Nyupptäckt oxiderat former av 5-metylcytosin (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) kan representera olika DNA ändringar med unika funktionella roller. Här beskrivs ett semikvantitativt arbetsflöde för visualisering av oxi-mCs’ rumsliga fördelning, signal intensiteten profilering och colocalization.
Under flera decennier, har 5-metylcytosin (5mC) varit tänkt att vara den enda DNA-modifieringen med en funktionell betydelse i metazoans. Upptäckten av enzymatisk oxidation av 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) samt detektion av N6-methyladenine (6mA) i DNA hos flercelliga organismer som tillhandahålls ytterligare frihetsgrader komplexitet att epigenetiska forskningen. Enligt en växande mängd experimentella bevis, kan dessa nya DNA-förändringar spelar specifika roller i olika cellulära och utvecklingsmässiga processer. Ännu viktigare, som vissa av dessa märken (e. g. 5hmC, 5fC och 5caC) uppvisar vävnad- och utvecklingstoxicitet scenen-specifika förekomsten hos ryggradsdjur, representerar immunkemi ett viktigt verktyg som möjliggör bedömning av rumslig distribution av DNA ändringar i olika biologiska sammanhang. Här beskrivs metoder för computational analys av DNA modifieringar visualiseras genom immunfärgning följt av konfokalmikroskopi. Specifikt generationen av 2,5 dimension (2.5 D) signal intensiteten tomter, signal intensiteten profiler, kvantifiering av färgning intensitet i flera celler och bestämning av signal colocalization koefficienter visas. Sammantaget kan dessa tekniker vara operativa i utvärdering av nivåer och lokalisering av ändringarna DNA i cellkärnan, bidrar till att belysa deras biologiska roller i metazoans.
DNA-metylering, en väldokumenterad mekanism som är associerad med inriktning mot transkriptionell reglering innebär ändring av cytosin rester i en 5′-cytosin-fosfat-guanin-3′ (CpG) dinukleotid sammanhang via tillägg av en metylgrupp (-CH3) 5- kolatomen av cytosin pyrimidin ringen att bilda 5-metylcytosin (5mC)1. Hos däggdjur, är cirka 70% av CpGs metylerat som utgör endast 1% av deras genom som de är uttömda av denna palindromic sekvens på grund av 5mC mutagena benägenhet att spontant deaminate till tymin2. Förekomsten av metylgrupper på arrangören gensekvenser visar stark korrelation med transkriptionell förtryck i ryggradsdjur3,4,5. Tillägg av dessa metylgrupper är katalyseras av mycket DNA metyltransferas (DNMT) enzymer DNMT3a, 3b och 3 L, och DNMT1 som ändra CpG cytosin i de novo och underhåll metylering sammanhang respektive6. DNMT3A/B uttryck är förhöjd under utveckling i embryonala stamceller och epiblast; men dess minskat uttryck observeras efter pluripotenta celler härstamning engagemang för somatiska öden under differentiering8. Samtidigt som jag delar funktionella redundans, visar DNMT3a och 3b vävnadsspecifika uttrycksmönster, med 3a upptäckt jämnt i musembryon men 3b huvudsakligen lokaliserad till neuroectoderm och chorionic ektoderm vävnader8.
Metylering signaturer kan ärvas under Mitos och meios10. Underhåll-metylering involverar DNMT1 underlättas modifiering av CpG cytosin rester befintliga i hemi-metylerat palindrom på dubbelsträngat DNA11. DNMT1 binder DNA på replikering gafflar11 och följaktligen genomisk metylering nivåer topp under S-fasen i cellcykeln12. DNMT1 methylates oförändrad cytosin därmed skilja nyligen syntetiskt DNA-strängar, främjande av x-kromosomen inaktivering och upprätthålla transkriptionell förtryck profiler13. Genom erkännande av hemi-metylerat DNA CpG sekvenser upprätthåller DNMT1 etablerade mönster av metylation som avgränsas av de novo metylering t.ex. förtryck av lång Interspersed nukleära Element 1 (LINE1) retrotransposon initiativtagare att hämma dess potentiellt cancerframkallande förökning14. Även om som har hemi-metylerat DNA förmånliga affinitet, kan DNMT1 methylate unmethylated CpG ön (CGI) sekvenser i DNMT3a/b – / – mutanta celler, uppfyller en akut de novo metylering roll15 . Således på grund delvis konservativ DNA replication16, kan underhåll metylering troget recapitulate metylering signaturer från förälder till dotter cell17.
Dock för gen måste uttryck vara dynamiskt modulerade, repressiv metylering ändring raderas, vilket kan uppnås genom passiva och aktiva demetylering mekanismer18. De tio-elva Translocase (TET) proteiner tillhör en bevarade familj av dioxygenas proteiner klarar av iterativa oxidation av metylgrupper på CpG rester19. Dessa Tet proteiner, homolog till J-bas-bindande proteiner (JBP) upptäcktes i Trypanosome bruceii, känna igen och binda modifierad DNA baser t.ex. 5mC och syresätta dessa rester till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) och 5 – carboxylcytosine (5caC)20. Tet protein underlättas oxidation av 5mC resultat i stegvis konformation förändring från metyl till hydroxyl, karbonyl och bildas konfigurationer, men 5fC och 5caC ändringar kan syntetiseras direkt från 5mC oxidation21, 22 , 23 , 24.
En informativ indikation av TET protein aktivitet förstå deras reglering studerar distribution och överflöd av oxi-metyl-cytosin märken. Betydande 5mC närvaro på CpG fattiga initiativtagare är detekterbara i motsats till unmethylated CpG rika regioner, den senare var kännetecken av CpG öar25. Som anger en differentiell metylering mönster förekommer vid vävnad specifika initiativtagare26över vävnader, högsta vävnad specifika metylering observeras i hjärnan, testiklarna och blod medan munslemhinnan uppvisar största hypometylering.
Genom att utnyttja känsliga anti-5mC och anti-5hmC visat antikroppar i selektiv metyl/hydroxymetyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) och efterföljande hög genomströmning sekvensering, Ficz et al. hög 5hmC beläggning på projektansökare, exoner och LINE-1 retrotransposon sekvenser som korrelerade med reducerad 5mC nivåer på dessa platser i mus embryonala stamceller celler27. Omvänt, observerades största 5mC anrikning vid repetitiva satellit sekvenser där 5hmC närvaro var begränsad28. Studier på mänskliga frontalloben hjärnvävnad avslöja mycket betydande 5hmC anrikning, fyra gånger högre än i mus embryonala stamceller28. I överensstämmelse med tidigare iakttagelser lokaliserade hög genomströmning sekvensering av frontalloben vävnad illustrerad majoriteten 55-59% av 5hmC signal vid låg densitet CpG arrangören regioner, 35-38% inom gen organ och cirka 6% beläggning på intergenic regioner. Däremot 5mC var berikad på intergenic regioner (25-26%) och högre inom gen organ (52-55%), men minskade (22-24%) på arrangören sekvenser29. Dessa studier visar överflöd av 5hmC i embryonala stamceller och somatisk vävnad, särskilt hjärnan, men utredningar på 5fC och 5caC distributioner är begränsade.
Intressant, nyligen upptäckt i Eukaryoter, metylering av adenin rester på 6 plats kvävet (N-6) (6mA) display en genomisk överflöd profil inversen med 5mC30. Observationer från vätskekromatografi kopplad tandem mass spectrometry avslöja 6mA absoluta nivåer finns i överskott i zebrafisk och svin tidiga embryon jämfört med spermier med dess nivåer (0,003% av genomisk adenines) ökar stadigt vid befruktning, topp på utvecklingsstadiet morula (33 gånger högre än spermier) och når steady-state somatiska nivåer 0,004% av genomisk adenines31. Immunoprecipitation 6mA berikad DNA-sekvenser har visat dominerande beläggning (cirka 80% anrikning) av detta märke på repetitiva inslag regioner och transkriptionell start platser32. Dessa observationer kontextualisera och validera upptäckten av 6mA demethylase-null embryonic stamceller uppvisar ackumulerade 6mA medierad linje-1 retrotransposon ljuddämpning jämfört med transcriptionally aktiva element i vildtyp celler. Dessa data tyder på en transkriptionell reglerande funktion för 6mA33.
Samtidigt konjugerade biokemiska Taggar kopplas till efterföljande dopp analyser indikerar närvaro eller frånvaro av oxiderat metylcytosin derivat (oxi-mCs), kan inte de förmedla rumslig distribution eller kvantifierbara information av dessa märken34, 35. ett protokoll för känslig immunokemisk detektion av 5hmC och 5caC var nyligen utvecklade36. Denna fluorophore konjugerat sekundära antikroppsbaserade immunfärgning metod tillsammans med utnyttja scanning laser konfokalmikroskopi besitter den unika fördelen av att ge visuell lokalisering av ändringarna DNA i cellerna, alltså betonar individuella färgade positivt eller negativt celler motsvarande med heterogena förekomsten av dessa märken. 5hmC och 5caC absoluta signal stödnivåerna aktivera som förstärks av de konjugerade antikropparna semikvantitativt tolkningar som föreslås om omfattningen och positioner av dessa märken inom kärnan e.g. heterochromatic och euchromatic regioner 37 , 38. här en teknik för computational analys av konfokalmikroskopi bilder beskrivs. Generering av 2.5D rumsliga fördelningen tomter för att visa olika 5hmC och 5caC signaltoppar per pixel och deras platser inom atomkärnor framgår. Histogrammet tomter av 5hmC och 5caC signal intensiteten profiler kan illustrera trender i överflöd av dessa märken som toppar och dalar är ritade som separata icke överlappande kanaler. Slutligen genom att implementera funktionen colocalization, graden av närhet av en signal till en annan kan bestämmas och till följd av detta, deras respektive genomisk koordinater kan identifieras.
Det här protokollet beskriver stegvis processen att skapa visuella representationer av DNA ändringar inom atomkärnor. Samtidigt känsliga och effektfulla, äger dessa tekniker ett antal begränsningar.
Det är nödvändigt att betona att de data som genereras från 2.5D tomter, signal intensiteten profiler och colocalization analys är semikvantitativt i naturen. På grund av punkt för punkt belysning av provet under bild förvärv på laser skanning confocal Mikroskop, registreras absoluta signal stödnivåer för varje kanal. Men dessa är inte absoluta magnituder av 5hmC och 5caC vara upptäckta och endast representera indikeringar av förekomsten, avsaknaden eller omfattningen av dessa epigenetiska märken.
Repetitiva pågrund av signal kompletteringar förvirra begränsningar överensstämmer med omfattningen av maskiner som tillämpas för att förbättra signalen oundvikligen approximationer av sann fysisk genomisk beläggning av dessa märken34. Sanna genomisk lokaliseringen av dessa märken kan skymmas av dessa skrymmande proteiner, som fysiskt upptar områden inte kan matchas även vid optimal confocal upplösning gränserna för 200-300 nm34. Dessutom kan signal stödnivåerna de enskilda kanalerna för varje märke inte jämföras med varandra på grund av skillnader i antikropp känslighet och fluorophore konjugation34. Men belyser informationen som erhållits med imaging den rumsliga och tidsmässiga organisationen av genomisk märken.
För noggrann kvantitering av 5hmC och 5caC signaler, är kärnor belyst och omringade mot den DAPI motfärg, tydligt avgränsar regionen ska analyseras. Detta förfarande avstår kravet på att kalibrera Usenets tröskelvärden som bakgrundsljud ignoreras genom den manuella processen av att välja kärnor1. En automatisering av denna process kan uppnås i den senaste programvaran som möjliggör nukleära segmentering som ska utföras. Samtidigt gratis alternativ programvara paket såsom FIJI finns för colocalization analys, nackdelar såsom kravet att konvertera bilder till binärt 8-bitars format, maskera bilder och inmatning storlek utslagning data för att välja områden av intresse gräns den användaren-tillgänglighet av detta program. Dessutom, introducerar med tanke på övergripande begränsade nivåer av 5hmC och 5caC i genomet tillsammans med deras dominerande placering vid euchromatic regioner och, utarmning av CpG genomsekvenser i allmänhet, manuell inringa atomkärnor användaren-bias. Därför markeringen av atomkärnor automatiskt förutsätter alla händelser som inträffar inom avgränsade regionen att vara positiv och bortser från eventuella bakgrundspixlar som kan förekomma. Analysera bilder baserat på pixel intensitet kan således vara mer meningsfull. Dessa faktorer är viktiga när man överväger användning av Mander’s colocalization koefficient att analysera graden av spatial överlappning mellan två signaler, oavsett deras signal stödnivåer som motsätter sig att Pearsons korrelationskoefficient som förutsätter en linjärt samband mellan signaler.
Övergripande, de tekniker som beskrivs här bär temat för visuell representation av biologiska data i en intuitiv format. Samtidigt semikvantitativt bildanalys inte kan ersätta kraftfulla tekniker såsom masspektrometri i form av känslighet eller enda bas resolution genome bred ordningsföljd, den ger kompletterande data vilket gör att slutsatser och hypoteser för att vara tänkt från analys av bilder med precision.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöds av bioteknik och biologiska Sciences Research Council [BB/N005759/1 till A.R.]. NRFH finansierades av The Rosetrees förtroende och The Stoneygate förtroende [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskopet, bearbetning datorer och mjukvara finansierades av BBSRC BB/L013827/1 (tvärvetenskapliga Super Resolution mikroskopi Facility på Nottingham University grant)
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
Microsoft Excel | Microsoft | NA |