5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.
몇 십년 동안 5-methylcytosine (5mC) metazoans에 기능적 의미와 함께 유일한 DNA 수정 될 생각 되었다. 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-carboxylcytosine (5caC)의 효소 산화 N6-methyladenine (6mA) 다세포 생물의 DNA에서의 검색의 검색의 추가 제공 후 성적인 연구를 복잡성입니다. 실험적 증거의 성장 시체에 따르면 이러한 소설 DNA 수정 다른 셀룰러 및 개발 프로세스에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. Immunochemistry에 DNA 개조의 공간 분포의 평가 허용 하는 중요 한 도구를 대표 하는 중요 한 것은, 이러한 표시 (e. g. 5hmC, 5 fC와 5caC) 전시 조직-및 척추 동물, 발달 단계-특정 발생의 일부 다른 생물학 문맥입니다. 여기 DNA 수정 immunostaining 뒤에 confocal 현미경 검사 법에 의해 시각의 계산 분석에 대 한 방법은 설명 합니다. 특히, 2.5 차원 (2.5 D)의 신호 강도 플롯, 신호 강도 프로필, 여러 셀에 신호 colocalization 계수의 강렬을 얼룩이 지기의 부 량 표시 됩니다. 샨 다, 이러한 기술 평가 수준 및 이러한 DNA 수정 elucidating metazoans에 그들의 생물학 역할에 기여 하는 핵에의 지역화에 있을 수 있습니다.
DNA 메 틸 화, 문서화 메커니즘 transcriptional 규제와 관련 된 임무는 5′-시 토 신-인산 염-구 아닌-3 시 토 신 잔류물의 수정 ‘ 메 틸 그룹의 추가 통해 (CpG) 디뉴클레오티드 컨텍스트 (-CH3) 5- 5-methylcytosine (5mC)1를 시 토 신 pyrimidine 링의 탄소 원자. 포유류에서 약 70%의 cpgs 내 겠은 thymine2를 자발적으로 deaminate를 5mC 돌연변이 성향 때문이 갑자기 시퀀스의 고갈로 그들의 게놈의 1%를 창설 하 갠. 유전자 발기인 순서에 메 틸 그룹의 존재는 척추3,,45에 transcriptional 억제로 강한 상관 관계를 표시 합니다. 이 메 틸 그룹의 추가 높은 보존 DNA methyltransferase (DNMT) 효소 DNMT3a, 3b 및 3 L, 그리고 각각 드 노 보 및 유지 보수 메 틸 화 문맥에서 CpG cytosines 수정 DNMT1 촉매는6. 배아 줄기 세포와 epiblast; 개발 중 DNMT3A/B 식 상승 그러나 그것의 감소 식 만능 세포 계보 하겠다는 체세포 운명 차별화8동안 다음과 같은 관찰 됩니다. 기능 중복을 공유 하는 동안 DNMT3a와 3b 표시 조직 특정 식 패턴, 3a 마우스 배아에 균일 하 게 감지 하지만 주로 neuroectoderm와 chorionic ectoderm 조직8지역화 3b.
메 틸 화 서명 유사 분열, 감수 분열10동안 상속 될 수 있습니다. 유지 보수 메 틸 화는 이중 가닥 DNA11반의 갠 palindromes에 존재 하는 CpG 시 토 신 잔류물의 촉진 DNMT1 수정을 포함 됩니다. DNMT1 바인드 DNA 복제 포크11 하 고 따라서, 게놈 메 틸 화 세포 주기12의 S 단계 피크 레벨. DNMT1 methylates 수정된 cytosines 그로 인하여 새로 합성된 DNA 가닥을 구별, x 염색체 비활성화 홍보 및 transcriptional 억제 프로필13유지. Hemi 갠 DNA CpG 시퀀스의 인식를 통해 DNMT1 de novo 메 틸 화 예 의 억압 긴 Interspersed 핵 요소 1 (LINE1)로 구분 하는 메 틸 화의 설립된 패턴 유지 그것의 잠재적으로 발암 성 전파14를 억제 하기 위해 retrotransposon 발기인. 비록 hemi 갠 DNA 우선 바인딩 선호도 보유, DNMT1 수 methylate unmethylated CpG 섬 (CGI) 시퀀스 DNMT3a/b -/- 돌연변이 세포, 긴급 de novo 메 틸 화 역할15 이루고 . 따라서 DNA 복제16의 반 보수적인 성격으로 인하여 유지 보수 메 틸 수 충실 하 게 정리 딸 셀17부모에서 메 틸 화 서명.
그러나, 유전자에 대 한 수 동적으로 변조, 억압 적인 메 틸 화 수정 식 해야 합니다 삭제는 수동 및 활성 demethylation 메커니즘18에 의해 달성 될 수 있다. 10-11 Translocase (TET) 단백질 dioxygenase 단백질의 보존된 가족에 속하는 소비재 잔류물19에 메 틸 그룹의 반복 산화 할 수 있다. 이러한 Tet 단백질, J 자료 바인딩 단백질 (JBP) Trypanosome bruceii에서 발견 된 동종 인식 및 수정된 DNA 바인딩 예 5mC 기초 및 산소 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) 및 5-이러한 잔류물 carboxylcytosine (5caC)20. 그러나 5 fC와 5caC 수정 5mC 산화21, 에서 직접 합성 수 있습니다 Tet 단백질 5mC 결과 수 산 기, 생성, 카복실산 구성, 메 틸에서 단계적 구조 변경에서의 산화 촉진 22 , 23 , 24.
그들의 규칙을 이해 TET 단백질 활동의 유익한 표시 유통 및 oxi-메 틸-시 토 신 마크의 공부입니다. CpG 가난한 발기인에서 중요 한 5mC 존재 unmethylated CpG 풍부한 지역 달리 감지, 후자 되 고 포장 소비재의 제도25. 조직, 구강 점 막 최고의 hypomethylation 전시 하는 동안 특정 메 틸 화는 뇌, 고환 및 혈액에서 관찰 하는 가장 높은 조직에 걸쳐 조직 특정 발기인26에서 발생 하는 차동 메 틸 화 패턴을 나타냅니다.
중요 한 안티-5mC 및 안티 5hmC 통해 선택적 메 틸/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), 그리고 이후의 높은 처리량 시퀀싱, Ficz 외 항 체 증명 발기인에 높은 5hmC 인 exons 및 마우스 배아에서이 위치에서 감소 5mC 수준 연관-1 retrotransposon 시퀀스 줄기 세포27. 반대로, 가장 큰 5mC 농축 5hmC 존재가 제한 된28반복적인 위성 시퀀스에서 관찰 되었다. 인간의 전 두 엽 뇌 조직에서 수행 하는 연구는 매우 중요 한 5hmC 농축, 마우스 배아 줄기 세포28보다 4 배 공개. 이전 관찰과 일치에서 5hmC 신호의 전 두 엽 조직 그림 대부분 55-59%의 높은 처리량 연속에 지역화 저밀도 포장 소비재 발기인 지구 유전자 시체와 intergenic에서 약 6% 인 35-38% 영역입니다. 반면, 5mC intergenic 지역 (25-26%)와 높은 유전자 시체 (52-55%) 내에서 농축 했다 하지만 감소 (22-24%)에 발기인 순서29. 그러나이 연구 조사 5 fC와 5caC 배포판에 제한 된다 배아 줄기 세포와 체세포 조직, 특히 뇌, 5hmC의 풍부한을 나타냅니다.
흥미롭게도, 진핵생물, 위치 6 질소 (N6)에서 아데닌 잔류물의 메 틸 화에에서 최근 발견 (6mA) 디스플레이 게놈 풍부한 프로필 5mC30에의 역. 결합 하는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석에서 관찰 얼룩말 물고기와 돼지 초기 배아의 수준 (genomic adenines의 0.003%)와 정자에 비해 초과에서 존재 6mA 절대 수준을 공개 시 수정, 꾸준히 증가 morula 발달 단계 (정자 보다 높은 33 배)에서 정점 그리고 게놈 adenines31의 0.004%의 정상 상태 체세포 수준에 도달. Immunoprecipitation 농축 6mA DNA 시퀀스의 반복적인 요소 지역과 transcriptional 시작 사이트32에이 마크의 우세 인 (약 80% 농축)을 시연 하고있다. 이 관측의 컨텍스트와 6mA demethylase null 전자의 발견을 확인mbryonic 줄기 세포 축적된 6mA 전시 wildtype 셀에 transcriptionally 활성 요소에 비해 선-1 retrotransposon 입을 중재. 이러한 데이터는 6mA33transcriptional 규제 기능을 제안합니다.
그들은 공간 배급 또는 이러한 마크34, 의 정량 정보를 얻으며 수 없습니다 후속 딥 분석을 결합 하는 활용된 생화학 태그 표시 산화 methylcytosine 파생 상품 (oxi mCs)의 유무, 하는 동안 35. 5hmC 및 5caC의 중요 한 토론 검색 프로토콜은 최근에 개발 된36. 스캐닝 레이저 confocal 현미경 검사 법을 이용 하 여 함께이 fluorophore 활용 된 이차 항 체 기반 immunostaining 방법 따라서, 제공 하는 세포 내에서 DNA 수정이의 시각적 지역화의 독특한 장점을 개별 강조 긍정적으로 또는 부정적으로이 마크의 다른 유형의 존재와 함께 해당 셀 스테인드. 5hmC 및 5caC 절대 신호 강렬으로 활용 된 항 체에 의해 증폭 활성화 heterochromatic euchromatic 지역 예: 크기 및 핵 내에서 이러한 표시의 위치에 대 한 제안에 반 정량적 해석 37 , 38. confocal 현미경 이미지의 전산 분석을 위한 기법을 설명 하는 여기. 2.5 D 공간 배급의 명백한 5hmC 표시에 대 한 플롯 그리고 픽셀 및 핵 내의 그들의 위치 당 5caC 신호 봉우리 시연. 5hmC의 히스토그램 플롯 및 5caC 신호 강도 프로필 봉우리로 이러한 표시의 풍부에 트렌드를 설명 수 골짜기 별도 비중첩 채널으로 그려집니다. 마지막으로, colocalization 함수를 구현 하 여 다른 하나의 신호의 근접의 정도 확인할 수 있습니다 그리고 이것 결과로, 그들의 각각 게놈 좌표를 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜의 핵 내 DNA 수정 시각적 표현 생성의 단계적 프로세스를 설명 합니다. 과민 하 고 강렬한, 하는 동안 이러한 기술을 제한의 수를가지고 할.
그것은 2.5 D에서 생성 된 데이터 플롯, 신호 강도 프로필 및 colocalization 분석은 자연에서 반 정량적 강조 해야 합니다. 때문에 레이저 confocal 현미경 검사에 이미지 중 샘플의 지점에 의해 포인트 조명, 각 채널의 절대 신호 강렬 기록 됩니다. 그러나, 이들은 5hmC의 절대 크기 그리고 5caC 되 고 감지 하 고 유일한 존재, 부재 또는이 후 성적인 표의 규모의 대표.
신호 확대의 반복적인 특성상 필연적으로 신호를 향상에 적용 하는 기계의 크기와 제한 이러한 마크34의 진정한 물리적 게놈 점령의 근사 혼동. 이 마크의 진정한 게놈 지역화 물리적으로 200-300 nm34의 최적의 confocal 해상도 한계 에서도 해결할 수 없는 영역을 차지 하는이 부피가 큰 단백질에 의해 왜곡 될 수 있습니다. 또한, 각 마크에 대 한 개별 채널의 신호 강도 항 체 감도 및 fluorophore 활용34차이로 인해 서로에 비해 수 없습니다. 그러나 정보 영상으로 얻은 게놈 부호의 공간과 일시적인 조직에 빛이 나.
5hmC 및 5caC 신호의 정확한 정량에 대 한 핵 강조 표시 하 고 분석 영역을 명확 하 게 정해 DAPI counterstain에 둘러 쌓여. 이 절차는 배경 잡음은 핵1을 선택 하는 수동 과정 무시로 제어 임계값을 보정에 대 한 요구와 함께 dispenses. 이 프로세스의 자동화는 수행 되어야 할 핵 세분화 수 있는 최신 소프트웨어에 구현할 수 있습니다. 이미지 마스킹 및 크기 제외 데이터의 영역을 선택 하려면 입력 제한 관심 무료 대안 소프트웨어 패키지와 같은 피지 colocalization 분석, 이진 8 비트 형식으로 이미지를 변환할 필요가 같은 단점에 사용할 수 있는 하는 동안은 이 프로그램 사용자 접근 또한, 고려 전체 5hmC 및 5caC euchromatic 지구 고, 게놈 CpG 시퀀스의 고갈에 그들의 지배적인 위치를 가진 일반적으로 결합 하는 게놈에서의 레벨 제한, 사용자 바이어스 소개 핵의 수동 포위 망 합니다. 따라서, 자동으로 핵의 강조 긍정적인 demarcated 지역 내에서 발생 하는 모든 이벤트를 가정 하 고 있을 수 있는 모든 배경 픽셀을 무시 합니다. 따라서, 픽셀의 강도에 따라 이미지 분석은 더 의미 있을 수 있습니다. Mander의 colocalization 계수 피어슨의 상관 관계 계수 추측 하에 반대 그들의 신호 강도 관계 없이 2 개의 신호 사이 공간 오버랩의 정도 분석 하 고의 사용을 고려할 때 이러한 요소는 중요 한 신호 사이 선형 관계입니다.
전반적으로, 여기에 설명 된 기술을 직관적인 형태로 생물학 데이터의 시각적 표현의 테마를가지고. 반 양적 이미지 분석 감도 또는 단일 기본 해상도 게놈 질량 분석 등 강력한 기술을 대체할 수 없습니다 하는 동안 추론 및 가설 될 수 있도록 하는 무료 데이터 제공 넓은 시퀀싱 정밀도와 이미지의 분석에서 잉태.
The authors have nothing to disclose.
작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 [BB/N005759/1 아칸소]에 의해 지원 되었다. NRFH Rosetrees 신뢰와 Stoneygate 신탁에 의해 투자 되었다 [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 현미경, 처리 컴퓨터와 소프트웨어에 의해 BBSRC BB/L013827/1 (종합 슈퍼 해상도 현미경에 시설 노팅엄 대학 그랜트)을 투자 했다
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
Microsoft Excel | Microsoft | NA |