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In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56301
Automatic Translation
1,6, 2, 3, 1, 4, 1, 1, 1, 5, 6, 2,7, 5, 6, 1,8
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

Summary

Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.

Abstract

Les mitochondries sont les puissances des cellules et produisent de l’énergie cellulaire sous forme d’ATP. Dysfonctionnement mitochondrial contribue au vieillissement biologique et une grande variété de troubles y compris les maladies métaboliques, maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP) et les syndromes de vieillissement prématuré. Maintien d’une santé mitochondriale dépend de la biogenèse mitochondriale et le déminage efficace de dysfonctionnels mitochondries par l’intermédiaire de mitophagy. Des méthodes expérimentales pour détecter avec précision l’autophagie/mitophagy, en particulier dans des modèles animaux, ont été difficiles à développer. Les progrès récents vers la compréhension des mécanismes moléculaires de mitophagy a permis le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Ici, nous présentons plusieurs techniques polyvalents pour surveiller les mitophagy dans les cellules humaines, Caenorhabditis elegans (p. ex., Rosella et souches DCT-1 / LGG-1) et les souris (mt-Keima). Une combinaison de ces techniques de détection de mitophagy, y compris l’évaluation interspécifique, améliorera la précision des mesures mitophagy et conduire à une meilleure compréhension du rôle de mitophagy dans la santé et la maladie.

Introduction

Mitophagy est essentiel pour fonctionnement mitochondrial. Les mitochondries croisent de multiples voies de signalisation de cellulaire et sont des organites subcellulaires universels responsables de la production d’énergie cellulaire et métabolisme cellulaire calcium homeostasis1,2,3, 4. mitochondries constamment expérience défis provenant de sources endogènes et exogènes, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et substances toxiques mitochondriales, respectivement, qui conduisent à la génération des « âgés » et dysfonctionnels mitochondries. Diminue l’efficacité de la production d’ATP tout en augmentant la quantité de ROS nuisibles accumulation des mitochondries endommagés et a été liée à des maladies liées au vieillissement telles que les maladies métaboliques, AD et PD1,5,6 . Pour éviter tout dysfonctionnement cellulaire induite par les mitochondries, cellules nécessité de reconnaître spécifiquement endommagé les mitochondries et leur enlever efficacement grâce à un processus cellulaire appelé autophagie mitochondriale (mitophagy). Cela démontre l’importance des mitophagy en santé et maladie illustre la nécessité de méthodes précises et efficaces détecter les mitophagy in vitro et in vivo.

Mitophagy est un processus de plusieurs étapes impliquant de nombreuses protéines et protéines complexes5,7,8. En bref, une mitochondrie endommagée est tout d’abord reconnue et engloutie par une double membrane phagophore, qui peut provenir de la membrane plasmique, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, noyau ou mitochondrie lui-même9,10. Le phagophore sphérique s’allonge et finalement scelle les mitochondries à l’intérieur, qui constitue l’autophagosome mitochondriale (mitophagosome). Le mitophagosome fusionne alors avec le lysosome pour dégradation, formant un autolysosome dans lequel la mitochondrie endommagée est dégradée et recyclé7,8. Principales protéines autophagiques également impliqués dans mitophagy comprennent : Autophagy Related 7 (ATG7) et Beclin1 (initiation), protéine Microtubule-Associated 1 a/1 b-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 s elegan c.) et p62 (composants de phagophore), et glycoprotéine de la membrane lysosomale associés à 2 (LAMP2)6,7. En outre, il y a plusieurs protéines essentielles propres à mitophagy, y compris induite par le gène PTEN putatif Kinase 1 (rose-1), Parkin1, Dot nucléoprotéines 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 Interacting Protein 3 comme (NIX/BNIP3L) (DCT-1 chez c. elegans), entre autres5,6,11.

Une méthode courante pour détecter des changements dans les niveaux de l’autophagie est par le ratio du LC3-II/LC3-I ou LC3-II/actine. Toutefois, cette méthode est non spécifique, comme une augmentation de ce ratio peut refléter une ouverture accrue ou une fusion avec facultés affaiblies de mitophagosome au lysosome12. Une autre méthode consiste à évaluer la colocalisation entre un marqueur d’autophagie (p. ex., LC3) et une protéine mitochondriale (p. ex., Translocase of externe mitochondriale Membrane 20 (TOMM20, qui peuvent être dégradés par protéasomes)). Cependant, ceci peuvent seulement indiquer les changements dans les niveaux de mitophagy total et ne peut pas distinguer les étapes à laquelle blocage se produit. Cela peut être clarifié en utilisant des inhibiteurs lysosomales (p. ex., E64d + pepstatine A, appelés EP) en parallèle pour causer l’accumulation de mitophagosomes. La différence entre le nombre de mitophagosomes au départ et le nombre de mitophagosomes après un traitement avec l’EP peut indiquer mitophagy. Ces limitations ont incité le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Compte tenu de l’importance croissante des mitophagy dans un large éventail de maladies humaines, nous présentons plusieurs techniques de détection de mitophagy robuste qui peuvent être utiles pour les chercheurs. Nous couvrir les techniques in vitro et in vivo et recommandons de combiner plusieurs techniques pour vérifier les changements de mitophagy.

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Protocol

Animaux (souris mâles et femelles) est nés et élevés dans une animalerie accrédité, conformément et approbation de la Commission de l’emploi et de NIH animalier. Méthodes d’euthanasie doivent être conformes à toutes les réglementations nationales et institutionnelles.

1. détection de Mitophagy dans les cellules humaines

  1. Détection de mitophagy à l’aide de plasmide mt-Keima
    Remarque : La protéine Keima, fusionnée à un signal de cible des mitochondries, simplifié en mt-Keima, s’est avérée utile pour la détection in vivo mitophagy. MT-Keima est une protéine fluorescente ratiométrique sensibles au pH, qui présente une fluorescence verte (excitation 458 nm) dans des conditions de base ou neutres et fluorescence rouge (excitation 561 nm) dans des conditions acides. Des mitochondries saines se développent dans des conditions de base ou neutres (pH 7-8) et sont indiqués par une fluorescence verte lorsque transfectées avec mt-Keima. Lorsque les mitochondries subissent mitophagy et fusionnent avec les lysosomes acides, le pH descend à 4,5 et mitochondries contenant mt-Keima présentent une fluorescence rouge6,13,14. Ce qui est important, mt-Keima est résistante aux protéases lysosomales, permettant l’évaluation des mitophagy sur de longues périodes. Le protocole ci-dessous est conçu pour les plaques 6 puits.
    1. Jour 1 : Utiliser des cellules humaines primaires (par exemple, les fibroblastes) ou immortalisé les cellules humaines (par exemple, les cellules Hela ou U2OS cellules). Graines environ 0,3 à 1 × 106 cellules/puits (selon le taux de croissance de cellules pour permettre aux cellules d’atteindre 70 % confluence le lendemain) dans une plaque 6 puits. Maintenir les cellules dans un milieu de culture cellulaire complet (Eagle modifié (DMEM) additionné de Dulbecco avec 10 % SVF et 1 % solution de pénicilline-streptomycine mixte) et incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C (20 % O2, 5 % CO2 ). Ajouter 1 mL, milieu de culture cellulaire complet/puits dans une plaque 6 puits.
      Remarque : Gène surexpression/knockdown ou médicaments traitements peuvent s’effectuer à ce stade6.
    2. Jour 2 : Mélanger de l’ADN plasmidique mt-Keima6 et réactif de transfection d’ADN (le mélange pour un puits d’une plaque de 6 puits).
      1. Diluer 15 µL d’un réactif de transfection d’ADN avec 150 µL de milieu sans sérum selon le protocole du fabricant.
      2. Diluez 2 à 5 µg d’ADN plasmidique mt-Keima avec 150 µL de milieu sans sérum.
      3. Ajouter dilué mt-Keima plasmide de réactif dilué de transfection des ADN, Vortexer pendant 10 s et incuber pendant 10 min à température ambiante.
        Remarque : L’optimisation des conditions de la transfection d’ADN peut être nécessaire en fonction de la taille de la plaque (voir protocoles de la manufacturers' pour plus de détails).
      4. Ajouter le mélange réactif ADN/transfection goutte aux cellules, puis secouez les plaques doucement pendant 5-10 s jusqu'à ce que la solution est complètement mélangée.
    3. Jour 3 : Changer les médias en remplaçant le milieu de réactif contenant de l’ADN transfection avec milieu de culture cellulaire complet frais (1 mL/puits).
    4. Jour 4 : Image les cellules à l’aide de la microscopie confocale6. Utiliser les deux canaux d’imagerie : canal vert (excitation 458 nm, émission 570-695 nm) pour visualiser les mitochondries normales et canal rouge (excitation 561 nm, émission 570-695 nm) pour visualiser les mitochondries qui sont en cours de mitophagy. L’image au hasard 20 zones sous un grossissement de x 40 pour un montant total de 100-200 cellules dans chaque cupule.
    5. Effectuer l’analyse des données. Calculer l’indice de « mitophagy » (pourcentage des mitochondries en cours de mitophagy), à l’aide de logiciels d’analyse image de quantifier la quantité de fluorescence dans les canaux rouges et verts : prendre le ratio de la fluorescence rouge à fluorescence rouge + vert, et multiplier par 1006.
      NOTE : Solutions de rechange de transfection incluent l’utilisation de lignes mt-Keima stablement exprimé aux cellules HeLa14. Étant donné que les cellules HeLa n’expriment pas de Parkin, Parkin doit être exprimé stablement Etudier mitophagy Parkin-dépendante dans cette lignée cellulaire.
  2. Détection de mitophagy à l’aide de la colocalisation entre sous-unité d’oxydase du Cytochrome C II (restriction) et LAMP2
    Remarque : La restriction est une protéine de la membrane interne mitochondriale génome encodé. Le « indice de mitophagy » égale le rapport entre la restriction colocalisée avec LAMP2 exprimée en pourcentage du montant total de la restriction.
    1. Les cellules HeLa (ou autres cellules d’intérêt mentionnée à l’étape 1.1.1) de graines dans une lame de 4 puits chambre (1-5 × 10,4 cellules dans 1 mL, milieu de culture cellulaire complet/puits) dans une cellule culture incubateur à 37 ° C (20 % O2, 5 % de CO2) pendant la nuit.
    2. Ajouter 3,0 µL de carbonyle 10 mM - 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) de cyanure et incuber dans l’incubateur de culture cellulaire (étape 1.2.1) pendant 3 h.
      Remarque : Autres médicaments affectant les mitophagy peuvent être utilisés.
    3. Enlever le milieu de culture à l’aide d’une pipette 1 mL, laver les cellules deux fois avec 1 mL/bien du froid (0-4 ° C) 1 x PBS. Laisser la solution reposer 10-30 s avant le prochain lavage. Puis ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde à 3,7 % (PFA) en solution 1 PBS x dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes sur la glace pour fixer les cellules.
      ATTENTION : PFA est la toxine. Travailler sous une hotte lorsque vous utilisez PFA.
    4. Jeter la solution de la PFA à l’aide d’une pipette 1 mL, laver les cellules deux fois avec froid 1 X PBS (1 mL/puits ; laissez la solution reposer pendant 10 s avant le prochain lavage) et permeabilize les cellules avec 1 mL/puits de 0,25 % de détergent (dans du PBS 1 x) pendant 10 minutes sur la glace.
    5. Jeter le tampon perméabilisant, laver délicatement les cellules deux fois avec froid 1 x PBS et jeter (laissez la solution reposer pendant 10 s entre les lavages). Bloquer les cellules avec 1 mL/puits de 5 % FBS dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C. Couvrir les chambres afin d’éviter la perte d’humidité.
    6. Préparer les 0,5 mL/puits d’une solution d’anticorps mixte d’anticorps de restriction (souris, dilution de 1/250) et anticorps LAMP2 (lapin, dilution 01:20-01:50) dans du PBS 1 x 5 % FBS, et le magasin sur la glace pour 0,5 à 1 h.
    7. Retirez la lame de 4 puits chambre de la chambre froide et jeter la solution de saturation avec une pipette de 1 mL. Laver délicatement les cellules deux fois avec 1 mL/puits de froid 1 x PBS et jeter (laissez la solution reposer pendant 10 s entre les lavages), puis ajouter 0,5 mL/ainsi de solution mixte d’anticorps. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur à faible vitesse.
    8. Jeter la première solution d’anticorps à l’aide d’une pipette 1 mL et délicatement laver les cellules trois fois avec 1 mL/puits de PBS 1 x contre le rhume et la jeter. Laissez la solution se trouve pour 10 s avant le prochain lavage. Ajouter 1 mL/puits des anticorps secondaires fluorescents (p. ex., anti-lapin de chèvre avec nm de longueur d’onde 568 de la protéine fluorescente rouge (DP) pour LAMP2 ; et chèvre anti-souris avec nm de longueur d’onde 488 de la protéine fluorescente verte (GFP) pour restriction) en dilution de 1/250 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x. Recouvrir la lame de 4 puits chambre avec du papier aluminium et incuber à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur à faible vitesse.
    9. Jeter la deuxième solution d’anticorps avec une pipette de 1 mL. Laver délicatement les cellules six fois avec 1 mL/puits de PBS 1 x contre le rhume. Laisser la solution pendant 1 min avant le prochain lavage.
    10. Monter les cellules avec 50 µL/puits de milieu de montage antifade au DAPI et ajoutez les lamelles.
    11. Les cellules sous un microscope confocal avec 66 x huile d’immersion et de grossissement d’image (tuile scanne / mosaïques peuvent être utilisés pour augmenter le nombre de cellules par le logiciel). Utiliser les mêmes paramètres tels que la durée de l’exposition de canal, gain numérique, offset numérique, etc. tout au long de l’imagerie tout processus (voir instructions de logiciel pour plus de détails)15.
    12. Logiciel d’analyse de colocalisation utilisation d’analyser quantitativement au moins 20 images aléatoires de 100 cellules15. Utilisez la fonction « Bézier fermée » pour sélectionner des cellules individuelles ensemble. Comparer le coefficient de colocalisation de la Pearson de GFP de DP, pondéré ou non pondéré, pour déterminer les niveaux de mitophagy dans les cellules analysées. Maintenir les valeurs de réticule horizontal et vertical du logiciel d’analyse colocalisation tout au long de l’analyse. Pour définir correctement ces réticules, préparer deux séries supplémentaires de cellules et étiqueter une restriction et les autres LAMP2. Ensuite, affectez à réticule directement au-dessus de la distribution des pixels pour chaque canal15 (voir les instructions du logiciel pour plus de détails).
  3. Un haut débit d’imagerie de mesure pour le dépistage de la mitophagy
    Remarque : Effectuer des écrans à haut débit de composés induisant mitophagy ou inhibant la mitophagy de grandes bibliothèques composés est techniquement difficile. Une technique d’imagerie basée sur la co-localisation des mitochondries avec autophagosomes est une alternative plus simple, mais très sensible pour mitophagy16de dépistage.
    1. Jour 1 : Semences de cellules (par exemple, les fibroblastes humains primaires à 5 000 cellules/100 mL cell culture media/puits) dans une plaque à 96 puits (voir étape 1.1.1).
    2. Jour 2 : Traiter les cellules dès le deuxième jour avec FCCP ou autres composés d’intérêt pour les temps d’incubation désigné (voir étape 1.2.2).
    3. Suivez les étapes 1.2.2-1.2.9 utilisant les anticorps primaires de restriction (souris, dilution de 1/250 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x) et LC3B (lapin, 1/100-dilution de 1 : 200 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x). Par ailleurs, les anticorps primaires pour restriction et LAMP2 peuvent être utilisés.
    4. Les cellules à l’aide d’un lecteur de fluorescence16de l’image. Recueillir les images dans les champs placés au hasard et avec un minimum 500 cellules/puits.
    5. Analyser les données à l’aide d’une cellule analyseur personnalisé protocole16.

2. détection des Mitophagy chez c. elegans

Remarque : Le nématode c. elegans fournit une plate-forme pour doser mitophagy au niveau de l’organisme. Deux souches peuvent être utilisés pour surveiller mitophagy : Rosella (1) les mitochondries ciblées (mtRosella) ou mitophagy (2) récepteurs DCT-1 fusionnée à la GFP avec marqueur autophagosomal LGG-1 fusionné avec Acropora SP. protéine fluorescente rouge (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy surveillance d’un biocapteur Rosella
    NOTE : Rosella est un biocapteur moléculaire qui combine un pH insensible DsRed fusionnée à une variante GFP sensibles au pH. Le biocapteur Rosella tire parti des différences entre le lysosome acide (pH ~ 4,5) et d’autres compartiments cellulaires pH. Ce biocapteur a été utilisé pour contrôler avec succès mitophagy dans Saccharomyces cerevisiae et de plusieurs lignées cellulaires de mammifères, tels que HeLa HEK293 et HCT11618,19. Nous adapté ce journaliste polyvalent de double-fluorescentes et généré transgéniques c. elegans nématodes exprimant axés sur les mitochondries Rosella (mtRosella) dans les cellules musculaires paroi corporelle. Induction de Mitophagy est indiquée par un ratio GFP/DsRed réduit de fluorescence de la mtRosella.
    1. Jour 1 : Pick L4 larves vers exprimant axés sur les mitochondries Rosella (mtRosella) dans les cellules musculaires paroi corporelle sur une plaque de croissance de nématode Media (NGM) ensemencée avec e. coli (OP50) à l’aide d’un microscope de dissection5. Placer les vers/plaque de 10-20 au moins trois plaques de 3,5 cm. Incuber les nématodes à la température standard de 20 ° C5.
      Remarque : Voir la référence pour l’anatomie du ver, y compris l’identification des larves de L420et la façon de faire un choix qui permet de transférer vers d’un endroit à un autre21.
    2. Jour 5 : Synchroniser les nématodes en sélectionnant 15-20 larves transgéniques de L4 et leur transfert sur frais OP50 boutonnée plaque NGM. Utiliser au moins cinq plaques par condition expérimentale.
    3. Jour 7 : Préparer les plaques des véhicules pour les médicaments qui affectent le mitophagy des intérêts ou des témoins positifs.
      1. Tuer les bactéries e. coli (OP50) ensemencées en exposant des plaques NGM pendant 15 min avec 222 µW/cm2 (intensité) de la lumière UV pour s’assurer que les composés induisant la mitophagy ne sont pas métabolisés par les bactéries. Plaques doivent être exposés avec 2 000 J/m2.
        NOTE : Secondes d’exposition nécessaire = 2 000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Ajouter des composés d’intérêt vers le haut des plaques NGM ensemencés. Ajouter une quantité équivalente de véhicule composé (solvant utilisé pour dissoudre les composés, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO)) sur la plaque du véhicule comme témoin négatif. Pour un contrôle positif de l’induction de la mitophagy, une substance toxique mitochondriale, le paraquat (concentration finale de 8 mM) a été utilisé. Ajouter une solution contenant 10 µL de stock de paraquat de 8 M avec 190 µL de ddH2O sur le dessus de la gélose pour le groupe de traitement. Pour le groupe de véhicule, ajouter une solution contenant 10 µL de DMSO avec 190 µL de ddH2O sur le dessus de la gélose.
        NOTE : La solution de travail du paraquat peut se conserver pendant 1 mois à 4 ° C.
      3. Agiter doucement les plaques jusqu'à ce que la drogue ou véhicule recouvre toute la surface. Laisser les plaques à sécher avec le couvercle fermé à température ambiante pendant au moins 1 h avant de transférer les vers.
        NOTE : Plaques de drogue peuvent également être préparés en ajoutant des médicaments dans le liquide NGM avant elle se solidifie.
    4. Jour 7 : Transfert de 10-20 d’âgés de 2 jours adultes animaux transgéniques préparées à l’étape 2.1.2 aux plaques contenant soit le paraquat, composés des intérêts, ou d’un véhicule (DMSO). Incuber les animaux transgéniques à 20 ° C pendant 2 jours.
    5. Jour 9 : Préparer 2 % d’agarose tampons (voir Documents supplémentaires). Puis ajoutez une goutte (10 µL) de 20 mM levamisole en M9 par pad. Immobiliser les animaux transgéniques pour l’imagerie, en les plaçant dans la chute de M9-levamisole. Placez délicatement une lamelle sur le dessus.
    6. Capturer des animaux transgéniques à l’aide d’une caméra attachée à un microscope à épifluorescence. Acquisition d’images fluorescentes de nématodes ensemble transgéniques exprimant des mtRosella dans les cellules musculaires paroi corporelle de grossissement 10 X5. Enregistrer les images recueillies.
    7. Traiter les images acquises avec les logiciels ImageJ. Analyser les cellules de muscle de paroi corporelle situés dans la tête du ver pour éviter l’autofluorescence dans les tissus intestinaux. Mesurer la moyenne intensité valeur et total zone de pixels pour chaque image fluorescente seulement de la région céphalique de chaque animal. Pour analyser la zone d’intérêt :
      1. Sélectionnez « split canal » sous le menu déroulant « image » et « color » de convertir des images.
      2. Utiliser l’outil « sélection à main levée » pour capturer la zone fluorescente d’intérêt.
      3. Sélectionnez la commande « mesure » dans le menu déroulant « analyser » et effectuer une analyse d’intensité pixel.
      4. Intensité de pixels doit être normalisée en divisant l’intensité de la superficie totale analysée. Après normalisation, calculer la GFP DsRed ratio22.
    8. Utiliser l’analyse statistique logiciel soit conduite de student t-test (comparaison entre les deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique p < 0,05 comme significatives5,17 .
  2. Évaluation de mitophagy à l’aide de co-localisation entre DCT-1 et 1-LGG
    Remarque : Le DCT-1 est une protéine de la membrane mitochondriale externe qui agit comme un récepteur de mitophagy en réponse au stress des conditions, semblables à ses orthologues putatif BNIP3 et NIX/BNIP3L mammifères5. Ainsi, mitophagy initiation évalue la co-localisation entre mitophagy du récepteur et autophagosomal protéine membranaire DCT-1 LGG-1 (homologue de la LC3 chez les mammifères).
    1. Jour 1 : Pick L4 larves d’animaux transgéniques exprimant la DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 dans la paroi corporelle muscle cellules5 sur un OP50 ensemencé plaque NGM. Placer 5 à 10 vers/3.5 cm plaque et utiliser au moins trois besants. Incuber les nématodes à 20 ° C.
      Remarque : Les transgènes sont situés sur des plasmides distincts et ils ne sont pas intégrés dans le génome. Ramasser les nématodes, les rol-6(su1006) et pmyo-2 marqueurs de contransformation GFP. Seulement vers transgéniques avec les deux marqueurs contransformation expriment la DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 dans les cellules musculaires paroi corporelle.
    2. Suivez les étapes de 2.1.2-2.1.5.
    3. Image simple paroi corporelle les cellules musculaires à l’aide d’une caméra attachée à un microscope confocal5,23. Détecter les bordures de cellules de muscle de toute paroi corporelle et z-pile de prendre des images moins 63 x grossissement. Un grossissement supérieur peut également être utilisé.
    4. Ouvrir et traiter les images obtenues avec le logiciel confocal. Ouverture de mitophagy est indiqué par la co-localisation des récepteurs mitophagy (DCT-1::GFP) jusqu'à la borne autophagosomal (DsRed::LGG-1). Manuellement mesurer les événements de colocalisation dans chaque pile de paroi corporelle muscle cellule5. Il est essentiel pour assurer la cohérence tout au long des expériences de tous les paramètres de microscope et caméra (lentille et loupe, filtres, durée d’exposition, résolution, intensité du laser, gain, etc.). A noter tous les réglages.
    5. Utiliser l’analyse statistique logiciel soit conduite de student t-test (comparaison entre les deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique p < 0,05 comme significatives5,17 . Usage de comparaisons bidirectionnelles de la Student t-test (p < 0,05 est considérée comme significative). Pour les comparaisons multiples utilisez l’analyse de variance simple facteur (ANOVA), corrigé par le test post hoc de Bonferroni. Nous vous recommandons d’analyser au moins 50-70 animaux ou des cellules de muscle de paroi corporelle de 30 à 50 pour chaque condition expérimentale. Réitérer l’expérience au moins trois fois.

3. détection des Mitophagy chez la souris

NOTE : Des méthodes précédentes pour détecter les mitophagy chez les souris étaient encombrantes, insensible et difficile à quantifier. Un modèle de souris transgénique exprimant la forme mitochondriale ciblée du reporter fluorescent Keima (mt-Keima) peut maintenant être utilisé afin d’évaluer les niveaux de mitophagy dans un large éventail de conditions physiologiques et physiopathologiques.

  1. Euthanasier la souris à l’aide d’un protocole approuvé par l' animalier institutionnel et Comité d’utilisation14.
  2. Fixez la souris (face ventrale vers le haut) à la plate-forme de travail à l’aide de goupilles dans les membres. Faites une incision dans le bas ventre à l’aide de ciseaux de microchirurgie et forceps pour exposer le foie24. Couper un morceau de foie (par exemple, un morceau de lobe droit à 1 × 1 × 1 cm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie et de forceps.
    NOTE : Détection de mitophagy chez la souris est complexe et nécessite des connaissances sur l’anatomie de souris et de manipulation de la souris très habile et de chirurgie de la souris. Ce protocole prévoit des étapes fondamentales, clés sur cette méthode et une méthode plus détaillée est disponible24.
  3. Placer l’échantillon du foie sur une plaque métallique sur la glace pour refroidir rapidement les tissus. Garder le tissu sur la plaque de métal froide et traiter le plus rapidement possible. Idéalement, utilisez moins de 1 h de la dissection.
  4. Soulevez l’échantillon du foie avec une pincette courbée et rincer avec 5 mL de PBS glacée 1 x.
  5. Transférer le foie dans une boîte de Pétri (Ø 100 mm) sur la glace à l’aide de l’extrémité de la cuillère d’une spatule.
  6. Couper l’échantillon du foie à la main dans 0,5 à 1 coupes mm d’épaisseur à l’aide de lames seul bord.
  7. Transvaser avec soin les sections de tissu pour un plat de dessous de verre avec une pincette de microchirurgie.
  8. Poser soigneusement la section du foie avec une pince pour l’aplatir sur le fond.
  9. Couvrir le foie en tranches de 3-5 gouttes de PBS 1 x contre le rhume.
    NOTE : La coloration DAPI est recommandée pour identifier la zone d’intérêt dans certains tissus (p. ex., cerveau)24. Pour valider la co-localisation du signal rouge TM-Keima avec le lysosome, lysosomales colorants, comme le dextran cascade bleu et lysosensor, peuvent être utilisé24.
  10. Les sections de tissu sous microscopie confocale, par l’intermédiaire de deux excitations séquentielle24de l’image. Set de deux canaux d’imagerie : « vert » canal mt-Keima (excitation 458 nm, émission 570-695 nm estimés) et « rouge » mt-Keima (excitation 561 nm, émission 570-695 nm estimés). Gérer des paramètres d’imagerie entre des conditions expérimentales. Pour l’imagerie plus efficace, analyser deux animaux en même temps.

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Representative Results

Détection des Mitophagy dans les cellules humaines :

À l’aide de la procédure présentée ici, l’humains cellules HeLa ont été transfectées avec mt-Keima plasmide. Cellules saines ont démontré un réseau bien organisé mitochondrial (GFP, 488 nm) avec une incidence peu de mitophagy (DP, 561 nm). Cependant, les cellules prétraitées avec un découpleur mitochondrial FCCP (30 µM pour 3 h) présentaient une augmentation profonde incidence mitophagy (Figure 1 a). Mitophagy a été également mesurée à l’aide de la co-localisation entre LAMP2 et restriction (Figure 1 b).

Détection de Mitophagy chez C. Elegans

Nous avons examiné le muscle de la paroi corporelle de nématodes transgéniques exprimant la DsRed fusionné avec LGG-1 et mtRosella ou DCT-1, les cellules fusionnées avec GFP dans des conditions normales et induisant la mitophagy tels que le stress oxydatif. Animaux transgéniques ont été exposés au paraquat (8 mM pour 2 jours). Induction de Mitophagy est indiquée par le ratio GFP/DsRed une diminution de la mtRosella de fluorescence (Figure 2 a). En outre, le nombre élevé d’événements de co-localisation entre DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 signaux signifie stimulation mitophagy en réponse au stress oxydatif (Figure 2 b).

Détection de Mitophagy à l’aide des souris mt-Keima :

Analyse de in vivo mitophagy d’imagerie offre un aperçu de mitophagy dans des conditions normales et physiopathologiques. En utilisant le protocole décrit ci-dessus, occurrence de mitophagy dans les tissus des différents organes, comme le foie et le cervelet (Figure 3), peut être visualisée avec mitophagy confocale.

Figure 1
Figure 1. Différentes méthodes pour évaluer les mitophagy dans les cellules humaines. (A) humaine HeLa cellules ont été transfectées avec le plasmide mt-Keima pendant trois jours, suivie d’imagerie à la fois 488 nm et 561 nm. Comme témoin positif, ceflls ont été traités avec préalable de 3 h (30 µM) FCCP à l’imagerie. (B) Images de fibroblastes humains de primaires colorées avec LAMP2 (DP) et de restriction (GFP). (C) Images de fibroblastes humains colorées avec anti-TOM20 (rouge) et les anticorps anti-LC3 (vert). Les barres à droite montrent la lecture des mitochondries co localisation avec autophagosomes. Co-localisation est augmentée par le stress énergétique (médias sans glucose galactose) et l’addition d’inhibiteurs lysosomales E64d et pepstatine A (EP) pour les barres d’échelle représentant 24 h. (A), (B) et (C) sont étiquetés sur le dernier la figure de chaque panneau, indépendamment. Les données quantitatives sont affichées en moyenne ± S.E.M. ***p < 0,001 ; t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
La figure 2. In vivo la détection des mitophagy chez c. elegans. (A) les nématodes transgéniques exprimant des mtRosella dans les cellules musculaires paroi corporelle ont été traités avec le paraquat 8 mM. Mitophagy stimulation est signifiée par le ratio a diminué entre GFP sensibles au pH pour pH-insensible DsRed (n = 50 ; ***p < 0,001 ; t-test). Pointes de flèche soulignent autofluorescence intestinale. Barres d’échelle indiquent 20 µm. les détails Acquisition : temps d’exposition, 200 ms ; Contraste, moyen. Des images ont été acquises à l’aide d’un objectif de 10 X. Les données quantitatives sont indiquées en moyenne ± S.E.M. valeurs. (B) les nématodes transgéniques exprimant conjointement les récepteurs mitophagy que DCT-1 fusionnée à la GFP ainsi que de la protéine d’autophagosomal que LGG-1 fusionnée avec DsRed dans les cellules musculaires paroi corporelle ont été exposés au paraquat de 8 mM. Induction de Mitophagy est signifiée par la co-localisation de GFP et DsRed signale (pour chaque groupe d’images DCT-1 est illustré en vert sur le dessus, autophagosomes en rouge ci-dessous et une image fusionnée au fond ; n = 30 ; ***p < 0,001 ; t-test). Vente barres indiquent 20 µm. les détails Acquisition : résolution 1 024 X 1 024 ; Gain Master, Track1 : 562 et Track2 : 730 ; Filtres d’émission, Track1 canal1 : 639 nm et Track2 canal2 : 519 nm ; Intensité, Track1 au laser (543 nm) : 12,9 % et Track2 (488 nm) : 39,4 %. Des images ont été acquises à l’aide d’un objectif de 40 X. Les données quantitatives sont affichées en moyenne ± S.E.M. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. In vivo la détection des mitophagy chez les souris transgéniques mt-Keima. Les images représentant des signaux mt-Keima dans le foie (en haut) et la zone de cervelet (y compris les cellules de Purkinje, panneau inférieur) d’une souris mt-Keima (458 nm, vert ; 561 nm, rouge). Barre d’échelle représente 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une mesure précise de mitophagy est techniquement difficile. Ici, nous présentons plusieurs techniques robustes qui permettent les deux détection qualitative des mitophagy et quantification des niveaux mitophagy dans les modèles expérimentaux de laboratoire courantes.

Acquisition de données réplicables, un modèle expérimental au moins trois répétitions biologiques est nécessaire. Tous les chercheurs impliqués dans l’expérimentation et l’analyse doivent être aveugle aux identités de groupe expérimental. En outre, champs d’imagerie doit choisi au hasard lors de l’acquisition de l’image. Pour culture cellulaire et les études de c. elegans , au moins trois répétitions biologiques doivent être effectuées. Pour les études sur les souris mt-Keima, il est recommandé d’utiliser un nombre suffisant de souris pour atteindre une signification statistique. Pour les cellules mammifères, analyser les cellules de 30 à 100 pour chaque expérience, puis exécutez au moins 3 différentes expériences. Contrôle de la qualité à ces étapes donne des résultats reproductibles. Détection de mitophagy chez la levure a été récemment résumées ailleurs25.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans les techniques de détection in vitro mitophagy. Efficacité de transfection, qui dépend de la qualité de l’ADN et des réactifs utilisés, est vitale au cours de la transfection de la protéine mt-Keima. Ainsi, l’optimisation de l’efficacité de transfection dans des conditions différentes (par exemple, à l’aide de différentes lignées cellulaires) est nécessaire. Pour la méthode LAMP2/restriction, spécificité anticorps et pli dilution optimale anticorps primaire affectent la qualité des images et doivent être testés avant de commencer les expériences. Il en va de même pour la méthode d’imagerie de haute teneur, où la qualité des anticorps et la dilution sont cruciales. Le système automatisé de la microscopie et le protocole d’analyse personnalisée permet d’imagerie et d’analyse d’au moins 1 500 cellules/condition, ce qui rend les résultats extrêmement robustes par rapport aux autres en vivo selon des méthodes d’imagerie. En outre, le protocole d’analyse fournit des données sur les autres mitochondriales paramètres tels que la zone longueur et total sur une base de cellule par cellule, ce qui est très utile dans la recherche de mitophagy.

Dans certains cas, il n’est pas recommandé de doser la co-localisation de LAMP2 avec les protéines de la membrane mitochondriale externe tel que TOMM20. Les tout premiers stades de mitophagy impliquent Parkin-mediated ubiquitination des protéines de la membrane mitochondriale externe, y compris TOMM20 et Mitofusin 1 (MFN1). Parkin conjugue de multiples liens de chaîne différents ubiquitine sur ces protéines, y compris les chaînes liées K48 ubiquitine, qui favorisent la dégradation de la protéine par le protéasome 26 s. Par conséquent, ces protéines de membrane externe mitochondriale ubiquitinées encore peuvent se dégrader même si mitophagy est bloqué6. Ceci pouvant fausser les données résultant en faux positifs dans l’interprétation des données globales. En outre, l’élimination de l’ADN mitochondrial (ADNmt nucléoïdes) est un deuxième indicateur de mitophagy, et il peut être quantifié en immunofluorescence à l’aide d’un des anticorps anti-ADN6.

Certaines étapes critiques pour la surveillance in vivo mitophagy chez c. elegans sont énumérés ci-dessous :

1. transfert d’animaux transgéniques pour nouvelles plaques que toutes les 24 à 48 h est recommandée pour éviter l’excroissance de la progéniture, ce qui conduit à une population mixte ou à la famine, qui lui-même peut déclencher des mitophagy. Par conséquent, les nématodes non privées doivent être utilisés.

2. lévamisole est un anesthésique léger qui est utilisé pour immobiliser les nématodes. Éviter les anesthésiques qui pourraient affecter l’activité mitochondriale, tels que l’azoture de sodium. Azoture de sodium bloque les composants de la chaîne respiratoire mitochondriale et perturbe la production d’énergie, conduisant à mitochondrial et le stress oxydatif. Ainsi, l’azoture de sodium est susceptible de déclencher des mitophagy.

3. les échantillons ne puissent pas se dessécher durant l’examen microscopique. Par conséquent, l’utilisation du tampon de M9 au lieu d’eau est recommandée pour assurer des conditions osmotiques favorables.

4. intestinal autofluorescence augmente avec l’âge chez c. elegans. Ainsi, les cellules musculaires paroi corporelle à proximité de l’intestin doivent être évitées au cours de l’examen microscopique.

5. Si le paraquat ne parvient pas à induire des mitophagy : a. augmenter la durée de l’exposition du paraquat sur worms, b. augmentation de concentration de paraquat, ou c. préparer une nouvelle solution de travail du paraquat, car son efficacité diminue avec le temps.

6. Si une augmentation endotocie couver on observe vers exposés au paraquat, soit : a. réduire le délai de traitement de paraquat, b. réduire la concentration de paraquat, c. supplément plaques avec fluorodésoxyuridine (FUdR) (final concentration de 100 à 400 μM), un inhibiteur de la synthèse de l’ADN qui empêche les oeufs à couver ou d. effectuer l’expérience chez les plus âgés vers (p. ex., âgés de 4 jours vers).

Cette procédure décrit les étapes pour l’imagerie mitophagy dans le foie à l’aide de la souris transgénique mt-Keima, tel qu’illustré à la Figure 3. Les tissus autres que le cerveau et le foie ont été analysés en utilisant le système de mt-Keima14. L’imagerie double excitation ratio dans les tissus du foie est obtenue via deux excitations séquentielles. Toutes les images doivent provenir d’organes fraîchement excisées. Tissus examinés devraient être gardés froids et transformés aussi rapidement que possible. Tranches de foie peuvent être obtenues à tout âge. Lorsque l’imagerie mitophagy, optimiser les temps de pouvoirs et de l’exposition de laser pour chaque organe au cours de l’analyse au microscope. Puissance du laser doit être réglé à la plus faible production qui permet une visualisation claire de la mt-Keima signal14. Cependant, il y a quelques limitations pour les souris transgéniques mt-Keima. En raison de l’instabilité de Keima ainsi que la perte d’un gradient de pH à travers la membrane lysosomale sous la fixation, ce modèle de souris n’est pas adapté aux coupes cryo et immunohistochimie. Une autre limitation est que mt-Keima, ou des agrégats de la matrice de cette protéine, peuvent affecter les fonctions inconnues mitochondriales ou cellulaires, même si elle ne change pas d’oxygène mitochondriale consommation taux14. En outre, le temps et les coûts associés à mt-Keima souris rendent moins souhaitable pour l’analyse de haut-débit que la culture cellulaire susmentionnés et les méthodes de c. elegans . Outre les méthodes mentionnées ici, d’autres façons d’étudier quantitativement mitophagy chez les souris mt-Keima incluent Western blot ou à FACS. À noter, outre les souris transgéniques mt-Keima, il y a un autre modèle de souris mitophagy, le «mito-QC », un modèle de souris transgénique avec un signal mitochondrial fluorescent sensibles au pH26. En raison de la complexité et la dynamique de mitophagy, nous vous recommandons d’associer les méthodes susmentionnées fluorescence avec d’autres méthodes de détection mitophagy communes, telles que la microscopie électronique et Western Blot, pour renforcer les conclusions.

Le développement de nouvelles techniques de détection de mitophagy tels que ceux mentionnés ici auront des applications larges, allant des études mécanistes de mitophagy aux écrans de drogues à haut débit. Il est à noter que mitophagy est facilement affecté par les fluctuations endogènes et exogènes (par exemple, des conditions de culture de cellule telles que la densité des cellules, la famine, hypoxie, etc..) 1 , 5 , 8. par conséquent, il est primordial que les mêmes conditions expérimentales sont maintenues pour toutes les expériences. Il est important d’utiliser une combinaison de méthodes de détection des différents mitophagy dans des études in vitro et in vivo pour vérifier l’interprétation correcte du statut de mitophagy. Mieux comprendre les mécanismes de mitophagy, obtenue par des techniques mentionnées aux présentes, permettra le développement de nouvelles méthodes plus précises de détection mitophagy.

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Disclosures

Le laboratoire de Bohr a CRADA accords avec ChromaDex et GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Nous remercions m. Atsushi Miyawaki et Dr. Richard J. Youle partage le plasmide Keima-mt et mt-Keima intégré les cellules Hela. Nous remercions Raghavendra A. Shamanna et Dr. Deborah L. Croteau de la lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de la NIH (VAB), l’Institut National sur le vieillissement, mais aussi un 2014-2015 et 2016-2017 NIA intra-laboratoire accordent (FEP, VAB). EFF a été pris en charge par HELSE DORS-OST RHF (projet No : 2017056) et le Conseil norvégien de la recherche (projet No : 262175).

CONTRIBUTIONS DE L’AUTEUR :

EFF conçu le manuscrit et préparé l’ébauche ; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH et ED a écrit des différentes sections du document ; NT, JP, HN et VAB révisé le manuscrit et a fourni son expertise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar		 #CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

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References

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Médecine numéro 129 Mitophagy vieillissement c. elegans souris autophagie rosella maladie d’Alzheimer maladie de Parkinson longévité
<em>In Vitro</em> et <em>In Vivo</em> la détection des Mitophagy dans les cellules humaines,<em> C. Elegans</em>et la souris
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Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., … More

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

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