Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In Vitro og i Vivo oppdagelse av Mitophagy i menneskelige celler, C. Elegansog mus

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56301
Automatic Translation
1,6, 2, 3, 1, 4, 1, 1, 1, 5, 6, 2,7, 5, 6, 1,8
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

Summary

Mitophagy, prosessen med å fjerne skadet mitokondrier, er nødvendig for mitokondrie homeostase og helse vedlikehold. Denne artikkelen presenterer noen av de nyeste mitophagy gjenkjenningsmetoder i menneskelige celler, Caenorhabditis elegansog mus.

Abstract

Mitokondrier er kraftstasjoner celler og produserer cellular energi i form av ATP. Mitokondrielt dysfunksjon bidrar til biologisk aldring og en rekke lidelser inkludert metabolske sykdommer, tidlig aldring syndromer og nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD) og Parkinsons sykdom (PD). Vedlikehold av mitokondrie helse avhenger av mitokondrie biogenesis og effektiv rydding av dysfunksjonelle mitokondriene gjennom mitophagy. Eksperimentelle metoder for å nøyaktig oppdage autophagy/mitophagy, spesielt i dyremodeller, har vært utfordrende for å utvikle. Framskritt mot forståelsen av molekylære mekanismer av mitophagy har aktivert utviklingen av romanen mitophagy teknikker. Her introduserer vi flere allsidig teknikker for å overvåke mitophagy i menneskelige celler, Caenorhabditis elegans (f.eksRosella og DCT-1 / LGG-1 stammer), og mus (mt-Keima). En kombinasjon av disse mitophagy teknikker, inkludert cross-species evaluering, vil forbedre nøyaktigheten av mitophagy mål og føre til en bedre forståelse av rollen mitophagy i helse og sykdom.

Introduction

Mitophagy er viktig for mitokondrie vedlikehold. Mitokondrier overlappe flere celle signalnettverk trasé og er universell sub mobilnettet organelles ansvarlig for cellular energiproduksjon, celle metabolisme og kalsium homeostase1,2,3, 4. mitokondrier stadig oppleve utfordringer fra endogene og eksogene kilder, for eksempel reaktive oksygen arter (ROS) og mitokondrie giftstoffer, henholdsvis som føre til generering av "eldre" og dysfunksjonelle mitokondriene. Akkumulering av skadet mitokondrier reduserer effektiviteten i ATP produksjon mens økende mengden av skadelige ROS, og har vært knyttet til alder-relaterte sykdommer som metabolske sykdommer, annonse, og PD1,5,6 . For å hindre mitokondrier indusert mobilnettet dysfunction, kalt cellene, må spesifikt gjenkjenne skadet mitokondrier og effektivt fjerne dem gjennom en mobilnettet mitokondrie autophagy (mitophagy). Dette demonstrerte betydningen av mitophagy i helse og sykdom illustrerer behovet for nøyaktige og effektive metoder for å oppdage mitophagy både i vitro og i vivo.

Mitophagy er en flertrinns prosess som involverer mange proteiner og protein komplekser5,7,8. I korte trekk en skadet mitokondrie først gjenkjennes og omsluttet av en dobbel-membraned phagophore, som kan stammer fra plasma membran, endoplasmatiske retikulum, Golgi komplekset, kjernen eller mitokondrie selv9,10. Sfærisk phagophore elongates og til slutt sel mitokondrier inne, utgjør den mitokondrie autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome deretter sikringer med lysosome til fornedrelse, danner en autolysosome der skadet mitokondrie er degradert og resirkulert7,8. Store autophagic proteiner også involvert i mitophagy inkluderer: Autophagy relaterte 7 (ATG7) og Beclin1 (initiering), Microtubule-Associated Protein 1A/1B-lys kjeden 3 (LC3-II) (LGG-1 i C. elegans) og p62 (komponenter av phagophore), og lysosomale-assosiert membran glykoprotein 2 (LAMP2)6,7. I tillegg er det flere essensielle proteiner unike for mitophagy, inkludert PTEN-indusert antatte Kinase 1 (rosa-1), Parkin1, kjernefysiske Dot Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 samspill Protein 3 som (NIX/BNIP3L) (DCT-1 i C. elegans), blant andre5,6,11.

En vanlig metode å oppdage endringer i nivåer av autophagy er av forholdet mellom LC3-II/LC3-I eller LC3-II/utgangen. Men er denne metoden uspesifikke, som en økning i dette forholdet kan gjenspeile en økt innvielse eller en svekket fusjon av mitophagosome til lysosome12. En annen metode er å evaluere colocalization mellom en autophagy markør (f.eksLC3) og en mitokondrie protein (f.eksTranslocase av ytre mitokondrie membran 20 (TOMM20, som kan reduseres ved proteasomes)). Men dette kan bare angi endringer i totalt mitophagy nivåer og ikke kan skille fremgangsmåten som blokkering oppstår. Dette kan bli avklart ved hjelp av lysosomale hemmere (f.eksE64d + Pepstatin A, kalt EP) parallelt til Oppsamling av mitophagosomes. Forskjellen mellom antall mitophagosomes ved baseline og antall mitophagosomes etter behandling med EP kan indikere mitophagy. Disse begrensningene har bedt om utviklingen av romanen mitophagy teknikker. I lys av økende relevansen av mitophagy i et bredt spekter av menneskelige sykdommer presenterer vi flere robust mitophagy teknikker som kan være nyttig for forskerne. Vi dekker både i vitro og vivo teknikker og anbefaler kombinere flere teknikker for å bekrefte endringene i mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr (mannlige og kvinnelige mus) var født og oppvokst i en akkreditert dyr anlegget, samsvar og godkjenning av NIH Animal Care og bruk komiteen. Eutanasi metoder må være forenlig med alle nasjonale og institu forskrifter.

1. påvisning av Mitophagy i menneskeceller

  1. Deteksjon av mitophagy ved hjelp av mt-Keima plasmider
    Merk: Keima protein, smeltet en mitokondrier målet signalet, forenklet som mt-Keima, har vist seg nyttig for i vivo mitophagy deteksjon. MT-Keima er et ratiometric pH-sensitive fluorescerende protein som viser grønne fluorescens (eksitasjon 458 nm) i grunnleggende eller nøytral forhold og røde fluorescens (eksitasjon 561 nm) i Sure forhold. Sunn mitokondrier trives i grunnleggende eller nøytral betingelser (pH 7-8), og angis med grønn fluorescens når transfekterte med mt-Keima. Når mitokondrier gjennomgå mitophagy og sikring med surt lysosomer, pH drops til 4.5 og mitokondrier inneholder mt-Keima utstillingen røde fluorescens6,13,14. Viktigere, er mt-Keima motstandsdyktig mot lysosomale proteaser, aktivere evaluering av mitophagy over lengre perioder. Protokollen nedenfor er utformet for 6-og plater.
    1. Dag 1: Bruke primære menneskelige celler (f.eks, fibroblaster) eller udødeliggjort menneskelige celler (f.eks, Hela celler eller U2OS). Frø ca 0,3-1 × 106 celler/vel (avhengig av veksttakten cellen å tillate celler til 70% confluency neste dag) i en 6-vel plate. Opprettholde cellene i fullstendig celle kultur medium (Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) medium med 10% FBS og 1% blandet løsning av penicillin-streptomycin), og Inkuber i en celle kultur inkubator på 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Legg 1 mL komplett celle kultur medium/godt i en 6-vel plate.
      Merk: Gene overuttrykte/knockdown eller narkotika behandlinger kan gjøres på denne trinn6.
    2. Dag 2: Bland mt-Keima plasmider DNA6 og DNA transfection reagens (blandingen for en godt av en 6-vel plate).
      1. Fortynne 15 µL av en DNA transfection reagens med 150 µL av serum-free medium i henhold til produsentens protokollen.
      2. Fortynne 2-5 µg av mt-Keima plasmider DNA med 150 µL av serum-free medium.
      3. Legge til utvannet mt-Keima plasmider utvannet DNA transfection reagens, vortex for 10 s, og Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
        Merk: Optimalisering av DNA transfection forhold kan være nødvendig avhengig plate (se produsentens protokoller for detaljer).
      4. Legg DNA/transfection reagens blanding dropwise celler, og rist platene forsiktig i 5-10 s til løsningen er helt blandet.
    3. Dag 3: Endre media ved å erstatte DNA transfection reagens som inneholder mediet med fersk komplett celle kultur medium (1 mL/vel).
    4. Dag 4: Image cellene bruker AC confocal mikroskopi6. Bruk to tenkelig kanaler: grønne kanalen (eksitasjon 458 nm, utslipp 570-695 nm) å visualisere normal mitokondrier og røde kanalen (eksitasjon 561 nm, utslipp 570-695 nm) å visualisere mitokondrier som er under mitophagy. Tilfeldig bilde 20 områder under 40 x forstørrelse å dekke totalt 100-200 celler i hver brønn.
    5. Analysere data. Beregne "mitophagy indeksen" (prosentandel av mitokondrier under mitophagy), ved hjelp av analyseprogramvare for å kvantifisere mengden fluorescens i både rødt og grønt kanaler: ta forholdet mellom røde fluorescens til rød + grønn fluorescens, og multiplisere med 1006.
      Merk: Alternativer til hva inkluderer bruk av mt-Keima stabilt uttrykt HeLa cellen linjer14. Siden HeLa celler ikke uttrykke Parkin, må Parkin uttrykkes stabilt for å studere Parkin-avhengige mitophagy i denne cellen linje.
  2. Deteksjon av mitophagy med colocalization mellom Cytochrome C oksidase delenhet II (COXII) og LAMP2
    Merk: COXII er et protein som mitokondrie genomet-kodet indre membran. "Mitophagy indeksen" tilsvarer forholdet mellom COXII colocalized med LAMP2 uttrykt som en prosentandel av den totale mengden COXII.
    1. Frø HeLa cellene (eller andre celler av interesse er nevnt i trinn 1.1.1) i en 4-vel kammer lysbilde (1-5 × 104 celler i 1 mL komplett celle kultur medium/godt) i en celle kultur inkubator på 37 ° C (20% O2, 5% CO2) over natten.
    2. Legg 3.0 µL av 10 mM karbonyl cyanide - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) og ruge i celle kultur inkubator (trinn 1.2.1) 3 h.
      Merk: Andre stoffer påvirker mitophagy kan brukes.
    3. Fjerne kultur mediet bruker en 1 mL pipette, vaske cellene to ganger med 1 mL/vel av kaldt (0-4 ° C) 1 x PBS. La løsningen sitte i 10-30 s før neste vask. Deretter legger 0,5 mL 3,7% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS hver brønn og ruge i 10 min på is å fikse cellene.
      Forsiktig: PFA er gift. Innarbeide avtrekksvifte ved PFA.
    4. Forkaste PFA løsning ved hjelp av en 1 mL pipette, vask cellene to ganger med kaldt 1 X PBS (1 mL/bra; la løsning sitte i 10 før neste vask), og permeabilize cellene med 1 mL/vel av 0,25% vaskemiddel (i 1 x PBS) i 10 min på is.
    5. Forkaste permeabilizing bufferen, forsiktig vaske cellene to ganger med kaldt 1 x PBS og Forkast (la løsningen sitte i 10 s mellom vasker). Blokkere cellene med 1 mL/godt på 5% FBS i 1 x PBS overnatting på 4 ° C. Dekk kamrene for å hindre tap av fuktighet.
    6. Forberede 0,5 mL/godt av en blandet antistoff løsning med COXII antistoff (mus, 1:250 fortynning) og LAMP2 antistoff (kanin, 1:20-1:50 fortynning) i 1 x PBS med 5% FBS, og butikken på is 0,5-1 h.
    7. Ta ut 4-vel kammer lysbildet fra kalde rommet og kast den blokkerende løsningen med en 1 mL pipette. Forsiktig vaske cellene to ganger med 1 mL/vel av kaldt 1 x PBS og Forkast (la løsningen sitte i 10 s mellom vasker), deretter Legg til 0,5 mL/godt blandet antistoff løsning. Inkuber ved 37 ° C i 1 time i en shaker ved lav hastighet.
    8. Kaste den første antistoff løsningen ved hjelp av en 1 mL pipette og forsiktig vaske cellene tre ganger med 1 mL/vel av kaldt 1 x PBS og kast. La løsningen sitter på 10 før neste vask. Legge 1 mL/godt av fluorescerende sekundære antistoffer (f.eks, geit anti-kanin med bølgelengde 568 nm røde fluorescerende protein (RFP) for LAMP2, og geit anti-mus med bølgelengde 488 nm grønne fluorescerende protein (GFP) for COXII) i 1:250 fortynning med 5% FBS i 1 x PBS. Dekker 4-vel kammer lysbildet med aluminiumsfolie og ruge ved 37 ° C i 1 time i en shaker ved lav hastighet.
    9. Kast den andre antistoff løsningen med en 1 mL pipette. Forsiktig vaske cellene seks ganger med 1 mL/vel av kaldt 1 x PBS. La løsningen sitte i 1 min før neste vask.
    10. Montere cellene med 50 µL/godt av antifade montering medium med DAPI, og Legg cover slips.
    11. Bilde cellene under et AC confocal mikroskop med 66 x forstørrelse og innlevelse olje (fliser skanner / mosaikk kan brukes til å øke antall celler fotografert av programvaren). Bruke de samme innstillingene som kanal eksponeringstid, digital fortjene, digital forskyvning, etc. gjennom alt tenkelig prosesser (se programvareinstruksjoner for detaljer)15.
    12. Bruk colocalization analyse å analysere kvantitativt minst 20 tilfeldige bilder av 100 celler15. Bruk funksjonen "Lukket Bezier" for å velge hele enkeltceller. Sammenligne Pearson's colocalization koeffisient av GFP til RFP, vektet eller unweighted, til å bestemme mitophagy nivåer i analysert celler. Opprettholde verdier for vannrette og loddrette trådkorset av colocalization analyseprogramvare gjennom analyse. Nøyaktig angi disse trådkorset, forberede to ekstra sett av celler og merke en COXII og den andre LAMP2. Angir deretter trådkorset rett over pixel distribusjonen for hver kanal15 (se programvareinstruksjoner for detaljer).
  3. En høy gjennomstrømning imaging mål for mitophagy screening
    Merk: Utfører høy gjennomstrømning skjermer mitophagy-inducing eller mitophagy-hemmende forbindelser fra store sammensatte biblioteker er teknisk krevende. En tenkelig teknikk basert på colocalization av mitokondrier med autophagosomes er en mer enkle, men svært følsom alternativ for mitophagy screening16.
    1. Dag 1: Frø celler (f.eks, menneskelig primære fibroblaster på 5000 celler/100 mL celle kultur medier/godt) i en 96-brønns plate (se trinn 1.1.1).
    2. Dag 2: Behandle cellene fra den andre dagen med FCCP eller andre forbindelser av interesse for angitte inkubasjonstiden (se trinn 1.2.2).
    3. Følg trinn 1.2.2-1.2.9 bruke primære antistoffer for COXII (mus, 1:250 fortynning med 5% FBS i 1 x PBS) og LC3B (kanin, 1: 100-1:200 fortynning med 5% FBS i 1 x PBS). Alternativt kan primære antistoffer for COXII og LAMP2 brukes.
    4. Bilde cellene med et fluorescerende leser16. Samle bilder i tilfeldig plassert felt og med et minimum 500 celler/godt.
    5. Analysere data ved hjelp av en celle analyzer tilpasset protokoll16.

2. registrering av Mitophagy i C. elegans

Merk: Rundormer C. elegans gir en plattform for å analysen mitophagy på organismebiologi nivå. To stammer kan brukes til å overvåke mitophagy: (1) mitokondrier målrettede Rosella (mtRosella) eller (2) mitophagy reseptor DCT-1 smeltet sammen med GFP sammen med autophagosomal markør LGG-1 smeltet sammen med Discosoma sp. røde fluorescerende protein (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy overvåking bruker Rosella biosensor
    Merk: Rosella er en molekylær biosensor som kombinerer en pH-ufølsom DsRed smeltet på en pH-sensitive GFP variant. Rosella biosensor utnytter pH forskjellene mellom den sure lysosome (pH ~ 4.5) og andre cellulære avdelinger. Denne biosensor har blitt brukt med hell overvåke mitophagy i Saccharomyces cerevisiae og flere pattedyr cellelinjer, som jakten, HEK293 og HCT11618,19. Vi har tilpasset denne allsidige dual-fluorescerende reporter og generert transgene C. elegans nematoder uttrykke mitokondrier målrettede Rosella (mtRosella) i kroppen-vegg muskelceller. Mitophagy induksjon angis av redusert GFP/DsRed forholdet mtRosella fluorescens.
    1. Dag 1: Plukke L4 larver av ormer uttrykke mitokondrier målrettede Rosella (mtRosella) i kroppen-vegg muskelceller på en Rundormer vekst medier (NGM) plate plantet med E. coli (OP50) bruker en disseksjon mikroskop5. Plass 10-20 ormer/plate på minst tre 3,5 cm plater. Inkuber nematoder ved standard temperatur på 20 ° C-5.
      Merk: Se referanse for ormen anatomien, inkludert identifikasjon av L4 Larvene20og måten å lage en hakke som brukes til å overføre ormer fra ett sted til et annet21.
    2. Dag 5: Synkronisere nematoder ved å velge 15-20 L4 transgene larver og overføre dem på fersk OP50 seeded NGM plate. Bruk minst fem plater per eksperimentelle tilstand.
    3. Dag 7: Forberede kjøretøy plater mitophagy-påvirker narkotika severdigheter eller positiv kontroller.
      1. Drepe E. coli (OP50) bakterier seeded ved å utsette NGM plater i 15 min med 222 µW/cm2 (intensitet) av UV-lyset slik at mitophagy-inducing forbindelser ikke metaboliseres av bakterier. Platene må utsettes med 2000 J/m2.
        Merk: Sekunder eksponering nødvendig = 2000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Legge til compound(s) rundt toppen av seeded NGM plater. Legge til en tilsvarende mengde sammensatte kjøretøy (løsemiddelet brukes å oppløse sammensatte, for eksempel dimethyl sulfoxide (DMSO)) kjøretøy platene som en negativ kontroll. For positive kontroll av mitophagy induksjon, en mitokondrie toxicant, ble paraquat (8 mM endelige konsentrasjon) brukt. Legge til en løsning som inneholder 10 µL av 8 M paraquat lager med 190 µL ddH2O på agar platen i behandling gruppen. Legge til en løsning som inneholder 10 µL av DMSO med 190 µL ddH2O på toppen av agar platen gruppen kjøretøy.
        Merk: Paraquat arbeidende løsningen kan bli holdt for 1 måned på 4 ° C.
      3. Swirl forsiktig platene til stoffet eller kjøretøy strøk hele overflaten. La platene tørke med lokkene på plass ved romtemperatur for minst 1 time før du overfører ormer.
        Merk: Narkotika plater kan også tilberedes ved å legge narkotika i den flytende NGM før det stivner.
    4. Dag 7: Overføre 10-20 av 2 dager gamle voksen transgene dyr i trinn 2.1.2 til plater som inneholder enten paraquat, compound(s) severdigheter, eller kjøretøy (DMSO). Inkuber transgene dyrene på 20 ° C i 2 dager.
    5. Dag 9: Forberede 2% agarose pads (se Tilleggsmateriale). Deretter legge til en dråpe (10 µL) av 20 mM levamisole i M9 per pute. Nakkens transgene dyr bildebehandling, ved å plassere dem i M9-levamisole fall. Forsiktig plassere en dekkglassvæske på toppen.
    6. Fange enkelt transgene dyr med et kamera festet til en epifluorescence mikroskop. Erverve fluorescerende bilder av hele transgene nematoder uttrykke mtRosella i kroppen-vegg muskelceller på 10 X forstørrelse5. Lagre samlet bildene.
    7. Behandle ervervet bildene med ImageJ programvare. Analysere kroppen veggen muskelceller ligger i hodet av å unngå autofluorescence i tarmen tissue. Måle gjennomsnittlig pixel intensitet og total området for hver fluorescerende bildet bare av regionen hodet av hvert dyr. Analysere bestemt område av interesse:
      1. Velg "dele kanal" under 'bilde' og 'farge' drop-down menyen å konvertere bilder.
      2. Bruke 'Frihånd utvalg' verktøyet å fange fluorescerende området av interesse.
      3. Velg kommandoen 'mål' under rullegardinmenyen "analysere" og utføre pixel intensitet analyse.
      4. Pixel intensitet skal normaliseres ved intensitet av det totale området analysert. Ved normalisering, beregne GFP DsRed forholdet22.
    8. Bruke statistisk analyse programvare enten utføre student t-test (sammenligningen mellom to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellom flere grupper) for statistisk analyse med p < 0,05 betydelig5,17 .
  2. Vurdere mitophagy bruker co lokalisering mellom DCT-1 og LGG-1
    Merk: DCT-1 er en ytre mitokondrie membran protein som fungerer som en mitophagy reseptor som svar på stress forhold, ligner på sin antatte orthologues BNIP3 og NIX/BNIP3L i pattedyr5. Derfor vurderes mitophagy innvielsen av co lokalisering mellom DCT-1 mitophagy reseptor og autophagosomal membran protein LGG-1 (homolog av pattedyr LC3).
    1. Dag 1: Plukke L4 larver av transgene dyr uttrykke både DCT-1::GFP og DsRed::LGG-1 i kroppen-vegg muskel celler5 på en OP50 seeded NGM plate. Plasser 5-10 ormer/3.5 cm plate, og bruke minst tre plater. Inkuber nematoder på 20 ° C.
      Merk: De effekter av transgener er plassert på separate plasmider og de er ikke integrert i genomet. Plukke opp nematoder bærer markører for både rol-6(su1006) og pmyo-2 -GFP contransformation. Bare uttrykke transgene ormer med begge contransformation merkene både DCT-1::GFP og DsRed::LGG-1 i kroppen-vegg muskelceller.
    2. Fremgangsmåten fra 2.1.2-2.1.5.
    3. Bildet enkelt kroppen-vegg muskelceller ved hjelp av et kamera festet til en AC confocal mikroskop5,23. Oppdage grensene til hele kroppen-vegg muskelceller og ta z stabel bilder under 63 x forstørrelse. Høyere forstørrelse kan også brukes.
    4. Åpne og behandle bilder kjøpt med AC confocal programvaren. Initiering av mitophagy angis av co lokalisering av mitophagy reseptoren (DCT-1::GFP) til autophagosomal merket (DsRed::LGG-1). Manuelt måle co lokalisering hendelser i hver bunke av kroppen-vegg muskel celle5. Det er viktig å holde alle mikroskop og kameraet innstillinger (linsen og Forstørrelsesprogram, filtre, eksponeringstid, oppløsning, laser intensitet, gevinst, etc.) konsekvent eksperimenter. Alle innstillinger bør bemerkes.
    5. Bruke statistisk analyse programvare enten utføre student t-test (sammenligningen mellom to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellom flere grupper) for statistisk analyse med p < 0,05 betydelig5,17 . Toveis sammenligninger bruke Student t-test (p < 0,05 regnes betydelig). Bruk enkelt faktor (ANOVA) avvik analysen, korrigert av post hoc Bonferroni testen for flere sammenligninger. Vi anbefaler analyserer minst 50-70 dyr eller 30-50 kroppen-vegg muskelceller for hver eksperimentelle betingelse. Gjenta eksperimentet minst tre ganger.

3. påvisning av Mitophagy i mus

Merk: Tidligere metoder å oppdage mitophagy i mus var tungvint, ufølsom og vanskelig å kvantifisere. En transgene musemodell uttrykke mitokondrie målrettede form av lysrør reporteren Keima kan (mt-Keima) nå brukes til å måle graden av mitophagy i en rekke fysiologiske og patofysiologiske forhold.

  1. Euthanize mus bruker en protokoll som er godkjent av de institusjonelle Animal Care og bruk Committee14.
  2. Sikre musa (ventral side opp) arbeider-plattformen med pinner i beina. Gjør et snitt i nedre del av magen bruker mikrokirurgi saks og tang for å avsløre de lever24. Skjære et stykke av leveren (f.eks, et stykke høyre flik på 1 × 1 × 1 cm) bruker mikrokirurgi saks og tang.
    Merk: Gjenkjenning av mitophagy i mus er komplisert og krever kunnskap om musen anatomi og svært dyktige musen håndtering og mus kirurgi. Denne protokollen gir grunnleggende, viktige trinn på denne metoden, og en mer detaljert metode er tilgjengelig24.
  3. Plass leveren prøven på en metallplate på is avkjøles raskt vevet. Holde vev på kalde metallplaten og behandle så raskt som mulig. Optimalt, bruk innen 1 h disseksjon.
  4. Løft leveren prøven med buet tang og skyll med 5 mL iskald 1 x PBS.
  5. Overføre leveren til en Petriskål (Ø 100 mm) på is med skjeen slutten av en slikkepott.
  6. Skjær leveren prøven for hånd i 0,5-1 mm tykke snitt med enkelt-kant blader.
  7. Nøye overføre delene vev til et glass bunnen rett ved hjelp av mikrokirurgi pinsett.
  8. Nøye sette delen lever med tang å flate i bunnen.
  9. Dekk skiver leveren med 3-5 dråper kaldt 1 x PBS.
    Merk: DAPI flekker anbefales å identifisere regionen rundt i visse vev (f.eks, hjernen)24. For å validere co lokalisering av røde mt-Keima med lysosome, kan lysosomale fargestoffer, som dekstran gjennomgripende blå og lysosensor, brukes24.
  10. Bilde vev inndelingene under AC confocal mikroskopi via to sekvensiell excitations24. Angi to tenkelig kanaler: "grønn" mt-Keima kanal (eksitasjon 458 nm, utslipp 570-695 nm utvalg) og "rød" mt-Keima (eksitasjon 561 nm, utslipp 570-695 nm utvalg). Opprettholde tenkelig innstillinger mellom eksperimentelle forhold. For mer effektiv bildebehandling, analysere to dyr på en gang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deteksjon av Mitophagy i menneskelige celler:

Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, menneskelige HeLa celler ble transfekterte med mt-Keima plasmider. Friske celler vist et velorganisert mitokondrie nettverk (GFP, 488 nm) med noen forekomst av mitophagy (RFP, 561 nm). Imidlertid celler forbehandlet med en mitokondrie uncoupler FCCP (30 µM 3 h) viste en betydelig økning i mitophagy forekomsten (figur 1A). Mitophagy ble også målt ved hjelp av den co lokaliseringen mellom LAMP2 og COXII (figur 1B).

Deteksjon av Mitophagy i C. Elegans

Vi undersøkte kroppen-vegg muskelen celler av transgene nematoder uttrykke DsRed smeltet sammen med LGG-1 og mtRosella eller DCT-1 smeltet sammen med GFP under normal og mitophagy-inducing forhold som oksidativt stress. Transgene dyr ble utsatt for paraquat (8 mM for 2 dager). Mitophagy induksjon angis med redusert GFP/DsRed forholdet mellom mtRosella fluorescens (figur 2A). I tillegg innebærer forhøyet antall co lokalisering hendelser mellom DCT-1::GFP og DsRed::LGG-1 signaler mitophagy stimulering svar oksidativt stress (figur 2B).

Deteksjon av Mitophagy ved hjelp av mt-Keima mus:

Imaging analyse av i vivo mitophagy gir innsikt i mitophagy i normal og patofysiologiske forhold. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, kan mitophagy forekomst i ulike organ vev, som lever og lillehjernen (Figur 3), visualiseres med AC confocal mitophagy.

Figure 1
Figur 1. Forskjellige metoder for å evaluere mitophagy i menneskeceller. (A) Human HeLa celler ble transfekterte med mt-Keima plasmider i tre dager, etterfulgt av bildebehandling på begge 488 nm og 561 nm. Som en positiv, ble ceflls behandlet med FCCP (30 µM) 3 h før bildebehandling. (B) bilder av menneskelige primære fibroblaster med LAMP2 (RFP) og COXII (GFP). (C) bilder av menneskelig fibroblaster med anti-TOM20 (rød) og anti-LC3 (grønn) antistoffer. De til høyre viser avlesning av mitokondrier co lokalisere med autophagosomes. Co lokalisering økes med energisk stress (glukose-fri galaktose media) og tillegg av lysosomale hemmere E64d og Pepstatin A (EP) for 24 h. representant skala barer for (A), (B), og (C) er merket på sist figur for hver rubrikk, uavhengig. Kvantitative data vises i gjennomsnittlig ± S.E.M. ***p < 0,001; t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. I vivo påvisning av mitophagy i C. elegans. (A) transgene nematoder uttrykke mtRosella i kroppen-vegg muskelceller ble behandlet med 8 mM paraquat. Mitophagy stimulering er markert med redusert forholdet mellom pH-sensitive GFP til pH-ufølsom DsRed (n = 50. ***p < 0,001; t-test). Pilspisser påpeke intestinal autofluorescence. Skala barer betegne 20 µm. Kjøp detaljer: eksponeringstid, 200 ms; Kontrast, middels. Bildene ble anskaffet ved hjelp av en 10 X linsen. Kvantitative data vises i gjennomsnittlig ± S.E.M. verdier. (B) transgene nematoder co uttrykke mitophagy reseptor DCT-1 smeltet sammen med GFP sammen med autophagosomal protein LGG-1 smeltet sammen med DsRed i kroppen-vegg muskelceller ble utsatt for 8 mM paraquat. Mitophagy induksjon er markert med co lokalisering av GFP og DsRed signaler (for hver bildegruppe DCT-1 vises i grønt på toppen, autophagosomes i red nedenfor, og en sammenslåtte bildet nederst; n = 30; ***p < 0,001; t-test). Salg barer betegne 20 µm. Kjøp detaljer: oppløsning 1024 X 1024; Master får, Track1: 562 og Track2: 730; Utslipp filtre, Track1 Channel1: 639 nm og Track2 Channel2: 519 nm; Laser intensitet, Track1 (543 nm): 12.9% og Track2 (488 nm): 39.4%. Bildene ble anskaffet bruker en 40 X linsen. Kvantitative data vises i gjennomsnittlig ± S.E.M. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. I vivo påvisning av mitophagy i mt-Keima transgene mus. Representant bilder av mt-Keima signaler i leveren (øverst) og lillehjernen område (inkludert Purkinje celler, nedre panel) av mt-Keima mus (458 nm, grønne; 561 nm, rød). Skala bar angir 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøyaktig måling av mitophagy er teknisk krevende. Her har vi presentert flere robust teknikker som tillater begge kvalitativ påvisning av mitophagy og måling av mitophagy i de vanligste laboratorium eksperimentelle modellene.

For å erverve repliserbare data, er en eksperimentell design med minst tre biologiske gjentakelser nødvendig. Alle forskere involvert i eksperimentering og analyse må være blinde for forsøksgruppen identiteter. Videre må imaging felt være tilfeldig valgt under bildeopptak. Cellekultur og C. elegans studier, skal minst tre biologiske gjentar utføres. For mt-Keima mus studier anbefales det å bruke et tilstrekkelig antall mus for å oppnå statistiske betydning. Pattedyrceller, analysere 30-100 celler for hvert eksperiment og kjøre minst 3 forskjellige eksperimenter. Kvalitetskontroll på fremgangsmåten gjør repliserbar resultater. Deteksjon av mitophagy i gjær har nylig blitt oppsummert andre steder25.

Det er flere viktige trinn i i vitro mitophagy deteksjon teknikker. Hva effektivitet, som avhenger av kvaliteten på reagenser og DNA brukes, viktig under transfection av mt-Keima protein. Dermed er optimalisering av transfection effektiviteten i ulike forhold (f.eksbruker forskjellige linjer) nødvendig. For metoden LAMP2/COXII antistoff spesifisitet og optimal primære antistoff fortynning brett påvirke kvaliteten på bildene og bør testes før du begynner eksperimenter. Det samme gjelder for høyt innhold tenkelig metoden der antistoff kvalitet og fortynning er avgjørende. Automatisert mikroskopi systemet og tilpasset analyse protokollen tillater for bildebehandling og analyse av minst 1500 celler/tilstand, som gjør resultatene svært robust sammenliknet med andre i vivo imaging metoder. I tillegg gir analyse protokollen data på ytterligere mitokondrie parametere som lengde og totalt område på en celle for celle-basis, som er svært nyttig i mitophagy forskning.

I noen tilfeller er det ikke anbefalt å analysen colocalization av LAMP2 med mitokondrie ytre membran proteiner som TOMM20. De tidlige stadiene av mitophagy innebære Parkin-mediert ubiquitination mitokondrie ytre membran proteiner, inkludert TOMM20 og Mitofusin 1 (MFN1). Parkin conjugates flere forskjellige ubiquitin kjeden koblinger på disse proteinene inkludert K48 knyttet ubiquitin kjeder, som fremmer nedbrytning av protein av 26S proteasome. Derfor kan disse ubiquitinated mitokondrie ytre membran proteiner fortsatt bli degradert selv om mitophagy er blokkert6. Dette kan forskyve data, som resulterer i falske positiver i samlede data tolkning. I tillegg eliminering av Mitokondrielt DNA (mtDNA nucleoids) er en andre indikator på mitophagy, og det kan kvantifiseres av immunofluorescence bruker en anti-DNA antistoff6.

Noen viktige skritt for overvåking i vivo mitophagy i C. elegans er oppført nedenfor:

1. overføring av transgene dyr til nye plater hver 24 48 h anbefales å unngå resultatet av avkom, som fører til en blandet befolkning eller sult, som selv kan utløse mitophagy. Derfor bør ikke-sultet nematoder brukes.

2. Levamisole er en mild bedøvelse som brukes til å nakkens nematoder. Unngå bedøvelse som kan påvirke mitokondrie aktivitet, for eksempel Natriumazid. Natriumazid blokkerer komponenter i mitokondrie åndedretts kjeden og perturbs energi generasjon, fører til mitokondrie og oksidativt stress. Dermed er Natriumazid sannsynligvis utløse mitophagy.

3. prøver bør ikke få lov til å tørke ut under mikroskopisk undersøkelse. Bruk av M9 buffer i stedet for vann anbefales derfor å sikre gunstige osmotisk forhold.

4. intestinal autofluorescence øker med alderen i C. elegans. Kroppen-vegg muskelceller nær tarmen bør derfor unngås under mikroskopisk undersøkelse.

5. Hvis paraquat mislykkes å indusere mitophagy: a. øke paraquat eksponeringstid på ormer, b. øke paraquat konsentrasjon eller c. forberede en fersk fungerende løsning av paraquat siden sin effektivitet avtar over tid.

6. om økt matricidal klekking er observert i worms utsatt for paraquat, enten: a. redusere perioden paraquat behandling, b. redusere paraquat konsentrasjon, c. supplement plater med fluorodeoxyuridine (FUdR) (endelig konsentrasjon av 100-400 μM), en inhibitor av DNA-syntese som hindrer egg klekking, eller d. gjennomføre eksperimentet i eldre ormer (f.eks, 4 dager gamle ormer).

Denne prosedyren beskriver trinnene for imaging mitophagy i leveren bruker mt-Keima transgene musene, som vist på Figur 3. Vev enn hjernen og leveren er analysert ved hjelp av mt-Keima systemet14. Dual-eksitasjon forholdet imaging i leveren vev er innhentet via to sammenhengende excitations. Alle bilder må hentes fra ferske forbrukeravgift organer. Vev undersøkt bør holdes kaldt og behandlet så raskt som mulig. Leveren skiver kan fås i alle aldre. Når imaging mitophagy, optimalisere laser krefter og eksponering ganger for hvert organ under mikroskopisk analyse. Laser makt bør settes på laveste utgangen som gir tydelig visualisering av mt-Keima signal14. Det er imidlertid noen begrensninger for mt-Keima transgene musene. På grunn av ustabilitet i Keima samt tap av pH gradering over lysosomale membranen under fiksering er denne musemodell ikke egnet for cryo-skjæring og immunohistochemistry. En annen begrensning er at mt-Keima eller matrix aggregater av dette proteinet, kan påvirke ukjent mitokondrie eller cellulære funksjoner, selv om det ikke endre mitokondrie oksygen forbruk sats14. Videre gjør tid og kostnader forbundet med mt-Keima mus det mindre ønskelig for høy gjennomstrømming analyse enn nevnte cellekultur og C. elegans metoder. Dessuten metodene nevnt her, inkludere andre måter å studere kvantitativt mitophagy i mt-Keima mus Western blot eller FACS. Å merke, i tillegg til mt-Keima transgene musene, det er en annen mitophagy musemodell, den "mito-QC", en transgene musemodell med en pH-sensitive fluorescerende mitokondrie signal26. På grunn av kompleksiteten og dynamikken i mitophagy anbefaler vi å kombinere nevnte fluorescens metoder med andre vanlige mitophagy gjenkjenningsmetoder, som elektronmikroskop og vestlige blotting, for å styrke resultatene.

Utviklingen av nye mitophagy teknikker som de nevnt her har bred programmer, fra mekanistisk studier av mitophagy til høy gjennomstrømning narkotika skjermer. Det bør bemerkes at mitophagy er lett påvirkes av både endogene og eksogene svingninger (f.eks, celle kultur forhold som cellen tetthet, sult, hypoksi, etc.) 1 , 5 , 8. det er derfor viktig at samme eksperimentelle forhold er opprettholdt for alle eksperimenter. Det er viktig å bruke en kombinasjon av forskjellige mitophagy gjenkjenningsmetoder i både i vitro og vivo studier for å kontrollere riktigheten av tolkningen av mitophagy status. Videre forståelse av mekanismer for mitophagy, oppnådd gjennom teknikker nevnt, vil tillate utviklingen av nye, mer presise metoder av mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bohr laboratoriet har CRADA avtaler med ChromaDex og GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Atsushi Miyawaki og Dr. Richard J. Youle for deling av mt-Keima plasmider og mt-Keima integrert Hela celler. Vi takker Raghavendra A. Shamanna og Dr. Deborah L. Croteau for kritisk lesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av NIH (VAB), gi National Institute on aldring, samt en 2014-2015 og et 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EFF, VAB). EFF ble støttet av HELSE Sør-OST RHF (Project No: 2017056) og av Norges forskningsråd (Project No: 262175).

FORFATTER BIDRAG:

EFF designet manuskriptet og forberedt på utkastet; KP, NS, EMF, RDS, JSKS, SAC, YH og ED skrev ulike deler av på papiret. NT, JP, HN og VAB reviderte manuskriptet og gitt kompetanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar		 #CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16 (2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Tags

Medisin problemet 129 Mitophagy aldring C. elegans mus autophagy rosella Alzheimers sykdom Parkinsons sykdom levetid
<em>In Vitro</em> og <em>i Vivo</em> oppdagelse av Mitophagy i menneskelige celler,<em> C. Elegans</em>og mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., … More

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter