Summary
Recién descubierto formas oxidadas de la 5-METILCITOSINA (oxi-mCs), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) puede representar distintas modificaciones de ADN con papeles funcionales únicas. Aquí se describe un flujo de trabajo semi cuantitativa para la visualización de la distribución espacial de la oxi-mCs, perfiles de intensidad de señal y colocalización.
Abstract
Desde hace varias décadas, 5-METILCITOSINA (5mC) se ha pensado que la única modificación de ADN con un significado funcional en metazoos. El descubrimiento de oxidación enzimática de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC), así como detección de N6-methyladenine (6mA) en el ADN de los organismos multicelulares proporciona grados adicionales de complejidad a la investigación epigenética. Según un creciente cuerpo de evidencia experimental, estas novedosas modificaciones de ADN pueden desempeñar funciones específicas en diferentes procesos celulares y de desarrollo. Lo importante, como algunas de estas marcas (e. g. 5hmC, 5caC y fC 5) exhiben tejido - y ocurrencia de etapa específica del desarrollo en vertebrados, inmunoquímica representa una herramienta importante que permite la evaluación de la distribución espacial de las modificaciones del ADN en diferentes contextos biológicos. Aquí se describen los métodos de análisis computacional de modificaciones de ADN visualizado por inmunotinción seguido por microscopia confocal. Concretamente, la generación de dimensión 2.5 (2.5D) parcelas de intensidad de la señal, la señal se muestran perfiles de intensidad, cuantificación de la intensidad en múltiples células y determinación de los coeficientes de colocalización de señal de la coloración. Colectivamente, estas técnicas pueden ser operacionales en la evaluación de los niveles y la localización de estas modificaciones del ADN en el núcleo, que contribuyen a dilucidar sus funciones biológicas en metazoos.
Introduction
Consiste en un mecanismo documentado asociado con la regulación transcripcional metilación del ADN, modificación de residuos de citosina en 5'-citosina-fosfato-guanina-3' contexto de dinucleótido (CpG) mediante la adición de un grupo metilo (-CH3) a la 5 - átomo de carbono del anillo de pirimidina citosina para formar 5-METILCITOSINA (5mC)1. En los mamíferos, aproximadamente el 70% de GPC son metilado que constituye sólo el 1% de sus genomas se agotan de esta secuencia palindrómico debido a 5mC mutagénicos propensión a deaminate espontáneamente a timina2. Presencia de grupos metilo en las secuencias del gene promotor Mostrar correlación fuerte con la represión transcripcional en vertebrados3,4,5. Además de estos grupos metilo es catalizada por altamente conservado ADN metiltransferasa (DNMT) enzimas DNMT3a, 3b y 3 L y DNMT1 que modificar CpG cytosines en contextos de metilación de novo y mantenimiento respectivamente6. Expresión DNMT3A/B es elevada durante el desarrollo de las células madre embrionarias y epiblasto; sin embargo su expresión disminuida se observa después de pluripotent células linaje compromiso destinos somáticos durante diferenciación8. Compartiendo redundancia funcional, DNMT3a y 3b muestran patrones de expresión tejido específica, con 3a detectado uniformemente en embriones de ratón pero 3b localizada predominantemente en neuroectodermo y el ectodermo coriónica tejidos8.
Firmas de metilación pueden ser heredadas durante mitosis y meiosis10. Metilación de mantenimiento implica la DNMT1 facilitados modificación de residuos de citosina GPC existentes en hemi-metilados palíndromos en la doble hebra de ADN11. DNMT1 se une ADN en replicación horquillas11 y por lo tanto, los niveles de metilación genómica pico durante la fase S del ciclo celular12. DNMT1 son methylates cytosines sin modificar lo distinción de hebras de ADN recién sintetizados, promoción de inactivación del cromosoma x y se mantiene la represión transcripcional perfiles13. A través del reconocimiento de secuencias de ADN CpG metilados de hemi, DNMT1 mantiene establecidos patrones de metilación por novo de metilación por ejemplo, represión de largo entremezclado Nuclear elemento 1 (línea 1) retrotransposón promotores para inhibir su propagación potencialmente carcinogénicos14. Pesar de poseer afinidad de Unión preferencial de ADN metilado hemi, DNMT1 puede metilato unmethylated CpG secuencias de isla (CGI) en las células mutantes DNMT3a/b - / - , cumpliendo un papel de la metilación de novo de emergencia15 . Así debido a la naturaleza semi conservadora de ADN replicación16, metilación de mantenimiento puede recapitular fielmente firmas de metilación de los padres a la célula hija17.
Sin embargo, para gene expresión ser modificación de la metilación dinámicamente modulada, represivo debe borrarse, que puede lograrse mediante desmetilación pasiva y activa mecanismos18. Las proteínas de la translocasa (TET) de diez-once perteneciente a una familia conservada de proteínas dioxygenase son capaces de iterativo oxidación de grupos metilo en CpG residuos19. Estas proteínas de Tet, homólogas a proteínas de unión de J-Base (JBP) descubiertas en Tripanosoma bruceii, reconocen y atan la DNA modificada bases por ejemplo 5mC y oxigenar estos residuos 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Proteína Tet facilitó oxidación de 5mC resultados en cambio de la conformación gradual de metilo a configuraciones hidroxilo, carbonilo y carboxilato, sin embargo modificaciones 5fC y 5caC pueden ser sintetizados de 5mC oxidación21, 22 , 23 , 24.
Una indicación informativa de actividad de la proteína TET en la comprensión de su regulación es estudiar la distribución y abundancia de marcas oxi-metil-citosina. 5mC significativa presencia en CpG pobres promotores es detectable en contraste con las regiones ricas de unmethylated CpG, siendo ésta última característica de la GPC de islas25. A través de los tejidos, más tejidos metilación específica se observa en el cerebro, testículo y sangre y mucosa oral exhiben mayor hipometilación, indicando un patrón de metilación diferencial en tejido promotores específicos26.
A través de la utilización de anti-5mC sensible y anti-5hmC los anticuerpos en selectivo metilo/hidroximetil ADN inmunoprecipitación (meDIP/hmeDIP) y secuenciación de alto rendimiento posterior, Ficz et al. demostrados 5hmC alta ocupación en promotores, los exones o secuencias de retrotransposón LINE-1 que correlacionaron con los niveles de la 5mC reducida en esos lugares en ratón embrionario tallo las células27. Inversamente, mayor enriquecimiento de 5mC observó en secuencias repetitivas satélite donde 5hmC presencia era limitada28. Estudios realizados en tejido fino del cerebro lóbulo frontal humano revelan 5hmC altamente significativo enriquecimiento, cuatro veces mayor que en las células madre embrionarias de ratón28. En concordancia con las observaciones anteriores, secuenciación de alto rendimiento del lóbulo frontal tejido ilustrado mayoría 55-59% de la señal de 5hmC localizada en baja densidad regiones promotoras de CpG, 35-38% dentro de los cuerpos gene y aproximadamente 6% de ocupación en intergénico regiones. En contraste, 5mC se enriqueció en regiones intergénicas (25-26%) y mayor en órganos de la gene (52-55%) pero menor (22-24%) en el promotor secuencias29. Estos estudios indican la abundancia de 5hmC en células madre embrionarias y tejido somático, particularmente el cerebro, sin embargo, las investigaciones sobre las distribuciones 5caC y fC 5 son limitadas.
Curiosamente, recientemente descubierto en eucariotas, la metilación de residuos de adenina en el nitrógeno de la posición 6 (N6) exhibición (6mA) una abundancia genómica perfil inverso al de 5mC30. Observaciones de cromatografía líquida acoplada espectrometría total en tándem revelan niveles absolutos de 6mA para existir en exceso en el pez cebra y embriones tempranos porcinos comparados con esperma con sus niveles (0.003% de genomic adenines) aumentando constantemente sobre fertilización, un pico en la etapa de desarrollo de mórula (33 veces más alta que la esperma) y llegando a niveles somáticos de estado estacionario de 0.004% de genomic adenines31. Inmunoprecipitación 6mA enriquecido de secuencias de ADN ha demostrado ocupación predominante (aproximadamente 80% enriquecimiento) de esta marca en el elemento repetitivo regiones y sitios de inicio transcripcional32. Estas observaciones contextualizar y validar el descubrimiento de 6mA demetilasa nulo eel células exponiendo 6mA acumulada mediada por silenciamiento del retrotransposón LINE-1 comparado con elementos transcripcionalmente activos en células de tipo salvaje. Estos datos sugieren una función reguladora transcripcional 6mA33.
Mientras que conjugados etiquetas bioquímicos juntados a ensayos de inmersión posterior indican presencia o ausencia de derivados oxidados METILCITOSINA (oxi-mCs), no puede impartir información cuantificable de estas marcas34, o distribución espacial 35. un protocolo sensible detección inmunoquímica de 5hmC y 5caC fue recientemente desarrollado36. Este método de immunostaining basados en anticuerpos secundarios conjugado fluoróforo juntada con utilizando microscopía confocal láser posee la ventaja de proporcionar la localización visual de estas modificaciones del ADN dentro de las células, por lo tanto, destacando individual positiva o negativamente manchadas células correspondientes con la heterogénea presencia de las marcas. Las intensidades de señal absoluta 5hmC y 5caC como amplificados por los anticuerpos conjugados permiten interpretaciones semi-cuantitativo que se propongan sobre la magnitud y las posiciones de estas marcas dentro del núcleo por ejemplo regiones heterochromatic y euchromatic 37 , 38. aquí se describe una técnica para el análisis computacional de imágenes de microscopía confocal. La generación de la distribución espacial de 2,5 D parcelas para la visualización de distintas 5hmC y picos de la señal de 5caC por pixel y sus ubicaciones dentro de los núcleos se demuestra. Histograma de parcelas de 5hmC y 5caC perfiles de intensidad de señal pueden ilustrar las tendencias en la abundancia de estas marcas como los picos y canales son trazados como canales separados no superpuestos. Finalmente, mediante la implementación de la función de colocalización, puede determinarse el grado de proximidad de una señal a otro y como resultado de esto, pueden identificarse sus respectivas coordenadas genómicas.
Protocol
1. generación de imágenes confocales
- en preparación para el análisis de formas modificadas de la citosina, realizar inmunohistoquímica tinción según lo descrito por Abakir et al. 34.
- llevar a cabo la proyección de imagen de diapositivas hacia fuera usando un microscopio y guardar archivos en un formato LSM.
Nota: Cuando comparando intensidad perfiles entre las muestras de los valores utilizados para la energía del laser y la ganancia para cada canal deben mantenerse a lo largo de la imagen tomando el procedimiento para permitir la comparación directa en la etapa de análisis de imagen.
2. Generación de parcelas de intensidad 2,5 D
- Abra el software (por ejemplo, Zen negro) y seleccione ' procesamiento '.
- Ir al menú Archivo y seleccione Abrir. Seleccionar la imagen que requiere tratamiento.
- Clic en ' Mostrar todos ' debajo de la imagen para hacer todos los controles de gráficos visible. En la mitad inferior de la pantalla hay tres pestañas; ' Dimensiones ', ' pantalla ' y ' gráficos ', seleccione la ' gráficos ' ficha
- Elija el ' rectángulo ' herramienta para seleccionar núcleos/área de interés.
- Select ' corte región ' a recortar la imagen. Esto va a generar una nueva imagen para la región recortada en una ficha independiente
- Ir al menú Archivo y seleccione Guardar como dar el archivo un nombre y guardarlo como un archivo de LSM o CZI.
- Abra (por ejemplo, azul de Zen) y seleccione la ' escritorio Zen '.
- La imagen recortada de Zen negro para Zen azul seleccionando el archivo y haga clic en el menú Archivo y seleccione Enviar a edición 2012 Zen-azul. Entonces se abrirá la imagen recortada en el correspondiente programa.
Nota: El archivo de imagen se transfiere debido a la característica de trama de 2,5 D intensidad en Zen negro 2012 no muestra múltiples imágenes de canal al mismo tiempo. - En el lado izquierdo de la imagen, seleccione la ficha etiquetada ' 2.5D ', esto permite la visualización de la imagen en 2.5D. Haga clic en ' Mostrar todos ' hacer visibles todos los controles de gráficos.
- Configuración de visualización de Alter por medio de cuatro barras gris situados a la izquierda y debajo de la imagen.
Nota: barra mano izquierda, parte superior de la pantalla = zoom. Barra de la izquierda, parte inferior de la pantalla = imagen de vuelta en eje. Fondo de pantalla, mano izquierda de la barra = rotación de imagen. Fondo de pantalla, derecha mano bar = expandirse y contraerse escala bares. - Asegurarse de que modo de render seleccionado es superficie ya que esto da la mejor visualización de los picos individuales.
- Modificar la distancia a la rejilla cambiando el porcentaje, menor el porcentaje más definición cada pico individual.
- Para guardar la imagen 2.5D, primero ocultar la lista de archivos en el lado derecho y las herramientas gráficas debajo de la imagen haciendo clic en la flecha gris debajo de la trama D 2,5 (junto a ' Mostrar todos '), esto ocultará las fichas gráficas permitiendo la imagen para ampliar para llenar la pantalla n. para guardar la parcela 2,5 D, pulse la ' PrtSc ' clave en el teclado. Esto capturará una captura de pantalla de la pantalla. Pegar la imagen en Microsoft Paint y recortar la imagen antes de guardar.
3. Perfiles de intensidad
- Abra el software (por ejemplo, Zen negro) y seleccione procesamiento de imágenes.
- Ir al menú Archivo y seleccione Abrir. Seleccionar la imagen que requiere tratamiento.
- Como la imagen aparecerán en la pantalla, en el lado izquierdo de la imagen Seleccione la ficha etiquetada ' perfil '.
- En la parte baja de la mitad de la pantalla Seleccione (marque) la ' Mostrar todos ' ficha. Esto le permitirá el acceso a todas las opciones de formato.
- En la mitad inferior de la pantalla hay tres pestañas; ' dimensiones ', ' pantalla ' y ' ProfileƆ select ' perfil ' y seleccione (marque) el ' Tabla ' caja. Seleccione la ' flecha ' botón.
- En la imagen, usa el ratón para seleccionar un punto de inicio y arrastre el ratón sobre un número constante de células. Suelte el ratón para producir una trama de intensidad para las células a lo largo de la línea; Adicionalmente la tabla se popularán por datos de medición de intensidad de los píxeles a lo largo de la línea para cada longitud de onda.
Nota: La tabla proporciona la distancia (μm) en que pixel es leer intensidad de la fluorescencia roja, verde y azul. - Para exportar estos datos, haga clic derecho sobre la tabla, seleccione ' guarde … ' y guardar en un lugar adecuado como un archivo .txt.
- Para guardar la imagen de Perfil de la intensidad seleccionada Seleccione el menú Archivo y seleccione ' de exportación … '. En la ventana emergente seleccionar ' archivo de imagen etiquetado (formato) ' y ' contenido de la ventana de la imagen - panel simple (datos) ' seguido de clic en ' seleccionar nombre de archivo y guardar … ' elegir una ubicación adecuada y haga clic en ' guardar '.
- Repetir el proceso para cada perfil individual de intensidad dependiendo de los campos de visión y el número de perfiles para analizar.
- Intensidad de importar perfiles de datos guardados (ver 3.7) y analizar en una hoja de cálculo seguido por análisis estadístico.
4. Análisis de colocalización
- Abra el software y seleccione ' procesamiento de imágenes '.
- Ir al menú Archivo y seleccione Abrir. Seleccionar la imagen que requiere tratamiento.
- Como la imagen aparecerán en la pantalla, en el lado izquierdo de la imagen Seleccione la ficha etiquetada ' Coloc '.
- En la parte baja de la mitad de la pantalla Seleccione (marque) la ' Mostrar todos ' ficha. Esto le permitirá el acceso a todas las opciones de formato.
- En la mitad inferior de la pantalla hay cuatro lengüetas; ' dimensiones ', ' pantalla ', ' gráficos ' y ' ColocalizationƆ select ' Colocalization ' y marque la casilla para ' tabla de ' y ' imagen '.
- Seleccione el tercer icono a lo largo en la parte superior de esta ficha (estrecha curva aparecerá el texto cuando el ratón se desplaza sobre la herramienta) Utilice esta herramienta para rodear un núcleo único, los valores de esta voluntad de núcleos a continuación aparecen en la tabla.
Nota: Para cada núcleo cercado un diagrama de dispersión se produce para el rojo versus fluorescencia verde que se visualiza en el panel izquierdo de la pantalla. El eje se mueve luego para células dependiendo del umbral de la puerta. Como los núcleos de interés se seleccionan manualmente en las imágenes, ajustar los umbrales bloquea por encima de cero no es necesario. Todos los valores de intensidad de pixel observados dentro de los perímetros nucleares se consideran como señal positiva.
- Seleccione el tercer icono a lo largo en la parte superior de esta ficha (estrecha curva aparecerá el texto cuando el ratón se desplaza sobre la herramienta) Utilice esta herramienta para rodear un núcleo único, los valores de esta voluntad de núcleos a continuación aparecen en la tabla.
- Repetir este proceso de seleccionar el tercer icono en la pestaña y rodeando núcleos posteriores hasta completa el conjunto de datos.
- Para exportar estos datos, haga clic derecho sobre la tabla, seleccione Guardar tabla y guardar en un lugar adecuado.
- Para guardar la imagen de colocalización, seleccione el menú Archivo y seleccione ' de exportación … ' elija; Tagged archivo de imagen (formato) y ' contenido de la ventana de la imagen – solo plano (datos) ' seguido de clic en ' seleccionar nombre de archivo y guardar … ', elija una ubicación apropiada y haga clic ' guardar '.
- Trama de datos en una hoja de cálculo seguido por análisis estadístico de colocalización.
Representative Results
Para determinar la distribución espacial de 5hmC y 5caC en el distinción de diapositivas de progenitores hepática immunostained para estas modificaciones del ADN fueron fotografiada utilizando un microscopio.
Análisis inicial de la distribución espacial de estos mCs oxi se llevó a cabo a través de la generación de parcelas de intensidad 2,5 D (figura 1A, 1B). Los picos rojos y verdes parecen ser definidas con la limitada presencia de picos naranja indicando que sólo una pequeña superposición de las señales 5caC y 5hmC. De acuerdo con estos resultados, los perfiles de intensidad 5hmC y 5caC en la celda correspondiente no fuertemente coinciden entre sí (figura 1). Esto ilustra que 5caC y 5hmC exhiben patrones distintos de distribución nuclear de progenitores hepáticas sugiriendo eso oxidación de Tet-dependiente de 5mC conduce a la generación de diferentes derivados oxidados de esta modificación del ADN en cromatina específica regiones.
Para comparar los niveles de 5caC y 5hmC en Daoy meduloblastoma y ependimoma de BXD-1425EPN células, immunostaining para estos oxi-mCs se llevó a cabo en ambas muestras bajo idénticas condiciones experimentales. Intensidades de señales 5caC y 5hmC fueron entonces comparados en 20 perfiles generados a través de 3 a 5 células para cada línea celular (figura 2A-2D). La cuantificación de estos resultados revelaron que las células 1425EPN BXD exhiben niveles significativamente más bajos de immunostaining 5hmC y 5caC en comparación con las células Daoy (Figura 2D).
Teniendo en cuenta los dos canales rojo (5hmC) y verde (5caC) que puede ser denotado como R y G respectivamente, coeficiente de correlación de Pearson (PCC) describe el grado de superposición espacial y Co-segregación de R & G suponiendo que ambas marcas existe en forma lineal relación con los demás, denotado por R estadística34. Encuadre el valor de la PCC, denotado por R2 permite la medición de la variación de intensidad de señal verde que está influenciada por la intensidad de señal roja34. Esto es superfluo para nuestro análisis de colocalización de 5caC vs 5hmC.
Para examinar la distribución espacial de 5caC y 5hmC en undifferentiated hiPSCs (Undiff) y endodermo hepática (HE24) de 24 horas después de la inducción, análisis de colocalización de estas modificaciones del ADN se llevó a cabo en las mismas imágenes confocales, con valores de R para 20 núcleos analizan para cada línea celular (Figura 3A-3 C).
La cuantificación de los resultados demostró que el grado de colocalización es significativamente mayor (P < 0.05) en HE24 frente a Undiff (Figura 3C). Esto puede atribuirse a la reducida magnitud de 5caC presencia y su intensidad de señal reducida en células Undiff.
Figura 1: la coloración de Immunohistochemical de los progenitores en 72 horas post inducción de diferenciación hepática endodermo. (A) Co de tinción de 5hmC (rojo), 5caC (verde) y mancha de contador nuclear DAPI (azul). La flecha blanca punteada 'B' indica la dirección de generación de perfiles muestreados a través del núcleo, ilustrado en C 1. Barra de escala representa 5 μm. canal rojo: ganar 800, laser 1%. Canal verde: ganar 750, laser 2,4%. Canal DAPI: ganar 750, laser 2,6%. (B) 2,5 D parcela de intensidad de señales DAPI, 5caC y 5hmC. Los picos representan intensidades de la señal absoluta de cada píxel. Vista combinada y los canales individuales se muestran. (C) los perfiles de intensidad de 5hmC, 5caC y DAPI señales en progenitores hepáticas en 72 horas post inducción de la diferenciación. Intensidades de pico se registraron a lo largo de las dimensiones de la flecha blanca punteada 'B' y se indican en el eje x Perfil de intensidad por una flecha discontinua negra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de 5hmC y 5caC señal de intensidades en BXD 1425EPN líneas de celulares de ependimoma y meduloblastoma Daoy. (A) coloración inmunofluorescente de 5hmC (rojo) y 5caC (verde) en células Daoy y BXD-1425EPN. Imágenes fueron captadas con 63 x objetivo de inmersión de aceite, ambos con los mismos ajustes. Vista combinada y los canales individuales se muestran. Barras de escala representan 10 μm. canal rojo: ganar 746, laser 1%. Canal verde: ganar 750, laser 2,4%. Daoy (B) y (C) BXD-1425EPN las células individuales se expanden en las figuras adyacentes. Escala de barras (B) y (C) representan 5 μm. (D) intensidad de fluorescencia media de 5hmC vs 5caC señales en células Daoy y BXD-1425EPN (n = 20, SD). Significación se evaluó mediante una prueba de F y de dos muestras t-test asteriscos denotan estadísticamente significativos valores de p de ** como p < 0,01 y *** como p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de colocalización de señales absolutas 5hmC y 5caC en hiPSCs indiferenciado (Undiff) compararon con el endodermo hepática 24 horas las células progenitoras post diferenciados (HE24). Imágenes de microscopía confocal de (A) indiferenciado hiPSCs y (B) HE24 células teñidas para 5hmC (rojo), 5caC (verde) y DAPI (azul). Las células fueron reflejadas con el objetivo 63 X aceite de inmersión en ajustes idénticos. 20 núcleos cercados ilustran las células para análisis de colocalización. Barras de escala representan 20 μm. canal rojo: ganar 800, laser 1%. Canal verde: ganar 750, laser 2,4%. Canal DAPI: ganar 750, laser 2,6%. (C) análisis de colocalización de la presencia de señal de 5caC dentro de gama de la 5hmC proximidad undiff y HE24 (n = 20, SD). Significación se evaluó mediante una prueba de F y de dos muestras t-test asteriscos denotan estadísticamente significativos valores de p de * p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe el proceso paso a paso de generar representaciones visuales de las modificaciones del ADN dentro de los núcleos. Mientras que sensible e impactante, estas técnicas poseen un número de limitaciones.
Es necesario destacar que los datos generados a partir de 2,5 D parcelas, perfiles de intensidad de señal y análisis de colocalización son semi-cuantitativos en naturaleza. Debido a la iluminación del punto por punto de la muestra durante la adquisición de la imagen en el microscopio confocal de láser, se registran intensidades de la señal absoluta de cada canal. Sin embargo, no son magnitudes absoluto de 5hmC y 5caC ser detectado y sólo representan las indicaciones de la presencia, ausencia o escala de la estas marcas epigenéticas.
Debido a la naturaleza repetitiva de amplificaciones de la señal, limitaciones consistentes con la magnitud de la maquinaria aplicada para mejorar la señal de la inevitable confundir aproximaciones de ocupación genómica física verdadera de estas marcas34. La verdadera localización genómica de estas marcas puede ser ocultada por estas proteínas voluminosas, que físicamente ocupan áreas irresoluble incluso en los límites de resolución óptima confocal de 200-300 nm34. Por otra parte, las intensidades de la señal de los canales individuales para cada marca no pueden ser comparadas entre sí debido a diferencias en la sensibilidad de los anticuerpos y fluoróforo verbal34. Sin embargo la información obtenida con la proyección de imagen arroja luz sobre la organización espacial y temporal de las marcas genómicas.
Para la cuantificación precisa de las señales 5hmC y 5caC, los núcleos se destacó y rodeados contra la contratinción DAPI, delimitar claramente la región a analizar. Este procedimiento se distribuye con el requisito para la calibración de umbrales bloquea como ruido de fondo no se respetan a través del proceso manual de selección de núcleos1. Una automatización de este proceso se logra en el último software que permite la segmentación nuclear para llevar a cabo. Mientras que los paquetes de software libre alternativa tales como FIJI están disponibles para análisis de colocalización, inconvenientes tales como el requisito para convertir imágenes a formatos binarios de 8 bits, enmascaramiento de imágenes e introducir datos de exclusión de tamaño para seleccionar regiones de interés límite la acceso de usuario de este programa. Además, teniendo en cuenta que la general limitados niveles de 5hmC y 5caC en el genoma juntado con su localización predominante en regiones euchromatic y agotamiento de secuencias genómicas de CpG en general, manual de cerco de núcleos presenta sesgo de usuario. Por lo tanto, destacando núcleos automáticamente asume que todos los eventos que ocurren dentro de la región demarcada para ser positivo y no tiene en cuenta los píxeles de fondo que pueden estar presentes. Así, análisis de imágenes basados en la intensidad del pixel pueden ser más significativo. Estos factores son importantes al considerar el uso del coeficiente de colocalización de Mander para analizar el grado de solapamiento espacial entre dos señales, independientemente de sus intensidades de señal como se oponen al coeficiente de correlación de Pearson que asume un relación lineal entre las señales.
En general, las técnicas descritas aquí llevan el tema de la representación visual de datos biológicos en un formato intuitivo. Mientras que análisis semi-cuantitativo de imágenes no sustituyen a poderosas técnicas como la espectrometría de masas en términos de sensibilidad o genoma único resolución base anchos de TRISTEN, proporcionan datos complementarios que permitan inferencias e hipótesis a ser concebida a partir de análisis de imágenes con precisión.
Disclosures
No hay posibles conflictos de intereses fueron divulgados.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por biotecnología y Consejo de investigación de ciencias biológicas [BB/N005759/1 A.R.]. NRFH fue financiado por el Rosetrees Trust y el fideicomiso Stoneygate [A1130 / M546]. El microscopio Zeiss Elyra PS.1, el procesamiento de computadoras y software fueron financiados por el BBSRC BB/L013827/1 (Super multidisciplinario resolución microscopia de instalación en beca de la Universidad de Nottingham)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
References
- Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).
- Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).
- Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
- Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).
- Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).
- Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).
- Reik, W., Kelsey, G., Walter, J.
- Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).
- Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
- Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71 (5), 865-873 (1992).
- Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20 (1), 85-93 (1980).
- DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).
- Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).
- Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).
- Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).
- Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).
- Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).
- Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).
- Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17 (1), 141 (2016).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).
- He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).
- Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).
- Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).
- Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).
- Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
- Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5 (12), e15367 (2010).
- Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , Springer. 125-137 (2016).
- Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).
- Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
- Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).
