, vælge egenskaber for erhvervelse og sat den spektrale sortiment til 460-700, hastighed kvalitet ved maksimal hastighed og måling type på gas/laser/smal filtre. Luk dialogboksen.
- i menuen billede, vælg live fuld. I baren ikoner deaktivere frynser. Vælge eller tilpasse størrelsen på et region til billede, der har den højeste hukommelsesværdi under 800 MB. Angive eksponeringstiden til en værdi, der giver et samlet billede lysstyrke mellem 1.000 og 3.000. Tryk på den farvede kamera i baren ikoner. Erhvervelse vil starte. Når billedet erhvervelse er fuldført, skal du trykke på Gem i den " erhverve spektrale billede " dialogboksen og " nye celle " i dialogboksen case data manager.
- Fra CDM, åbne indsamlede billedet ved hjælp af knappen start analyse. Data analyse vindue åbnes.
- Røde oplysninger kan indsamles fra hver pixel i billedet ved at vælge ROIs ved hjælp af dialogboksen spektrale display. Vælg " definerer " og vælg ROIs fra de relevante områder i billedet.
- Gemme den spektrale data som en tekstfil ved hjælp af knappen Lib. Den gemte .txt fil kan importeres til enhver analyse software valg. Filen .slb kan bruges til analyse i data analyse software. Hyperspectral kubedata fra hele billedet kan også eksporteres som en raw-fil, som " lag som tif ", eller som " lag i tekstformat " til data og billede analyse applikationer ved hjælp af eksterne software.
- Konfokal mikroskopi
Bemærk: Konfokal mikroskop er udstyret med en afstemmelige laser som magnetisering kilde. For alle fluorescens emission eksperimenter, angive laser intensiteten til 0,2% (svarende til en gennemsnitlig ydelse af 3 µW), pinhole til 1 luftige enhed, rammestørrelse til 1.024 px x 1,024 px, scanning hastighed som 7 og gennemsnit over 16 scanninger og bitdybde som 8 bit (Se < Sørensen Erikas > tabel af materialer). Disse indstillinger skal være justeret for hver enkelte Konfokal system, Laserkilde og prøvetypen.- For emission spektrum, indsamle data, der anvender lambda tilstand og excitation benytter argon laser sæt til 488 nm. Indsamle emission mellem 503 og 687 nm ved hjælp af 22 kanaler i 32 kanal GISP detektor. Indstiller gevinsten til 755.
- At opnå single channel-billeder, bruge smart oprettet indstilling. Til FITC (grønt filter), gain til 750 og Alexa 535 (rødt filter) indstillet gevinst til 845.
- At indsamle excitation spektrum med afstemmelige laser, bruge excitation med 1 nm trin mellem 490 og 545 nm mens indsamling emission mellem 551 og 586 nm. Angive laser intensiteten til 2% (svarende til en gennemsnitlig ydelse af 30 µW) og gevinsten for 774.
- Til at indsamle Z-stakken i tilstanden spektrale scanne gennem dybden af afsnittet i trin på 0,96 µm. De samme excitations- og indstillinger som i trin 3.2.1 kan bruges men indstillet gevinst til 730.
- FLIM
Bemærk: Konfokal mikroskop er udstyret med en FLIM enhed (Se Tabel af materialer).- Konfigurere følgende parametre for Konfokal mikroskop: Pinhole, 20; excitation bølgelængde, 490 nm; laser intensitet, 0,5% (svarende til en gennemsnitlig ydelse af 7,5 µW). Bruge pulserende lasere på 40 MHz.
- I FLIM software, konfigurere photon tælle over 550 nm. I vinduet Display parametre følge den photon tælle indtil Max tællingen er omkring 4.000 photon tæller.
- Gemme filen og eksportere det som SPC billede.
- Passer data til en 2-komponent eksponentiel henfald i FLIM software. En pasform, der giver en χ 2 < 2 er god. Værdi på y-aksen er antallet optællinger for en given levetid.
- Vælg en tærskel for tæller til også at omfatte f.eks. 100. Farvekode af T1 og vælg levetid rækkevidde. Henfald er afhængig af den amyloid struktur hvor hFTAA er bundet. Fluorescens levetid mellem 300 og 1000 ps er blevet observeret. Opspare fil.
- Eksportere de rå data ved hjælp af eksport indstillingerne og gemme de ønskede data i en ny mappe.
Representative Results
Følsom og selektiv farvning af amyloid aflejringer fra et stort antal proteiner i mange forskellige vævstyper fra både menneskelige patienter og forsøgsdyr er afgørende for klinisk diagnosticering såvel som videnskabelig forskning. I dette papir, vi viser, hvordan dette kan opnås ved hjælp af LCOs, eksemplificeret ved hFTAA, til farvning og multimodale billeddannelse af amyloid fra et udvalg af vævstyper. Siden den første offentliggørelse af thiophen-baserede amyloid ligander over ti år siden13, amyloid aflejringer består af en bred vifte af proteiner i en række væv har været afbildet ved hjælp af LCOs6,7,11, 14,15,16 (figur 1). I kombination med antistoffer eller andre histologiske markører give LCOs fremragende værktøjer til både diagnose og videnskabelige formål (figur 1a, figur 2). Med et passende udvalg af fluorescerende markører, kan være afbildet flere fluorophores på samme afdeling (figur 1a, hFTAA og DAPI, figur 2a hFTAA i immunofluorescens opsætning). Det er også muligt at anvende sammenhængende sektioner til farvning med brightfield og fluorescens (figur 2b, hFTAA og DAB antistoffarvning). For nylig har hFTAA vist sig for at være en meget lovende supplement til Congo rød farvning i klinisk diagnostik7,15 (figur 3).
Udvikling af Billeddannende teknikker i de sidste årtier har øget behovet for amyloid farvestoffer, der kan skelne mellem minut, men på samme tid dybtgående forskellene i amyloid aflejringer i en kvantitativ måde. Konjugeret systemet inden for LCO giver det en unik evne til at rapportere om variation i sin tilstand af bindende. Vrid i molekylet kan føre til konkurrenceforvridning i bindende vinkler i den konjugerede system og hindre transport af elektroner (figur 4a). Dette afspejler igen på fluorescerende egenskaberne for LCO både i excitations- og bølgelængde og emission levetid. Vi bruger hans i en opretstående fluorescens mikroskop udstyret med lang pass filtre for emission. For excitation og emission spektre i Konfokal mikroskopi og FLIM bruger vi en LSM780 med pulserende laser. For at eksemplificere de forskellige teknikker, vi filmede ét objekt (beta amyloid (Aβ) plaque i en APP Transgene mus) (figur 4b-e). Hyperspectral fluorescens-spektre (figur 4b) giver mulighed for evaluering af spektrale forskydninger og intensitet variation inden for forskellige områder af pladen. Excitation spektrum i Konfokal mikroskopi (fig. 4 c) kan bruges til at bestemme den optimale excitations bølgelængde for downstream eksperimenter, fx, kombination farvning med flere fluorophores. Denne metode kan også være nyttigt til påvisning af konformationelle forskelle i den bindende tilstand af LCO. Emission spektrum i Konfokal tilstand kan bruges til at bestemme fluorescens emission egenskaber fra hFTAA eller fra en kombination af flere fluorophores til at vurdere colocalization i kombination eksperimenter med flere LCOs eller LCO og immunfluorescens kombinationer. Fluorescens levetid af hFTAA er stærkt påvirket af små variationer i den bindende tilstand af hFTAA. Dermed er FLIM et kraftfuldt værktøj i diskrimination mellem de forskelle, der er pålagt hFTAA af det bindende mål (figur 4 d). Dette kan bruges for eksempel i diskrimination mellem forskellige prion stammer8. Konfokal imaging og forarbejdning Z-stakke til tre-dimensionelle billeder er et nyttigt værktøj til at udforske den overordnede form af amyloid samlet (figur 4e). Igen, brug af ekstra fluorophores kan støtte i forståelsen af sammensætningen af et depositum.
Figur 1: forskellige væv typer og proteiner aggregater viser h-FTAA farvning af: (et) Mallory-Denk organer består af keratin aggregater i en leveren (counterstained med DAPI), (b) p62-positive r optagelser i sporadiske integration-myositis (s-IBM) muskel kropsvæv, (c) Amyloid af holmen amyloid polypeptid i menneskets bugspytkirtel, (d) Amyloid af Immunoglobulin lys kæde i human tarmen, (e) får scrapie (prioner) i mus hjernen, (f ) Kronisk spilde sygdom (prioner) i mus hjernen, (g) Aβ-plaques i APP23 mus hjernen, (h) Aβ patologi i APP/PS1 mus hjerne, og (jeg) fedt biopsi udstrygninger fra diagnostiske prøver af transthyretin amyloid i menneskelige patienter gradueret 1-4 ifølge standard Congo rød (CR) scoring. Gule områder viser hFTAA farves amyloid aflejringer og blå er autofluorescence fra fedtvæv. Skala bar længde er angivet i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempler på Co farvning med antistoffer. (en) Co farvning med antiserum amyloid protein A (AA) immunofluorescens og hFTAA af menneskelige AA amyloid på samme afdeling. Øverst til venstre: AA antistof emission 640 nm; øverste højre hFTAA på 488 nm; bundpanelet overlay billede viser colocalization i gul. (b) antistof farvning og hFTAA fluorescens på hinanden følgende sektioner. Toppanelet: DAB AA antistoffarvning, nederste panel: hFTAA afbildet med en longpass emission filter. Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligne fluorescens med korte pass filtre på transthyretin amyloid i menneskelige hjerte, der farves med Mayers hæmatoxylin/Congo rød (en-d) og Mayers hæmatoxylin/hFTAA (e). (en) Brightfield billede, (b) Brightfield + fluorescens, (c) Brightfield + krydsede polarisatorer, (d) Brightfield + fluorescens + krydsede polarisatorer, (e) hFTAA fluorescens i 405nm + 480 nm excitation (sammenhængende sektioner til en-d). Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: det samme objekt farves med hFTAA og afbildet med flere teknikker demonstreres ved hjælp af en Aβ plaque i en ældre APP23 mus. (en) Fluorescens af hFTAA egenskaber er dikteret af sin konformationelle tilstand. Struktur af hFTAA i plane og snoede tilstand er vist. (b) Hyperspectral imaging for evaluering af kontinuerlig emission spektrum. Spektre i nederste panel er farvekodede boxed regioner af interesse i billedet. (c) (i) Confocal imaging for excitation imaging og (ii og iii) spektrum og emission imaging i filter- eller (iv) spektrale tilstand. (d) Fluorescens levetid billeddannelse til detektion af konformationelle forskelle i amyloid, hvor kortere levetid findes i periferien af Aβ plak og liv gange er længere i midten af pladen. Histogram i panelet lavere viser fordelingen af liv gange for hele pladen. Billedet er farvet efter skalaen under histogrammet. (e) Konfokal Z-stakken indsamlet i filtertilstand til at vise tre-dimensionelle struktur af objekter. Skala bar længde er angivet i hvert panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Deposition af anderledes foldede proteiner i amyloid er en vigtig begivenhed for mange sygdomsprocesser. Ekstracellulære, amyloid plaques består af Aβ peptider og intracellulære neurofibrillary tangles dannet af hyperphosphorylated tau findes i hjernen hos patienter med Alzheimers sygdom. En række forskellige proteiner, fx, transthyretin (TTR), Serum Amyloid A komponent (SAA), og IgG lys kæde misfold og manifestere sig som amyloid aflejringer i væv uden for CNS. Selvom amyloid aflejringer har været kendt og undersøgt for mere end et århundrede, vi stadig mangler detaljeret viden om hvordan amyloid er aflejring indledt på det molekylære niveau, og hvad kan gøres for at forhindre denne proces. For Alzheimers sygdom er det nødvendigt at bekræfte, hvordan processen med amyloidose er forbundet med neurodegeneration. Én nøgle søgen på missionen at behandle amyloidose er at udvikle roman finjusteret værktøjer til overvågning af amyloid indledning, progression og regression; Derfor er målrettet amyloid opdagelse nøglen. I det lange løb klinisk diagnostik vil drage fordel af øget følsomhed og selektivitet af amyloid farvning metoder7,15. Aktuelle udfordringer i denne henseende er enorm og er en meget aktiv forskningsområde. Én vigtigste spørgsmål for klinisk udvikling og forsøg er prognostiske diagnose. Disse sygdomme, som kan starte godt før symptomer vises, men til at begynde med behandling der skal være identifikation af sygdommen. Heri, er følsomhed et centralt aspekt for nye metoder. Desuden, problemet er endnu mere komplekse, fordi nogle protein aggregater er giftige, nogle er beskyttende, og nogle er neutral. Dermed er evnen til at overvåge specifikke aggregerede morphotypes væsentligt da eksistensen af forskellige aggregerede arter er blevet foreslået til at forklare heterogene fænotype rapporterede for en mangfoldighed af neurodegenerative protein sammenlægning sygdomme. For eksempel, er prionprotein et klassisk eksempel på hvordan en identiske primære sekvens af aminosyrer kan misfold i forskellige samlede morphotypes, som giver anledning til særlige prion stammer. Lignende polymorfi er også blevet rapporteret til Aβ-peptid, α-synuclein og tau. I denne henseende har LCOs vist sig at være fremragende værktøjer til optisk tildeling af forskellige aggregerede morphotypes. Prion-stamme-specifikke protein aggregater, protein indskud findes i flere typer af systemiske amyloidose, samt polymorfe Aβ og tau aggregater har været kendetegnet på grund af den for induceret optisk fænomen observeret fra LCOs.
Amyloid aflejring er en begivenhed, der finder sted i væv, der er svært at trænge igennem med biokemiske eller biofysiske metoder i molekylær præcision. Muligheden for at sonde begivenheder ex vivo, i vivoog in vitro- ved hjælp af de samme LCO molekyler sætter scenen for unraveling hændelser, som forekommer i vivo ved hjælp af teknikker, der er kun muligt at anvende på ex vivo eller i vitro prøver11,17. En nylig rapporteret høj opløsning strukturelle model viser at LCO pentameric FTAA (pFTAA) bindes i et hulrum dannet af justeret sidekæder parallelt med fibril akse der strækker sig over 6 i registret parallelle beta-tråde18, viser, at det er muligt at få atomic opløsning viden om enheder af LCO mål. Bindende hulrum og bindende tilstand af pFTAA er i virkeligheden svarer til Congo rød19, dikteret af et groove, foret med gentagne positivt ladede Lys side-kæder. Affinitet af LCOs synes at være bedre i forhold til Congo rød sandsynligvis kæde fleksibilitet og stærk van der Waals interaktioner af svovl atomer Ringenes thiophen mod den hydrofobe hulrum. Påvisning af prefibrillar arter (før ThT reagerer)5,20 vises afhængig af gentagne β plader, sammensat af i registrere parallel-beta-tråde, der for hFTAA er to thiophen enheder længere end pFTAA ville span passage af op til 8 beta-tråde.
Farvning protokollen kræver opmærksomhed til fejlsøgning på følgende: (i) fiksering: omfattende fiksering af vævsprøver kan forstyrre den amyloid struktur og begrænse muligheden for at opdage variation i fluorescens-spektre induceret af konformationelle forvrængning af hFTAA-molekyle. Mild fiksering af snit frosset organmateriale fra frisk frosset materiale er foretrukket at opnå optimal spektrale opløsning. Men hFTAA vil plette og fluorescerer amyloid i faste væv, men med reduceret effektivitet og mindre spektrale variation. (ii) epitop eksponering: forbehandling af væv at nå epitop eksponering for antistof bindende kan undertiden reducere evnen til hFTAA til at binde på grund af forstyrret amyloid struktur. Hvis dette er et problem, og epitop eksponering er et afgørende skridt i antistof farvning protokol, ved hjælp af på hinanden følgende sektioner for antistof og hFTAA, kan henholdsvis betragtes. (iii) overstaining: hFTAA er ekstremt følsomme. Arbejde løsninger bør opbevares ved lav nM koncentration. Mindske koncentrationen af hFTAA, hvis baggrund farvning er et problem. Hvis elementer, der binder hFTAA er sparsomme i væv, kan et overskud af hFTAA samlede og ophobes i montering medium. Dette er anerkendt som fluorescens, der ikke er i fokus flyet af væv sig selv. Hvis dette forekommer, fordybe Den monterede dias i PBS indtil cover slip kan være gled af afsnittet, vask med PBS, og monter med friske montering medium og et nyt cover slip. (iv) filter baseret billedbehandling: dette papir beskriver det meste spektralt løst fluorescens imaging bruger lang pass-filtre eller flere opdagelse kanaler. hFTAA kan også blive overvåget ved hjælp af korte pass-filtre. Vær opmærksom på at dette vil reducere kontrasten og afskaffe muligheden for at opdage flere farver.
I de seneste år er det blevet klart, at forskning værktøjer, fluorescerende LCOs og især hFTAA viser meget lovende egenskaber. Resultater har været demonstreret for et stort udvalg af proteiner og sygdomstilstande, lige fra hFTAA påvisning af aggregater inde celler (tau, inklusion krop myositis), systemisk amyloid serum amyloid A, transthyretin, Immunoglobulin lys kæder (kappa og Lambda) seminogelin 1, prion protein (herunder kliniske prøver)21, Holmen amyloid polypeptid og insulin7,15. En begrænsende faktor for gennemførelsen af hFTAA som et diagnostisk redskab er, at Fluorescens mikroskopi ikke er flittigt brugt i rutinemæssige amyloid patologi labs. Endvidere, hans er ikke let tilgængelige i klinikken. Men hFTAA amyloid farvning og Fluorescens mikroskopi er blevet brugt i kliniske laboratorier i et filter baseret fluorescens mikroskop og børbetragtes som en gratis diagnostisk metode. Dette blev for nylig demonstreret på karpaltunnel biopsier med transthyretin amyloidose ved hjælp af grundlæggende indstillinger for fluorescens i en automatiseret måde22.
Endvidere ud over forskellige proteiner, hFTAA fluorescens genkender en lang række fibril typer og pre fibrillar amyloid aggregater, fx, pathway fibrillar arter er blevet opdaget og karakteriseret. I denne publikation har vi påvist én LCO på forskellige prøve typer ved hjælp af tre mikroskopi-teknikker. Brugen af kontrollerede syntese har også tilladt for udviklingen af LCOs for alsidig påvisning af Biomolekylær mål, f.eks.registrering af interaktioner af overflade plasmon resonans (SPR)23 og radiolabeling for positron emission tomografi (PET)24.
Til dato har er over 25 forskellige LCOs med blevet offentliggjort. Øget brug af LCOs til billeddannelse af amyloid aflejringer vil øge viden og forståelse af, hvordan disse sygdom-associerede aggregater samle, demontere og blande sig med de organer og personer, hvor de er bosat.
Disclosures
PH PN MB SN er mindre aktionærer i Ebba Biotech, der commercializes hFTAA under navnet Amytracker545.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Mikael Lindgren og Chanan Sluzny for rådgivning på Fluorescens mikroskopi, og Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias sporskifteomstillingudbydere, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark og Kurt Zatloukal for at bidrage væv sektioner eller micrographs vises i denne publikation. Indsamling af præsenteres data heri har været finansieret af bidrag fra svenske hjernen Foundation (Hjärnfonden), den svenske Alzheimers association (Alzheimerfonden), det svenske Forskningsråd (VR), foreningen Göran Gustafsson Georg & Astrid Olsson, EU RP7 sundhed projekt LUPAS og Linköping Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
| Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
| LeicaDM6000 | Leica | ||
| Lumen 200 | Prior | ||
| Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
| Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
| LSM780 | Zeiss | ||
| Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
| FLIM system | Becker & Hickl | ||
| Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
| Tunable Laser In Tune | Zeiss |
References
- Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
- Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
- Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
- Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
- Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
- Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
- Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
- Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
- Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
- Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
- Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
- Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
- Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
- Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
- Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
- Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
- Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
- Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
- Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
- Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
- CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
- Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
- Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
- Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).
