Nyopdagede oxideret former for 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) kan udgøre særskilte DNA ændringer med unikke funktionelle roller. Her er en semi-kvantitative arbejdsproces for visualisering af oxi-mCs’ geografiske fordeling, signal intensitet profilering og colocalization beskrevet.
I flere årtier, har 5-methylcytosine (5mC) været tænkt til at være den eneste DNA ændring med en funktionel betydning i metazoans. Opdagelsen af enzymatisk iltning af 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) samt påvisning af N6-methyladenine (6mA) i DNA af flercellede organismer leveres yderligere grader af kompleksitet til den epigenetiske forskning. Ifølge en voksende mængde af eksperimentelle bevismateriale, kan disse roman DNA ændringer spille specifikke roller i forskellige cellulære og udviklingsmæssige processer. Vigtigere, som nogle af disse varemærker (e. g. 5hmC, 5fC og 5caC) udstille væv- og udviklingsmæssige fase-specifik forekomst i hvirveldyr, repræsenterer immunochemistry et vigtigt redskab, der giver mulighed for vurdering af rumlige fordeling af DNA ændringer i forskellige biologiske sammenhænge. Her beskrives metoder til beregningsmæssige analyse af DNA ændringer visualiseret ved immunfarvning efterfulgt af Konfokal mikroskopi. Specifikt, generation af 2,5 dimension (2.5 D) signal intensitet parceller, signal intensitet profiler, kvantificering af farvning intensitet i flere celler og bestemmelse af signal colocalization koefficienter er vist. Kollektivt, kan disse teknikker være operationelt i evaluering af niveauer og lokaliseringen af disse DNA ændringer i kernen, bidrager til at belyse deres biologiske roller i metazoans.
DNA methylering, en veldokumenteret mekanisme tilknyttet transkriptionel regulering indebærer ændring af cytosin rester i en 5′-cytosin-fosfat-guanin-3′ (CpG) dinucleotid forbindelse via tilføjelsen af en methylgruppe (-CH3) til 5 – carbonatom af cytosin pyrimidin ring til at danne 5-methylcytosine (5mC)1. Hos pattedyr, er ca. 70% af CpGs methylerede som udgør kun 1% af deres genomer, som de er forarmet af denne palindromiske sekvens på grund af 5mC mutagene tilbøjelighed til spontant deaminate thymin2. Tilstedeværelsen af methylgrupper på gensekvenser promotor viser stærke korrelation med transcriptional undertrykkelse i hvirveldyr3,4,5. Tilføjelsen af disse methylgrupper er katalyseret af stærkt bevarede DNA methyltransferase (DNMT) enzymer DNMT3a, 3b og 3 L og DNMT1, som ændrer CpG cytosines i de novo og vedligeholdelse methylering sammenhænge henholdsvis6. DNMT3A/B udtryk er forhøjet i løbet af udvikling i embryonale stamceller og epiblast; men dens formindsket udtryk er observeret efter pluripotente celle afstamning engagement til somatiske skæbner under differentiering8. Samtidig deler funktionel redundans, skærm DNMT3a og 3b væv-specifikke udtryk mønstre, med 3a opdaget ensartet i mus embryoner men 3b overvejende lokaliseret til neuroectoderm og chorion ectoderm væv8.
Methylering signaturer kan være nedarvet under mitose og meiose10. Vedligeholdelse methylering indebærer DNMT1 lettes ændring af CpG cytosin restkoncentrationer i hemi-methylerede palindromes på dobbelt-strenget DNA11. DNMT1 bindes DNA på replikering gafler11 og derfor genomisk methylering niveauer peak i cellecyklus12S fase. DNMT1 methylates uændret cytosines dermed adskille nyligt syntetiserede DNA-strenge, fremme x-kromosom Inaktiveringen og opretholde transcriptional undertrykkelse profiler13. Gennem anerkendelse af hemi-methylerede DNA CpG sekvenser vedligeholder DNMT1 etablerede mønstre af methylering afgrænses af de novo methylering fx repression af lange afbrudt nukleare Element 1 (LINE1) retrotransposon initiativtagere til at hæmme dets potentielt kræftfremkaldende formering14. Selvom besidder hemi-methylerede DNA præferentielle bindingsaffinitet, kan DNMT1 methylate unmethylated CpG ø (CGI) sekvenser i DNMT3a/b – / – muterede celler, opfylde en nødsituation de novo methylering rolle15 . Således på grund af DNA replikation16semi-konservativ karakter kan vedligeholdelse methylering trofast sammenfatte methylering underskrifter fra forælder til datter celle17.
Men for gen udtryk for at være dynamisk moduleret, repressive methylering ændring skal slettes, som kan opnås af passive og aktive demetylering mekanismer18. Ti-elleve Translocase (TET) proteiner tilhører en bevarede familie af dioxygenase proteiner er i stand til at iterativ oxidation af methylgrupper på CpG restkoncentrationer19. Disse Tet proteiner, homologe til J-Base bindende proteiner (JBP) opdaget i Trypanosome bruceii, anerkende og binde modificerede DNA baserer fx 5mC og oxygenat disse restprodukter til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) og 5 – carboxylcytosine (5caC)20. Tet protein lettet oxidation af 5mC resultater i trinvis kropsbygning ændring fra methyl hydroxyl, carbonyl og carboxylat konfigurationer, men 5fC og 5caC ændringer kan syntetiseres direkte fra 5mC oxidation21, 22 , 23 , 24.
En informativ angivelse af TET protein aktivitet med at forstå deres forordning undersøger distribution og overflod af oxi-methyl-cytosin mærker. Betydelig 5mC tilstedeværelse på CpG fattige initiativtagere kan påvises i modsætning til unmethylated CpG rige regioner, sidstnævnte er karakteristisk for CpG øer25. På tværs af væv, højeste væv specifik methylering er observeret i hjernen, testiklerne og blod, mens mundslimhinden udviser størst hypomethylation, der angiver en differentieret methylering mønster, som opstår i væv specifikke initiativtagere26.
Gennem udnytter følsomme anti-5mC og anti-5hmC demonstreret antistoffer i selektiv methyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) og efterfølgende høj overførselshastighed sekventering, Ficz et al. høj 5hmC belægning på initiativtagere, exons og LINE-1 retrotransposon sekvenser, der korreleret med reduceret 5mC niveauer på disse steder i mus embryonale stamceller celler27. Største 5mC berigelse konstateredes omvendt, hos gentagne satellit sekvenser, hvor 5hmC tilstedeværelse var begrænset28. Undersøgelser udført på menneskelige frontallappen hjernevæv afsløre meget betydelige 5hmC berigelse, fire gange højere end i mus embryonale stamceller28. I overensstemmelse med tidligere bemærkninger, høje overførselshastighed sekventering af frontallappen væv illustreret flertal 55-59% af 5hmC signal er lokaliseret på lav densitet CpG promotor regioner, 35-38% inden for gen organer og cirka 6% belægning på intergenic regioner. Derimod 5mC blev beriget på intergenic regioner (25-26%) og højere inden for gen organer (52-55%), men reduceret (22-24%) på promotor sekvenser29. Disse undersøgelser viser overflod af 5hmC i embryonale stamceller og somatiske væv, især hjernen, men undersøgelser på 5fC og 5caC distributioner er begrænset.
Interessant, for nylig opdaget i eukaryoter, methylering af adenin rester på holdning 6 nitrogen (N6) (6mA) display en genomisk overflod profil omvendt til at 5mC30. Observationer fra væskekromatografi kombineret tandem massespektrometri afsløre 6mA absolutte niveau at eksistere i overskud i zebra fisk og svin tidlige embryoner i forhold til sædceller med sin niveauer (0,003% af genomisk adenines) støt stigende efter befrugtning, toppede morula udviklingsstadiet (33 gange højere end sæd) og at nå frem til steady state somatiske niveauer af 0,004% af genomisk adenines31. Immunoprecipitation af 6mA beriget DNA-sekvenser er påvist fremherskende belægning (ca 80% berigelse) af dette mærke på gentagne element regioner og transcriptional start websteder32. Disse observationer kontekstualisere og validere opdagelsen af 6mA demethylase-null embryonic stamceller udstiller akkumulerede 6mA medieret linje-1 retrotransposon hæmning i forhold til transcriptionally aktive elementer i vildtype celler. Disse data tyder på en transcriptional regulerende funktion for 6mA33.
Mens konjugeret biokemiske tags koblet til efterfølgende DUKKERT assays indikere tilstedeværelsen eller fraværet af oxideret methylcytosine derivater (oxi-mCs), kan ikke de give geografiske fordeling eller kvantificerede oplysninger af disse mærker34, 35. en protokol for følsomme immunokemisk påvisning af 5hmC og 5caC var nyligt udviklede36. Denne fluorophore konjugeret sekundær antistof-baserede immunfarvning metode kombineret med udnytter scanning laser Konfokal mikroskopi besidder den unikke fordel visuelle lokalisering af ændringerne DNA i cellerne, således fremhæve enkelte farvet positivt eller negativt celler svarer med heterogene tilstedeværelsen af disse mærker. De 5hmC og 5caC absolutte signal intensiteter aktiverer som forstærkes af de konjugerede antistoffer semi-kvantitative fortolkninger vil blive foreslået om omfanget og placeringen af disse mærker i kernen fx heterochromatic og euchromatic regioner 37 , 38. her en teknik til beregningsmæssige analyse af konfokalmikroskopi billeder er beskrevet. Generation af 2.5D rumlige fordeling grunde til at vise forskellige 5hmC og 5caC signalspidser pr. pixel og deres placeringer i kerner er påvist. Histogram grunde af 5hmC og 5caC signal intensitet profiler kan illustrere tendenser i overflod af disse mærker som toppene og trug afbildet som separate ikke-overlappende kanaler. Endelig, ved at gennemføre funktionen colocalization, grad af nærhed af et signal til en anden kan bestemmes og som følge heraf er deres respektive genomisk koordinater kan identificeres.
Denne protokol beskriver den trinvis proces til at generere visuelle repræsentationer af DNA ændringer inden for kerner. Mens følsomme og slagkraftige, disse teknikker besidder en række begrænsninger.
Det er nødvendigt at understrege, at de data, der genereres fra 2.5D parceller, signal intensitet profiler og colocalization analyse er semi-kvantitative i naturen. På grund af punkt for punkt belysningen af prøven under image erhvervelse på laser scanning Konfokal mikroskop, registreres absolutte signal intensiteter af hver kanal. Men disse er ikke absolutte størrelser af 5hmC og 5caC at blive opdaget og kun repræsenterer angivelser af tilstedeværelsen, fraværet eller omfanget af disse epigenetiske mærker.
På grund af signal klarlægger repetitive karakter forvirre begrænsninger i overensstemmelse med omfanget af maskiner anvendt til at forbedre signalet uundgåeligt tilnærmelser af sande fysiske genomisk belægning af disse mærker34. Den sande genomiske lokalisering af disse mærker kan skjules af disse klodsede proteiner, som fysisk besætte områder uløselige selv ved optimal Konfokal opløsning grænserne for 200-300 nm34. Derudover kan ikke signal intensiteten af de individuelle kanaler for hver mark sammenlignes med hinanden på grund af forskelle i antistof følsomhed og fluorophore konjugation34. Men oplysninger indhentet med imaging kaster lys over den rumlige og tidsmæssige tilrettelæggelse af genomisk varemærker.
For nøjagtig kvantificering af 5hmC og 5caC signaler, er kerner fremhævet og omringede mod DAPI kontrastfarve, tydeligt afgrænser området der skal analyseres. Denne procedure giver afkald på kravet om kalibrering gating tærskler som baggrundsstøj er bort gennem den manuelle proces at vælge kerner1. En automatisering af denne proces kan opnås i den nyeste software, som giver mulighed for nukleare segmenteringen skal udføres. Mens gratis alternative software pakker såsom FIJI er tilgængelig for colocalization analyse, ulemper såsom kravet om at konvertere billeder til binære 8 bit formater, afmaske billeder og indrykke størrelse udstødelse dataene til at markere områder af interesse grænse i bruger-tilgængelighed af dette program. Derudover introducerer overvejer samlet begrænset niveauer af 5hmC og 5caC i genomet kombineret med deres fremherskende placering på euchromatic regioner og udtynding af genomisk CpG sekvenser i almindelighed, manuel omkranser af kerner brugeren-bias. Derfor, fremhævelse af kerner automatisk antager alle hændelser, som forekommer i det demarkerede region at være positiv og ignorerer eventuelle baggrundspixel, som kan være til stede. Således kan analysere billeder baseret på pixel intensitet være mere meningsfuld. Disse faktorer er vigtige, når de overvejer brugen af Mander’s colocalization koefficienten, analysere graden af rumlige overlapning mellem to signaler, uanset deres signal intensiteter som modsætter sig at Pearsons korrelationskoefficient, der forudsætter en lineær sammenhæng mellem signaler.
Samlet set bære de teknikker, der er skitseret her tema af visuel repræsentation af biologiske data i en intuitiv format. Mens semi-kvantitative billedanalyse ikke kan erstatter kraftfulde teknikker såsom massespektrometri følsomhed eller enkelt base opløsning genom bred sekventering, det giver supplerende data så slutninger og hypoteser til at være udtænkt af analyse af billeder med præcision.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet var støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council [BB/N005759/1 til A.R.]. NRFH blev finansieret af The Rosetrees Trust og The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskop, forarbejdning computere og software blev finansieret af BBSRC BB/L013827/1 (tværfaglig Super opløsning mikroskopi facilitet ved Nottingham University grant)
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
Microsoft Excel | Microsoft | NA |