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Biochemistry

इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग

Published: October 20, 2017 doi: 10.3791/56279
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1IFM-Department of Chemistry, Linköping University

Summary

Amyloid जमाव विभिन्न रोगों की एक बानगी है और कई विभिन्न अंगों को दु. इस कागज प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ संयोजन में धुंधला luminescent संयुग्मित oligothiophene प्रतिदीप्ति के आवेदन का वर्णन । इस धुंधला विधि का पता लगाने और दोनों नैदानिक और वैज्ञानिक setups में प्रोटीन समुच्चय के अंवेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

Abstract

प्रोटीन है कि शरीर भर में ऊतकों में amyloid के रूप में जमा कारण या रोगों की एक बड़ी संख्या का परिणाम हो सकता है । इन के अलावा हम अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग मुख्यतः केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, और प्रणालीगत amyloidosis जहां सीरम amyloid एक, transthyretin और आईजीजी प्रकाश जंजीरों के रूप में जमा की बीमारी के रूप में neurodegenerative रोगों का पता लगाने के जिगर में amyloid, कार्प सुरंग, तिल्ली, गुर्दे, दिल, और अन्य परिधीय ऊतकों. Amyloid गया है और एक सदी से भी अधिक के लिए अध्ययन किया, अक्सर Amyloid विशिष्ट रंगों जैसे कांगो रेड और Thioflavin टी (थट) या Thioflavin (थस) का उपयोग कर । इस पत्र में, हम hFTAA luminescent संयुग्मित (oligothiophenes) नामक इन रंजक को हाल ही में विकसित पूरित करने के एक उदाहरण के रूप में heptamer-formyl thiophene एसिटिक अम्ल (LCOs) प्रस्तुत करते हैं. hFTAA उपयोग करने के लिए आसान है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में या अन्य सेलुलर मार्कर के साथ सह दाग के साथ संगत है. व्यापक अनुसंधान साबित किया है कि hFTAA पारंपरिक amyloid रंगों की तुलना में रोग से जुड़े प्रोटीन समुच्चय की एक व्यापक रेंज का पता लगाता है । इसके अलावा, hFTAA भी amyloid फाइब्रिल बहुरूपता के अध्ययन की अनुमति के लिए अलग एकीकृत morphotypes के ऑप्टिकल काम के लिए लागू किया जा सकता है । जबकि इमेजिंग पद्धति लागू वैकल्पिक है, हम यहां hyperspectral इमेजिंग (अपने), लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग (FLIM) प्रदर्शित करते हैं । ये उदाहरण कुछ इमेजिंग तकनीकों को दिखाते है जहां LCOs को amyloids के गठन और संरचनात्मक गुणों की अधिक विस्तृत जानकारी प्राप्त करने के लिए उपकरणों के रूप में उपयोग किया जा सकता है । तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा है, के रूप में सभी पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए, समुच्चय के सूक्ष्म आकार के लिए आवश्यकता का पता लगाने की अनुमति है । इसके अलावा, कुल एक दोहराव β-शीट संरचना hFTAA बंधन के लिए अनुमति देने के लिए शामिल करना चाहिए । अत्यधिक निर्धारण और/या epitope प्रदर्शन है कि कुल संरचना या अनुरूपता को संशोधित गरीब hFTAA बाध्यकारी प्रदान कर सकते है और इसलिए सटीक इमेजिंग के लिए सीमाएं मुद्रा ।

Introduction

ऊतक में amyloid के जमाव जैसे अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, प्रणालीगत amyloidosis, और prion रोगों के रूप में एक संख्या रोगों में एक रोग बानगी है । amyloid से संबंधित रोगों की व्यापकता के बावजूद, और तथ्य यह है कि करीब ४० अलग प्रोटीन की तारीख को मानव में amyloid के रूप में वर्गीकृत किया गया है1, थोड़ा amyloid साठा और रोग phenotype के बीच संबंध के बारे में जाना जाता है । मानव रोगियों से नमूनों की प्रोटोकॉल नैदानिक और वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए दोनों का उपयोग किया गया है । पशु मॉडलों की एक बड़ी संख्या में amyloid बोझ और व्यवहार, जीवन काल, और अंय phenotypic के एक नंबर के बीच संबंध की जांच की स्थापना की गई है रोग प्रगति2,3के बहिष्कार पढ़ें । बड़े प्रयास भी दवा खोज और डिजाइन में किए जा रहे है हमारे सबसे अधिक भयभीत व्यापक रोगों के कुछ लड़ाई । हालांकि, जीनोटाइप, phenotype, amyloid पट्टिका लोड के बीच कनेक्शन के मूल्यांकन, और दवा प्रशासन सीधे आगे नहीं है । धुंधला और ऊतक में amyloid की इमेजिंग के लिए उपकरण अक्सर कुंद कर रहे है और amyloid गठन और संरचना पर कम संकल्प जानकारी प्रदान करते हैं ।

कांगो लाल birefringence, थट, और थस प्रतिदीप्ति रोगी amyloid और पोस्ट मार्टम नमूनों से ऊतक के नमूनों में बायोप्सी बोझ का पता लगाने और विश्लेषण के लिए शास्त्रीय तरीकों के उदाहरण हैं, और रोग के पशु मॉडल4। इन तकनीकों कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है (1920 के दशक के बाद से कांगो और थट और डेरिवेटिव के बाद से लाल), और यद्यपि इंस्ट्रूमेंटेशन परिष्कृत किया गया है और विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, धुंधला प्रक्रियाओं और विश्लेषण अभी भी किया जा रहा है लगभग एक सदी पहले के रूप में एक ही तरीके से ।

इस पत्र में, हम एक अति संवेदनशील उपंयास amyloid डाई, hFTAA5, कि उच्च सटीकता के साथ छोटे अपरिपक्व प्रोटीन जमा का पता लगाने के साथ ही परिपक्व amyloid का पता लगाने की अनुमति देता है के उपयोग का वर्णन । पारंपरिक रंगों की तुलना में, hFTAA रोग से जुड़े प्रोटीन समुच्चय5,6,7की एक व्यापक श्रेणी का पता लगाने के लिए सिद्ध किया गया है । इसके अलावा, hFTAA भी विशिष्ट एग्रीगेट morphotypes8के ऑप्टिकल असाइनमेंट के लिए लागू किया जा सकता है । इस के साथ साथ, हम hFTAA धुंधला और prion रोग और Amyloid की स्थापना की पशु मॉडल से ऊतक के विश्लेषण का वर्णन-β अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) ट्रांसजेनिक चूहों अल्जाइमर रोग में पट्टिका विकास की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया9,10 . हम भी प्रणालीगत amyloidosis से पीड़ित रोगियों से नैदानिक और पोस्ट मार्टम नमूने का विश्लेषण दिखा । LCOs आंतरिक गुण है कि उंहें एक पट्टिका के भीतर गठन मतभेदों पर रिपोर्ट करने के लिए सक्षम बनाता है; और बाध्यकारी और प्रतिदीप्ति के बारे में विभिंन गुणों के साथ दो LCOs के संयोजन से, अंतर और भी अधिक स्पष्ट है11। एक epifluorescence माइक्रोस्कोप लंबे पास फिल्टर और एक hyperspectral कैमरा सिर के साथ सुसज्जित वर्णक्रमीय विश्लेषण के लिए वर्णक्रमीय गुण और माइक्रोग्राफ की रिकॉर्डिंग के उद्देश्य वर्गीकरण को सक्षम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । उत्तेजना स्रोत के रूप में एक स्वरित्र लेजर के साथ फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अधिक से अधिक विस्तार में एक amyloid पट्टिका के तीन आयामी गुणों का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । स्वरित्र लेजर उत्तेजना स्पेक्ट्रम के संग्रह और माइक्रोस्कोप पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक कदम कम चयन सक्षम बनाता है सह LCO प्रतिदीप्ति और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के इमेजिंग लक्ष्य प्रोटीन और amyloid के सह-स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए सक्षम बनाता है । FLIM LCOs पर लगाया गया है और मतभेद है कि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा पर नहीं पाया जा सकता है पता चलता है के गठन के लिए अभूतपूर्व संवेदनशीलता प्रदान करता है ।

वर्णित धुंधला विधि के साथ मुख्य लक्ष्यों को छोटे amyloid जमा के प्रति संवेदनशील का पता लगाने की सुविधा और amyloid जमा के भीतर गठन बहुरूपता विशेषताएं हैं । यह ज्ञान प्रोटीन एकत्रीकरण रोगों की मूल समझ के लिए महत्वपूर्ण है ।

Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: LCO संश्लेषण एक दशक से अधिक के लिए हमारी प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया गया है. मूलतः electrophilic खुशबूदार प्रतिस्थापन के लिए प्रोटोकॉल लागू करके, पैलेडियम catalyzed पार-युग्मन, युग्मन के बीच, और एस्टर hydrolysis, हम कृत्रिम रूप से विभिंन प्रयोजनों के लिए जांच अनुकूलित < सुप वर्ग = "xref" > 5 , < सुप वर्ग = "xref" > १२ . संश्लेषण, लक्षण वर्णन, और शुद्धि के बाद, LCO उत्पाद lyophilized और कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाता है । जांच के कुछ (उंहें hFTAA के बीच) अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (सामग्री के तालिका देखें) ।

< p class = "jove_title" > 1. LCO धुंधला समाधान

< p class = "jove_content" > नोट: यदि hFTAA किसी वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा गया है, तो कृपया अनुभाग 1 के बजाय विक्रेता & #39; s निर्देशों का पालन करें.

  1. 2 mM NaOH में lyophilized hFTAA reसस्पैंड 1 मिलीग्राम/एमएल का एक स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए । शेयर को एक गिलास शीशी में रख कर 4 & #176; ग. शेयर एक साल के लिए स्टोर किया जा सकता है ।
    2. धुंधला के दिन पर
  2. , कमजोर शेयर 1 से एक काम समाधान तैयार: फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में 10000 ।
< p class = "jove_title" > 2. ऊतक नमूनों की तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: कई प्रकार के ऊतक एक amyloid मार्कर के रूप में hFTAA का उपयोग कर imaged किया जा सकता है. देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ उदाहरण के लिए. hFTAA समग्र अनुरूपता के प्रति संवेदनशील है । धुंधला इसलिए अधिमानतः कोई epitope जोखिम के साथ बाधित समुच्चय पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इष्टतम वर्णक्रमीय गुणवत्ता अगर ऊतक निर्धारण एक ंयूनतम करने के लिए रखा जाता है हासिल की है । इसलिए ताजा जमे हुए सामग्री, धीरे धुंधला के समय इथेनॉल में तय, पसंद है । हालांकि, यह ऊतक कि जैसे , formalin के साथ तय किया गया है में भी amyloid जमा का पता लगाने के लिए संभव है । hFTAA आम तौर पर ऊतक अच्छी तरह से प्रवेश । एक नमूना मोटाई है कि इरादा इमेजिंग तकनीक के साथ संगत है का चयन करें ।

  1. यदि formalin तय हो, parafinembedded वर्गों का उपयोग किया जाता है, deparafinize में रात को अधिक । ९९% इथेनॉल, ७०% इथेनॉल, डीएच 2 ओ, और पंजाबियों, प्रत्येक में 10 मिनट के लगातार स्नान में वर्गों डुबकी । परिवेशी परिस्थितियों में ऊतक अनुभागों को सूखने दें.
    चेतावनी: Xylene हमेशा एक रासायनिक धुएं हुड में संभाला है । Xylene और अंय कार्बनिक सॉल्वैंट्स हानिकारक हैं । कमरे के तापमान में
    1. गल cryosections । 10% formalin में ऊतक वर्गों फिक्स रातोंरात और उंहें ९९% इथेनॉल, ७०% इथेनॉल, डीएच 2 ओ, और पंजाबियों, प्रत्येक में 10 मिनट के लगातार स्नान में डूबा द्वारा reहाइड्रेट । परिवेशी परिस्थितियों में ऊतक अनुभागों को सूखने दें.
  2. hFTAA कार्य समाधान की बूंदें जोड़ें (लगभग २०० & #181; L) ऊतक वर्गों के लिए इसे कवर करने के लिए. छोटी बूंद सतह तनाव से जगह में रहना चाहिए । धुंधला के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  3. के साथ धुंधला समाधान बंद कुल्ला ५०० & #181; L पंजाबियों एक पिपेट का उपयोग कर और फिर 10 मिनट के लिए पंजाबियों स्नान में स्लाइड विसर्जित । धारा को परिवेशी परिस्थितियों में सूखने दें ।
  4. माउंट प्रतिदीप्ति बढ़ते माध्यम का उपयोग कर । बढ़ते माध्यम को रातोंरात बसने की अनुमति दें ।
    नोट: hFTAA धुंधला जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस, सेल या organelle विशिष्ट मार्करों, आदि के रूप में अंय धुंधला तरीकों के साथ संयोजन में किया जा सकता है । सह-धुंधला प्रदर्शन करने के लिए, अपनी पसंद का पूरा दाग प्रोटोकॉल चलाने और अंत में hFTAA धुंधला जोड़ने, कदम २.२ से शुरू । देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ उदाहरण के लिए. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, अधिमानतः एक माध्यमिक एंटीबॉडी कि ६४० एनएम या उच्च पर उत्साहित है का चयन करें । इस तरंग दैर्ध्य रेंज में, hFTAA अवशोषित नहीं करता है और इसलिए उत्तेजित नहीं किया जा सकता है और fluoresce नहीं होगा । यह सुनिश्चित करता है कि कोई खून के माध्यम से hFTAA और एंटीबॉडी के बीच देखा जाता है ।
< p class = "jove_title" > 3. माइक्रोस्कोपी

< p class = "jove_content" > नोट: लांग पास फिल्टर से सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । नीचे सभी सेटिंग्स < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 में छवियों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था । समायोजन amyloid प्रकार और ऊतक नमूने के आधार पर किए जाने की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि amyloid के लिए बाध्य hFTAA ब्लीचिंग की ओर स्थिर है, यह उचित है बंद प्रकाश स्रोत बारी जब नमूना जांच या छवि नहीं है ।

  1. अपने
    नोट: प्रयोग लंबे समय से गुजारें उत्सर्जन फिल्टर और उसके लिए एक कैमरा सिर के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (सामग्री के तालिका देखें) ।
    1. लंबे पास फिल्टर और एक hyperspectral कैमरा के साथ सुसज्जित एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि वर्णक्रमीय कैमरा तुले हुए है ।
      2. सॉफ्टवेयर में
    2. , प्रोजेक्ट का नाम, select & #34; वर्णक्रमीय इमेज & #34; और प्रारंभ प्राप्ति.
    3. ४३६-एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग कर नेत्र के माध्यम से ब्याज की वस्तु का चयन करें और कैमरे के लिए प्रकाश पथ शिफ्ट.
    4. डेटा प्रबंधक (सीडीएम) में, नमूना प्रकार वर्णक्रमीय का चयन करें, नमूना लेबल, और अधिग्रहण दबाएँ. अधिग्रहण की खिड़की खुल जाएगी ।
    5. में अधिग्रहण खिड़की & #34; वर्णक्रमीय इमेजिंग & #34;, सेटिंग्स मेनू खोलें, अधिग्रहण गुण का चयन करें, और ४६०-७०० के लिए वर्णक्रमीय सीमा सेट, अधिकतम गति से गति की गुणवत्ता, और गैस/लेजर/संकीर्ण फिल्टर पर माप प्रकार । संवाद बॉक्स बंद करें ।
      6. छवि मेनू में
    6. , लाइव पूर्ण का चयन करें । चिह्न पट्टी में, किनारे की बारी है । चुनें या एक क्षेत्र छवि है कि चोटी स्मृति मान ८०० MB नीचे है के लिए आकार । १,००० और ३,००० के बीच कुल छवि चमक देता है एक मान के लिए एक्सपोज़र समय सेट करें । प्रतीक पट्टी में, रंगीन कैमरा दबाएँ. अधिग्रहण शुरू होगा । जब छवि प्राप्ति पूर्ण हो जाती है, तो & #34 में सहेजें दबाएँ; प्राप्त करें वर्णक्रमीय छवि & #34; संवाद बॉक्स और & #34; नया सेल & #34; मामला डेटा प्रबंधक संवाद बॉक्स में ।
      7. सीडीएम से
    7. , एकत्रित छवि विश्लेषण प्रारंभ करें बटन का उपयोग कर खोलें । डेटा विश्लेषण विंडो खुलेगी ।
    8. वर्णक्रमीय जानकारी वर्णक्रमीय प्रदर्शन संवाद बॉक्स का उपयोग कर ROIs का चयन करके छवि के प्रत्येक पिक्सेल से एकत्र किया जा सकता है । चुन & #34;d efine & #34; और छवि के प्रासंगिक क्षेत्रों से ROIs का चयन करें.
    9. एक पाठ Lib बटन का उपयोग कर फ़ाइल के रूप में वर्णक्रमीय डेटा सहेजें । सहेजी गई. txt फ़ाइल को पसंद के किसी भी विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आयात किया जा सकता है । . slb फ़ाइल का उपयोग डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के भीतर विश्लेषण के लिए किया जा सकता है । संपूर्ण छवि से hyperspectral क्यूब डेटा को raw फ़ाइल के रूप में भी निर्यात किया जा सकता है, जैसा कि & #34; लेयर्स tif & #34;, या के रूप में & #34; परतें पाठ स्वरूप में & #34; बाह्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा और छवि विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए.
  2. फोकल माइक्रोस्कोपी
    नोट: फोकल माइक्रोस्कोप स्वरित्र स्रोत के रूप में एक उत्तेजना लेजर से सुसज्जित है । सभी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रयोगों के लिए, लेजर तीव्रता ०.२% (3 & #181 की एक औसत शक्ति के अनुरूप सेट; डब्ल्यू), pinhole 1 हवादार इकाई के लिए, फ्रेम आकार करने के लिए १,०२४ पिक्सल x १,०२४ पिक्सल, स्कैन गति के रूप में 7 और औसत पर 16 स्कैन, और बिट गहराई के रूप में 8 बिट (देखें < s टरोंं > सामग्री की टेबल ) । ये सेटिंग्स प्रत्येक व्यक्ति के लिए फोकल सिस्टम, लेजर स्रोत, और नमूना प्रकार के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है । उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के लिए
    1. , लीजिए लैंब्डा मोड और ४८८ एनएम के लिए सेट आर्गन लेजर का उपयोग कर उत्तेजना का उपयोग कर डेटा. ५०३ और ६८७ एनएम के बीच उत्सर्जन ३२ चैनल हांफते डिटेक्टर में 22 चैनलों का उपयोग कर लीजिए । ७५५.
      2. करने के लिए लाभ सेट
    2. एकल चैनल छवियों को प्राप्त करने के लिए, स्मार्ट सेट अप विकल्प का उपयोग करें । FITC (ग्रीन फ़िल्टर) के लिए, ७५० और Alexa ५३५ (लाल फ़िल्टर) के लिए लाभ सेट ८४५.
      3. करने के लिए लाभ सेट
    3. स्वरित्र लेज़र के साथ उत्तेजना स्पेक्ट्रम एकत्र करने के लिए, ५५१ और ५८६ एनएम के बीच उत्सर्जन का संग्रह करते समय ४९० और ५४५ एनएम के बीच 1 एनएम स्टेप्स के साथ उत्तेजना का उपयोग करें । लेजर तीव्रता 2% करने के लिए सेट (30 & #181; W) और ७७४.
      4. करने के लिए लाभ की एक औसत शक्ति के लिए इसी
    4. वर्णक्रमीय मोड में Z-स्टैक एकत्र करने के लिए, ०.९६ के चरणों में खंड की गहराई के माध्यम से स्कैन & #181; एम. एक ही उत्तेजना और उत्सर्जन सेटिंग्स के रूप में कदम 3.2.1 में इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन ७३०.
      5. करने के लिए लाभ सेट
  3. FLIM
    नोट: फोकल माइक्रोस्कोप एक FLIM इकाई से सुसज्जित है (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. ऊपर फोकल माइक्रोस्कोप के लिए निंनलिखित मापदंडों सेट: Pinhole, 20; उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, ४९० एनएम; लेजर तीव्रता, ०.५% (७.५ & #181; W) की एक औसत शक्ति के अनुरूप । ४० मेगाहर्ट्ज में स्पंदित पराबैंगनीकिरण का उपयोग करें
      2. FLIM सॉफ्टवेयर में
    2. , ५५० एनएम से अधिक फोटॉन गिनती की स्थापना की । प्रदर्शन पैरामीटर विंडो में, अधिकतम गणना ४,००० फोटॉन गिनती के आसपास है जब तक फोटॉन गिनती का पालन करें ।
    3. फ़ाइल सहेजें और इसे SPC छवि के रूप में निर्यात करें.
    4. FLIM सॉफ्टवेयर में एक 2-घटक घातीय क्षय के लिए डेटा फिट । एक फिट जो एक & #967 देता है; 2 & #60; 2 अच्छा है । y-अक्ष पर मान दिए गए जीवनकाल के लिए गणना की संख्या है ।
    5. को शामिल करने के लिए गणना के लिए एक सीमा का चयन करें, जैसे , १०० । T1 द्वारा रंग कोड और चुनें लाइफटाइम रेंज । क्षय amyloid संरचना पर निर्भर है जहां hFTAA है । ३०० और १,००० पुनश्च के बीच प्रतिदीप्ति जंमों मनाया गया है । फ़ाइल सहेजें.
    6. निर्यात विकल्प का उपयोग करके raw डेटा निर्यात करें और इच्छित डेटा को किसी नए फ़ोल्डर में सहेजें ।

Representative Results

संवेदनशील और चुनिंदा दोनों मानव रोगियों और प्रयोगात्मक पशुओं से कई अलग ऊतक प्रकार में प्रोटीन की एक बड़ी संख्या से amyloid जमा के दाग नैदानिक निदान के लिए महत्वपूर्ण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वैज्ञानिक अनुसंधान में है । इस पत्र में, हम प्रदर्शन कैसे इस LCOs का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, hFTAA द्वारा उदाहरण, दाग और multimodal के लिए amyloid के इमेजिंग ऊतक प्रकार के एक चयन से । के बाद से दस साल पहले thiophene-आधारित amyloid लाइगैंडों के पहले प्रकाशन13, amyloid ऊतकों की एक किस्म में प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला से बना जमाव LCOs6,7,11का उपयोग कर imaged किया गया है, 14,15,16 (चित्रा 1). एंटीबॉडी या अन्य ऊतकीय मार्करों के साथ संयोजन में, LCOs नैदानिक और वैज्ञानिक प्रयोजनों (चित्र 1a, चित्रा 2) के लिए उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं. फ्लोरोसेंट मार्करों की एक उपयुक्त चयन के साथ, कई fluorophores एक ही खंड (चित्र 1a, hFTAA और DAPI, चित्रा 2a hFTAA में इम्यूनोफ्लोरेसेंस सेटअप) पर imaged जा सकता है । यह भी brightfield और प्रतिदीप्ति (चित्रा बी, hFTAA और ढाब एंटीबॉडी धुंधला) का उपयोग दाग के लिए लगातार वर्गों का उपयोग करने के लिए संभव है । हाल ही में, hFTAA के लिए एक उच्च होनहार नैदानिक निदान7,15 (चित्रा 3) में लाल दाग कांगो के पूरक साबित हो गया है ।

पिछले दशकों में इमेजिंग तकनीक के विकास से amyloid रंजक की जरूरत बढ़ गई है जो कि मिनट के बीच भेदभाव कर सकते हैं, लेकिन एक ही समय में amyloid जमाओं में एक मात्रात्मक तरीके से गहरा अंतर है. LCO के भीतर संयुग्मित प्रणाली यह एक अद्वितीय के लिए बाध्यकारी के अपने मोड में भिंनता पर रिपोर्ट करने की क्षमता के साथ प्रदान करता है । अणु के घुमा संयुग्मित प्रणाली में बाध्यकारी कोण में विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते है और इलेक्ट्रॉनों के परिवहन में बाधा (चित्र 4a) । यह बारी में दोनों उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य और उत्सर्जन जीवनकाल में LCO के फ्लोरोसेंट संपत्तियों पर प्रतिबिंबित करता है । हम उत्सर्जन के लिए लंबे समय से गुजारें फिल्टर के साथ सुसज्जित एक ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में उसका इस्तेमाल करते हैं । उत्तेजना और फोकल माइक्रोस्कोपी और FLIM में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए, हम स्पंदित लेजर के साथ एक LSM780 का उपयोग करें । विभिंन तकनीकों को उदाहरण करने के लिए, हम एक APP ट्रांसजेनिक माउस में एक वस्तु (बीटा amyloid (Aβ) पट्टिका imaged) (चित्रा 4b-ई) । Hyperspectral प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा (चित्रा 4b) पट्टिका के विभिन्न क्षेत्रों के भीतर वर्णक्रमीय बदलाव और तीव्रता भिन्नता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । फोकल माइक्रोस्कोपी में उत्तेजना स्पेक्ट्रम (चित्र 4c) बहाव प्रयोगों के लिए इष्टतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, उदा, कई fluorophores के साथ संयोजन धुंधला . इस विधि भी LCO के बंधन मोड में गठन अंतर का पता लगाने के लिए उपयोगी साबित कर सकते हैं । फोकल मोड में उत्सर्जन स्पेक्ट्रम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन गुण hFTAA से या कई fluorophores का एक संयोजन से कई LCOs या LCO और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संयोजन प्रयोगों में colocalization मूल्यांकन करने के लिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता संयोजन. hFTAA के प्रतिदीप्ति जीवनकाल hFTAA के बंधन मोड में छोटी सी भिन्नता से अत्यधिक प्रभावित है. अतएव FLIM बंधन लक्ष्य (चित्रा 4d) द्वारा hFTAA पर लगाए गए मतभेदों के बीच भेदभाव करने में एक शक्तिशाली उपकरण है । यह अलग prion उपभेदों के बीच भेदभाव में उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8। फोकल इमेजिंग और तीन आयामी छवियों में Z-स्टैक प्रसंस्करण एक amyloid सकल (चित्रा 4e) के समग्र आकार की खोज के लिए एक उपयोगी उपकरण है । फिर, अतिरिक्त fluorophores के उपयोग के एक जमा की संरचना को समझने में सहायता कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: विभिंन प्रकार के ऊतक और प्रोटीन समुच्चय दिखा रहा है एच-FTAA धुंधला: (एक) Mallory-Denk एक जिगर में केरातिन समुच्चय से मिलकर निकायों (counterstained के साथ DAPI), (ख) p62-सकारात्मक आर समावेश में छिटपुट समावेशन-बॉडी myositis (एस-आईबीएम) मांसपेशी ऊतक, (ग) मानव अग्न्याशय में टाप Amyloid पॉलीपेप्टाइड के Amyloid, (घ) मानव आंत में Amyloid लाइट चेन का Immunoglobulin, (ई) माउस मस्तिष्क में भेड़ scrapie (prions), (च ) माउस मस्तिष्क में जीर्ण अपव्यय रोग (prions), (जी) APP23 माउस मस्तिष्क में Aβ सजीले टुकड़े, (एच) APP में Aβ विकृति/PS1 माउस मस्तिष्क, और (मैं) मानव रोगियों में transthyretin amyloid के नैदानिक नमूनों से वसा बायोप्सी धब्बों ग्रेडेड 1-4 मानक कांगो लाल (सीआर) स्कोरिंग के अनुसार । पीले क्षेत्रों शो hFTAA दाग amyloid जमा और नीले वसा ऊतक से autofluorescence है । स्केल बार लंबाई प्रत्येक पैनल में निर्दिष्ट किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एंटीबॉडी के साथ सह के उदाहरण दाग. (क) विरोधी सीरम amyloid प्रोटीन ए (ए. ए.) के साथ सह-दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस और hFTAA मानव एए amyloid की एक ही धारा पर. ऊपरी बाएँ: ए. ए. एंटीबॉडी उत्सर्जन ६४० एनएम; ऊपरी दाएँ hFTAA पर ४८८ एनएम; नीचे पैनल ओवरले पीले रंग में colocalization दिखा छवि । (b) लगातार अनुभागों पर एंटीबॉडी धुंधला और hFTAA प्रतिदीप्ति । शीर्ष पैनल: ए. ए. एंटीबॉडी ढाब धुंधला, नीचे पैनल: एक longpass उत्सर्जन फिल्टर के साथ imaged hFTAA । स्केल बार: १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: है मेयर hematoxylin/कांगो लाल (ए-डी) और मेयर hematoxylin/hFTAA (ई) के साथ दाग मानव दिल में transthyretin amyloid पर कम पास फिल्टर के साथ प्रतिदीप्ति तुलना । (क) Brightfield छवि, (ख) Brightfield + प्रतिदीप्ति, (ग) Brightfield + पार किए गए ध्रुवकों, (घ) Brightfield + प्रतिदीप्ति + पार ध्रुवकों, (ङ) hFTAA प्रतिदीप्ति में ४०५एनएम + ४८० एनएम उत्तेजना (लगातार वर्गों के लिए एक-डी) । स्केल बार: १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक ही वस्तु hFTAA के साथ सना हुआ और कई तकनीकों के साथ imaged एक वृद्ध APP23 माउस में एक Aβ पट्टिका का उपयोग कर प्रदर्शन किया है । (क) hFTAA के प्रतिदीप्ति गुणों को अपने अनुगठनीय राज्य द्वारा तय किया जाता है. planar और मुड़ राज्य में hFTAA की संरचना दिखाया गया है । (ख) सतत उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के मूल्यांकन के लिए Hyperspectral इमेजिंग । स्पेक्ट्रा निचले पैनल में रंग कोडित रहे हैं छवि में रुचि के बॉक्स्ड क्षेत्रों के अनुसार. (ग) (i) उत्तेजना इमेजिंग के लिए फोकल इमेजिंग और (ii और iii) फ़िल्टर मोड या (iv) वर्णक्रमीय मोड में स्पेक्ट्रम और उत्सर्जन इमेजिंग । (घ) amyloid में, जहां छोटे जंमों Aβ पट्टिका की परिधि में पाए जाते है और जीवन समय पट्टिका के केंद्र में लंबे होते है में गठन के अंतर का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग । निचले फलक में हिस्टोग्राम संपूर्ण पट्टिका के लिए जीवन काल का वितरण दिखाता है । छवि हिस्टोग्राम नीचे पैमाने के अनुसार रंग का है । (e) फोकल Z-स्टैक को ऑब्जेक्ट्स की त्रि-आयामी संरचना प्रदर्शित करने के लिए फ़िल्टर मोड में संग्रहीत किया जाता है । स्केल बार लंबाई प्रत्येक पैनल में निर्दिष्ट किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

amyloid में aberrantly तह प्रोटीन का जमाव कई रोग प्रक्रियाओं की एक महत्वपूर्ण घटना है । neurofibrillary तौ द्वारा गठित Aβ पेप्टाइड्स और intracellular hyperphosphorylated पेचीदाों से बना Extracellular amyloid सजीले टुकड़े अल्जाइमर रोग रोगियों के मस्तिष्क में पाए जाते हैं. विभिंन प्रोटीन की एक श्रृंखला है, जैसे, transthyretin (TTR), सीरम Amyloid एक घटक (साे), और आईजीजी प्रकाश श्रृंखला प्रकट और सीएनएस के बाहर ऊतकों में Amyloid जमा के रूप में प्रकट । हालांकि amyloid जमा ज्ञात किया गया है और एक सदी से अधिक के लिए अध्ययन, हम अभी भी कैसे amyloid साठा आणविक स्तर पर शुरू की है और क्या इस प्रक्रिया को रोकने के लिए किया जा सकता है की विस्तृत जानकारी का अभाव है । अल्जाइमर रोग के लिए यह पुष्टि करना आवश्यक है कि amyloidosis की प्रक्रिया neurodegeneration से कैसे जुड़ी है । मिशन पर एक महत्वपूर्ण खोज amyloidosis के इलाज के लिए उपंयास ठीक amyloid दीक्षा, प्रगति, और प्रतिगमन की निगरानी के लिए देखते उपकरण विकसित करना है; इसलिए लक्षित amyloid डिटेक्शन कुंजी है । लंबे समय में, नैदानिक निदान संवेदनशीलता और amyloid धुंधला तरीकों7,15के selectivity बढ़ाने से लाभ होगा । इस संबंध में वर्तमान चुनौतियां जबरदस्त हैं और यह एक बहुत ही सक्रिय अनुसंधान क्षेत्र है । नैदानिक विकास और परीक्षणों के लिए एक मुख्य मुद्दा शकुन निदान है । इन रोगों की संभावना अच्छी तरह से शुरू होने से पहले लक्षण दिखाई देते हैं, लेकिन उपचार के साथ शुरू करने के लिए रोग की पहचान की जरूरत है । यहां, संवेदनशीलता उपंयास के तरीके के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू है । इसके अलावा, इस मुद्दे को और भी अधिक जटिल है क्योंकि कुछ प्रोटीन समुच्चय विषाक्त कर रहे हैं, कुछ सुरक्षात्मक हैं, और कुछ तटस्थ हैं । इसलिए विशिष्ट एकत्रित morphotypes की निगरानी करने की क्षमता आवश्यक है क्योंकि विशिष्ट एकत्रित प्रजातियों के अस्तित्व को neurodegenerative प्रोटीन एकत्रीकरण रोगों की विविधता के लिए विषम phenotype को समझाने का सुझाव दिया गया है । उदाहरण के लिए, prion प्रोटीन के एक क्लासिक उदाहरण कैसे एमिनो एसिड की एक समान प्राथमिक अनुक्रम विशिष्ट समग्र morphotypes, जो विशेष prion उपभेदों को जंम दे में प्रकट कर सकते हैं । इसी तरह बहुरूपता के Aβ पेप्टाइड, α-synuclein, और ताऊ के लिए भी रिपोर्ट दी गई है । इस संबंध में, LCOs विशिष्ट एग्रीगेट morphotypes के ऑप्टिकल असाइनमेंट के लिए उत्कृष्ट उपकरण होने के लिए दिखाया गया है । Prion-तनाव विशेष प्रोटीन समुच्चय, प्रणालीगत amyloidosis के कई प्रकार में पाया प्रोटीन जमा, साथ ही साथ बहुरूपी Aβ और ताऊ समुच्चय LCOs से मनाया गया है, के रूप में गठन प्रेरित ऑप्टिकल घटना के कारण प्रतिष्ठित किया गया है ।

Amyloid जमाव एक घटना है कि ऊतकों कि जैव रासायनिक या आणविक परिशुद्धता के भौतिक तरीकों के साथ घुसना मुश्किल है में जगह लेता है । इस संभावना की घटनाओं की जांच करने के लिए विवो, vivo में, और एक ही LCO अणुओं का उपयोग कर इन विट्रो में घटनाओं है कि केवल पूर्व vivo या में लागू करने के लिए संभव है कि तकनीक का उपयोग vivo में हो सकता है के लिए मंच सेट करता है इन विट्रो नमूने11,17. एक हाल ही में रिपोर्ट उच्च संकल्प संरचनात्मक मॉडल से पता चलता है कि LCO pentameric FTAA (pFTAA) एक फाइब्रिल में फैले अक्ष के साथ गठबंधन पक्ष श्रृंखला समानांतर द्वारा गठित गुहा में बांधों समानांतर बीटा-किस्में18, प्रदर्शन है कि यह है LCO लक्ष्य की संस्थाओं के बारे में परमाणु संकल्प ज्ञान प्राप्त करने के लिए संभव. संक्षेप में बाध्यकारी गुहा और pFTAA के बंधन मोड कांगो लाल19के समान है, एक दोहराए सकारात्मक आरोप लगाया Lys पक्ष चेन के साथ लाइन में खड़ा नाली द्वारा तय की । LCOs के संबंध बेहतर कांगो लाल की तुलना में श्रृंखला लचीलापन और मजबूत वान डेर Waals hydrophobic गुहा की ओर thiophene छल्ले के सल्फर परमाणुओं की बातचीत की वजह से दिखाई देते हैं । prefibrillar प्रजातियों का पता लगाने (थट जवाब से पहले)5,20 दोहराव β चादरें, में से बना के पर निर्भर प्रतीत होता है-रजिस्टर समानांतर बीटा-किस्में, जो hFTAA जा रहा है दो thiophene इकाइयों pFTAA से अधिक होने के लिए तक 8 बीटा-किस्में के पार स्पैन ।

दाग प्रोटोकॉल के लिए मुसीबत निंनलिखित चरणों में शूटिंग पर ध्यान देने की आवश्यकता है: (i) निर्धारण: ऊतक नमूनों की व्यापक निर्धारण amyloid संरचना को बाधित कर सकते है और संभावना को सीमित प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा में भिंनता का पता लगाने के द्वारा प्रेरित hFTAA अणु के गठन विकृति । ताजा जमे हुए सामग्री से cryosections के हल्के निर्धारण इष्टतम वर्णक्रमीय संकल्प को प्राप्त करने के लिए पसंद है । हालांकि, hFTAA दाग और निश्चित ऊतक में fluoresce amyloid लेकिन कम प्रभावकारिता और कम वर्णक्रमीय भिंनता के साथ होगा । (ii) Epitope एक्सपोजर: एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए Epitope एक्सपोज़र प्राप्त करने के लिए ऊतक का पूर्व-उपचार कभी-कभार बाधित amyloid संरचना के कारण बाइंड करने के लिए hFTAA के लिए क्षमता को कम कर सकता है । यदि यह एक मुद्दा है, और epitope जोखिम एंटीबॉडी दाग प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है, एंटीबॉडी और hFTAA के लिए लगातार वर्गों का उपयोग कर, क्रमशः माना जा सकता है । (iii) दाग: hFTAA बेहद संवेदनशील है । काम समाधान कम एनएम एकाग्रता पर रखा जाना चाहिए । hFTAA की एकाग्रता घटाएं अगर पृष्ठभूमि धुंधला एक समस्या है । यदि तत्व है कि बांध hFTAA ऊतक में विरल हैं, hFTAA के एक अतिरिक्त कर सकते है और समग्र बढ़ते माध्यम में जमा । यह प्रतिदीप्ति के रूप में मांयता प्राप्त है कि ऊतक ही के फोकस विमान में नहीं है । यदि यह प्रतीत होता है, पंजाब में घुड़सवार स्लाइड विसर्जित जब तक कवर पर्ची अनुभाग के गिरावट हो सकती है, पंजाबियों के साथ धो सकते हैं, और ताजा बढ़ते मध्यम और एक नया कवर स्लिप के साथ remount । (iv) फिल्टर आधारित इमेजिंग: इस कागज का वर्णन ज्यादातर वर्णक्रमीय हल प्रतिदीप्ति इमेजिंग लंबे पास फिल्टर या एकाधिक डिटेक्शन चैनलों का उपयोग कर । hFTAA भी शॉर्ट पास फिल्टर का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है । कृपया ध्यान रखें कि यह इसके विपरीत कम हो जाएगा और कई रंगों का पता लगाने के लिए संभावनाओं को समाप्त होगा ।

पिछले वर्षों में यह स्पष्ट हो गया है कि अनुसंधान उपकरण के रूप में, फ्लोरोसेंट LCOs और विशेष रूप से hFTAA उच्च आशाजनक गुण दिखाते हैं । परिणाम प्रोटीन और रोग राज्यों की एक विशाल विविधता के लिए प्रदर्शन किया गया है, कोशिकाओं के अंदर समुच्चय का hFTAA पता लगाने से लेकर (ताऊ, शामिल शरीर myositis), सीरम amyloid के प्रणालीगत amyloid एक, transthyretin, Immunoglobulin प्रकाश जंजीरों (कापा और लैंब्डा) seminogelin 1, prion प्रोटीन (नैदानिक नमूनों सहित)21, टाप amyloid पॉलीपेप्टाइड, और इंसुलिन7,15. एक नैदानिक उपकरण के रूप में hFTAA के कार्यांवयन के लिए एक सीमित कारक यह है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी नियमित amyloid पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर प्रयोग नहीं किया जाता है । इसके अलावा, अपने क्लिनिक में आसानी से उपलब्ध नहीं है । हालांकि, hFTAA amyloid धुंधला और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक फिल्टर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में नैदानिक प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है और चाहिएएक मानार्थ नैदानिक पद्धति के रूप में माना जाता है । यह हाल ही में एक स्वचालित फैशन में प्रतिदीप्ति के लिए बुनियादी सेटिंग्स का उपयोग कर amyloidosis transthyretin के साथ कार्प सुरंग बायोप्सी पर प्रदर्शन किया गया था22।

इसके अलावा, विभिंन प्रोटीन के अतिरिक्त, hFTAA प्रतिदीप्ति फाइब्रिल प्रकार और पूर्व fibrillar amyloid समुच्चय की एक विशाल विविधता को पहचानता है, उदा, मार्ग fibrillar प्रजातियों का पता लगाया गया है और विशेषता है । इस प्रकाशन में, हम तीन सूक्ष्म तकनीकों का उपयोग विभिंन प्रकार के नमूने पर एक LCO का प्रदर्शन किया है । नियंत्रित संश्लेषण के उपयोग के लिए भी LCOs के विकास के लिए अनुमति दी गई है, जो आणविक लक्ष्य के बहुमुखी पता लगाने के लिए, उदा, पोजीट्रान उत्सर्जन के लिए सतह plasmon अनुनाद (SPR)23 और radiolabeling द्वारा बातचीत की रिकॉर्डिंग टोमोग्राफी (पीईटी)24।

तिथि करने के लिए, 25 से अधिक विभिंन LCOs के साथ प्रकाशित किया गया है । amyloid जमा की इमेजिंग के लिए LCOs का एक बढ़ा उपयोग ज्ञान और कैसे इन रोग-जुड़े समुच्चय इकट्ठा, जुदा, और अंगों और व्यक्तियों जिसमें वे रहते है के साथ हस्तक्षेप की समझ में वृद्धि होगी ।

Disclosures

पीएच PN एमबी SN Ebba बायोटेक में मामूली शेयरधारक है जो ब्रांड नाम Amytracker545 के तहत hFTAA का व्यावसायीकरण करते हैं ।

Acknowledgments

लेखकों ने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर सलाह के लिए Mikael Lindgren और चानन Sluzny को धन्यवाद देने की इच्छा जताई और एड्रियानो Aguzzi, जोहन Bijzet, Bouke Hazenberg, फ्रैंक Heppner, माथियास Jucker, Therese Klingstedt, करीन Magnusson, क्रिस्टीना Sigurdson, डेनियल Sjölander, क्रिस्टोफ Röcken, Gunilla Westermark, प्रति Westermark, और कर्ट Zatloukal योगदान ऊतक वर्गों या इस प्रकाशन में प्रदर्शित माइक्रोग्राफ के लिए । प्रस्तुत डेटा के संग्रह के साथ साथ स्वीडिश ब्रेन फाउंडेशन (Hjärnfonden), स्वीडिश अल्जाइमर एसोसिएशन (Alzheimerfonden), स्वीडिश अनुसंधान परिषद (वी. आर.), Göran Gustafsson एसोसिएशन, Georg & #38 से योगदान द्वारा वित्त पोषित किया गया है; Astrid Olsson, यूरोपीय संघ FP7 स्वास्थ्य परियोजना लुपस, और Linköping विश्वविद्यालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hFTAA/Amytracker545 Ebba Biotech
Dako fluorescene mounting medium Agilent technologies GM304
LeicaDM6000 Leica
Lumen 200 Prior
Spectraview system ASI spectral imaging
Spectraview software ASI spectral imaging
LSM780 Zeiss
Zen 2010b v6.0 software Zeiss
FLIM system Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514 Zeiss
Tunable Laser In Tune Zeiss

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References

  1. Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
  2. Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
  3. Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
  4. Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
  5. Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
  6. Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
  7. Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
  8. Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
  9. Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
  10. Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
  11. Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
  12. Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
  13. Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
  14. Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
  15. Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
  16. Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
  17. Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
  18. Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
  19. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
  20. Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
  21. CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
  22. Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
  23. Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
  24. Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).

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जैव रसायन अंक १२८ Amyloid hyperspectral इमेजिंग फोकल इमेजिंग प्रतिदीप्ति लाइफ टाइम इमेजिंग luminescent संयुग्मित oligothiophenes प्रोटोकॉल ।
इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग
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Nyström, S., Bäck, M., Nilsson, K. P. R., Hammarström, P. Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56279, doi:10.3791/56279 (2017).

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