新发现的 5-嘧啶 (氧化-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxylcytosine (5caC) 的氧化形式, 可能代表独特的功能作用的 DNA 修饰。本文介绍了氧化-mCs 空间分布、信号强度剖面和定位的半定量可视化工作流。
几十年来, 5-嘧啶 (5mC) 被认为是唯一的 DNA 修饰, 具有功能意义的后生。发现酶氧化5mC 到 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxylcytosine (5caC), 以及检测 N6-methyladenine (6mA) 的 DNA 多细胞生物体提供了额外的程度复杂性对后生研究。根据越来越多的实验证据, 这些新的 DNA 修饰可能在不同的细胞和发育过程中扮演特定的角色。重要的是, 由于这些标记 (例如5hmC、5fC 和 5caC) 在脊椎动物中表现出组织和发育阶段的具体发生, 免疫代表了一个重要的工具, 可以评估 DNA 修饰的空间分布不同的生物环境。本文介绍了用免疫和共焦显微镜进行 DNA 修饰的计算分析方法。具体说明了2.5 维 (2.5D) 信号强度图的生成、信号强度分布、多细胞染色强度的量化以及信号定位系数的确定。总的来说, 这些技术可以用于评估细胞核内这些 DNA 修饰的水平和定位, 有助于阐明它们在后生中的生物学作用。
DNA 甲基化, 一个完整的机制与转录调控需要修改的胞嘧啶的残留在 5 “-胞嘧啶磷酸-鸟嘌呤-3” (CpG) 核苷酸上下文通过添加一个甲基组 (CH3) 到5胞嘧啶嘧啶环的碳原子形成 5-嘧啶 (5mC)1。在哺乳动物中, 大约70% 的 cpg 是甲基化的, 只有1% 的基因组, 因为它们已经耗尽了这复发序列, 由于5mC 诱变倾向自发 deaminate 嘧啶2。甲基组对基因启动子序列的存在与脊椎动物的转录抑制表现出强烈的相关性3,4,5。这些甲基基团的添加是由高度保守的 DNA 甲基 (DNMT) 酶 DNMT3a, 3b 和 3L, 和 DNMT1 修改 CpG cytosines 在de 诺和维护甲基化上下文分别6。胚胎干细胞和叶发育过程中 DNMT3A/B 表达升高;然而它的被减少的表示在分化以后被观察多能细胞世系承诺到躯体命运8。虽然共享功能冗余, DNMT3a 和3b 显示组织特异性表达模式, 与3a 检测一致的小鼠胚胎, 但3b 主要本地化为外胚层和绒毛膜外胚层组织8。
甲基化签名可以在有丝分裂和减数分裂期间继承10。维护甲基化涉及 DNMT1 促进的 CpG 胞嘧啶残留在半甲基化回文的双 DNA 中存在的修饰, 即11。DNMT1 将 DNA 绑定在复制叉11上, 因此, 在单元周期的 S 阶段中, 基因组甲基化水平达到峰值12。DNMT1 methylates 未经修改的 cytosines 从而区分新合成的 DNA 链, 促进 X 染色体失活和维持转录抑制配置文件13。通过对半甲基化 DNA CpG 序列的识别, DNMT1 保持了已建立的甲基化模式, 由de 诺甲基化,例如对长散核元素1的压制 (LINE1)座子促进剂抑制其潜在的致癌传播14。虽然拥有半甲基化 DNA 优先结合亲和性, DNMT1 可以甲醇化 CpG 岛 (CGI) 序列在DNMT3a/b -/- 突变细胞, 实现紧急de 诺的甲基化角色15.因此, 由于 DNA 复制的 semi-conservative 性质16, 维护甲基化可以忠实地重述从父单元到子细胞17的甲基化特征。
然而, 对于基因表达进行动态调制, 必须消除压制性甲基化修饰, 这可以通过被动和主动甲基机制18实现。十-十一 Translocase (春节) 蛋白属于一个保守的酶蛋白家族, 可以在 CpG 残留物上进行迭代氧化甲基基团19。这些在锥 bruceii中发现的与 J 基结合蛋白 (JBP) 同源的春节蛋白, 识别并绑定修改后的 DNA 碱基, 如5mC 和氧这些残留物到 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxylcytosine (5caC)20。蛋白质促进氧化的5mC 结果在逐步构象改变从甲基到羟基, 羰基和羧酸盐的配置, 但5fC 和5caC 的修改可以直接合成从5mC 氧化21,22,23,24。
在了解其规律的同时, 对氧化的蛋白质活性进行了详细的说明, 研究了甲基-胞嘧啶标记的分布和丰度。与化 cpg 富地区相比, 在 cpg 低的启动子上有明显的5mC 存在, 后者是 cpg 群岛25的特征。在组织中, 最高组织特异性甲基化在脑、睾丸和血液中观察, 而口腔粘膜表现出最大的化, 表明在组织特异启动子26中发生的差异甲基化模式。
通过在选择性甲基/羟甲基 DNA 沉淀 (meDIP/hmeDIP) 和随后的高通量测序中利用敏感的 anti-5mC 和 anti-5hmC 抗体, Ficz et al.在促进者中展示了高5hmC 的占有率,显和 LINE-1 座子序列在小鼠胚胎干细胞的这些位置与减少的5mC 水平相关,27。相反, 最大的5mC 富集被观察在重复的卫星序列, 5hmC 存在被限制28。对人额叶脑组织的研究显示高度显著的5hmC 富集, 四倍高于小鼠胚胎干细胞28。与先前的观测结果一致, 高吞吐量测序的额叶组织图显示大多数55-59% 的5hmC 信号在低密度 CpG 启动子区, 35-38% 在基因体内和大约6% 的占有率在基因地区.相比之下, 5mC 在基因地区 (25-26%) 和更高的基因体 (52-55%), 但减少 (22-24%) 在启动子序列29。这些研究表明, 胚胎干细胞和体细胞组织的丰度为 5hmC, 尤其是大脑, 但对5fC 和5caC 分布的调查却有限。
有趣的是, 最近发现在真核生物, 甲基化的腺嘌呤残留在位置6氮 (N6) (6mA) 显示一个基因组丰度剖面反转到 5mC30。液相色谱联用串联质谱法观察发现斑马鱼和猪早期胚胎中存在的6mA 绝对水平比精子的水平 (0.003% 的基因组 adenines) 在受精时稳步增加,峰值在桑椹发育阶段 (33 倍高于精子) 和达到稳态体细胞水平的0.004% 的基因组 adenines31。沉淀的6mA 丰富的 DNA 序列已经证明了占主导地位 (约80% 丰富) 的这个标志在重复元素地区和转录开始网站32。这些观察处境并验证了6mA 甲基的发现–空 e与野生细胞中的转录活性元素相比, mbryonic 干细胞表现为6mA 介导的 LINE-1 座子沉默。这些数据显示了 6mA33的转录调节功能。
虽然共轭生化标签耦合到随后的 DIP 化验表明存在或没有氧化嘧啶衍生物 (氧化-mCs), 他们不能传授空间分布或这些标记的可量化信息34,35. 5hmC 和5caC 的敏感免疫检测的协议最近被开发了36。这种荧光共轭的二次抗体免疫方法与利用扫描激光共聚焦显微镜具有独特的优势, 提供这些 DNA 修饰的视觉定位在细胞内, 从而,强调个体正或负染色细胞与这些标记的异质存在相对应。由共轭抗体放大的5hmC 和5caC 绝对信号强度使半定量解释被提议关于这些标记的大小和位置在核例如异和 euchromatic 区域37,38. 本文描述了共焦显微图像的计算分析技术。展示了2.5D 空间分布图的生成, 用于显示每个像素的不同5hmC 和5caC 信号峰值及其在原子核中的位置。5hmC 和5caC 信号强度剖面图的直方图图可以说明这些标记的丰度趋势, 因为峰值和波谷被绘制为单独的不重叠通道。最后, 通过实现定位函数, 可以确定一个信号与另一讯号的接近度, 因此, 可以确定它们各自的基因组坐标。
该协议描述了在细胞核内生成 DNA 修饰的视觉表示的逐步过程。这些技术虽然敏感和有影响力, 但确实有许多限制。
有必要强调的是, 从2.5D 地块产生的数据, 信号强度剖面和定位分析是半定量的性质。在激光扫描共聚焦显微镜上, 由于样品在图像采集过程中点照点光照, 记录了各通道的绝对信号强度。然而, 这些不是绝对大小的5hmC 和5caC 被检测到, 只代表的存在, 缺席或规模的这些后生标记的迹象。
由于信号放大的重复性, 限制与机械的大小相一致, 用于增强信号不可避免地混淆了这些标记的真实物理基因组的近似值34。这些标记的真正的基因组定位可能会被这些笨重的蛋白质所遮蔽, 即使在 200-300 nm34的最佳共焦分辨率限制下, 物理占据区域无法。此外, 由于抗体敏感性和荧光共轭34的差异, 每个标记的单个通道的信号强度不能相互比较。然而获得的信息与成像棚光在基因组标记的空间和世俗组织。
为了准确定量的5hmC 和5caC 信号, 原子核是突出和包围对 DAPI counterstain, 明确划定的区域进行分析。该程序不符合校准门阀阈值的要求, 因为背景噪声是通过选择原子核1的手动过程而忽略的。这一过程的自动化可以实现在最新的软件, 允许进行核分割。虽然有免费的替代软件包, 如斐济可用于定位分析, 缺点, 如要求转换成二进制8位格式的图像, 掩蔽图像和输入大小排除数据, 以选择感兴趣的区域限制此程序的用户可访问性。此外, 考虑到在基因组中的5hmC 和5caC 的总体有限水平, 加上它们在 euchromatic 地区的主要位置, 以及一般的基因组 CpG 序列的耗尽, 人工包围的细胞核引入了用户偏倚。因此, 突出的原子核自动假设所有事件发生在标定区域是积极的, 并无视任何背景像素可能存在。因此, 基于像素强度的图像分析可能更有意义。在考虑使用 Mander 的定位系数来分析两个信号之间的空间重叠程度时, 这些因素是很重要的, 不管它们的信号强度是反对皮尔逊的相关系数, 这是假定信号之间的线性关系。
总的来说, 这里概述的技术以直观的格式进行生物数据的可视化表示的主题。虽然半定量图像分析不能取代强大的技术, 如质谱的灵敏度或单一的基本分辨率基因组宽测序, 它提供补充数据, 允许推论和假说用精确的图像分析来构思。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了生物技术和生物科学研究理事会的支持 [BB/N005759/1 ar]。NRFH 由 Rosetrees 信托基金和 Stoneygate 信托基金 (A1130/M546) 资助。蔡司 Elyra PS 1 显微镜, 处理计算机和软件由 BBSRC BB/L013827/1 (诺丁汉大学补助金多学科超分辨率显微镜设施) 资助
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
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Microsoft Excel | Microsoft | NA |