Summary
Nouvellement découvert des formes oxydées de la 5-méthylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) peut-être représenter des modifications d’ADN distinctes avec des rôles fonctionnels uniques. Un workflow semi quantitatif pour la visualisation de la répartition spatiale des oxi-mCs, profilage d’intensité de signal et colocalisation est décrit ici.
Abstract
Depuis plusieurs décennies, 5-méthylcytosine (5mC) a été pensé pour être la seule modification de l’ADN avec une importance fonctionnelle de métazoaires. La découverte de l’oxydation enzymatique de 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) ainsi que la détection de N6-méthyladénine (6 ma) dans l’ADN des organismes multicellulaires fourni des degrés supplémentaires de complexité de la recherche épigénétique. Selon un nombre croissant de preuves expérimentales, ces nouvelles modifications de l’ADN peuvent jouer des rôles spécifiques dans différents processus cellulaires et développement. Ce qui est important, comme certaines de ces marques (e. g. 5hmC, 5fC et 5caC) pièce tissu - et développement spécifique au stade survenue chez les vertébrés, immunochimie représente un outil important permettant l’évaluation de la distribution spatiale des modifications de l’ADN dans la différents contextes biologiques. Ici, les méthodes d’analyse computationnelle des modifications de l’ADN visualisé par immunomarquage suivi par microscopie confocale sont décrits. Plus précisément, la génération de dimension 2,5 (2,5 D) parcelles de l’intensité du signal, signal apparaissent profils d’intensité, de la quantification de l’intensité en plusieurs cellules et la détermination des coefficients de colocalisation de signal de coloration. Collectivement, ces techniques peuvent être opérationnels pour évaluer les niveaux et la localisation de ces modifications de l’ADN dans le noyau, qui contribuent à élucider leur rôle biologique de métazoaires.
Introduction
Méthylation de l’ADN, un mécanisme bien documenté associé à la régulation transcriptionnelle entraîne la modification des résidus cytosine en 5'-cytosine-phosphate-guanine-3' contexte dinucléotide (CpG) via l’addition d’un groupement méthyle (-CH3) pour les 5 - atome de carbone du cycle pyrimidine cytosine pour former 5-méthylcytosine (5mC)1. Chez les mammifères, environ 70 % des GPC sont méthylés qui constitue seulement 1 % de leurs génomes, selon qu’ils sont épuisés de cette séquence palindromique en raison de la propension mutagènes 5mC à désaminés spontanément à thymine2. Présence de groupes méthyles sur les séquences de gène promoteur montrent la forte corrélation avec la répression transcriptionnelle dans vertébrés3,4,5. Ajout de ces groupes méthyle est catalysée par hautement conservée ADN méthyltransférase (DNMT) enzymes DNMT3a, 3 b et 3 L et DNMT1 qui modifient les cytosines CpG dans des contextes de méthylation de novo et entretien respectivement6. Expression de Dnmt3a/B est élevée au cours du développement dans les cellules souches embryonnaires et l’épiblaste ; Cependant, son expression diminuée est observée suite pluripotentes cell lineage engagement aux destins somatiques au cours de la différenciation8. Tout en partageant la redondance fonctionnelle, DNMT3a et 3 b affichent les modes d’expression tissu-spécifique, avec 3 a détecté uniformément dans des embryons de souris, mais 3 b principalement localisé en neuroectoderme et ectoderme chorionique tissus8.
Signatures de méthylation peuvent être héritées au cours de la mitose et la méiose10. Méthylation de l’entretien implique la modification DNMT1 a facilité des résidus de cytosine CpG existant dans palindromes hemi-méthylées sur bicaténaire ADN11. DNMT1 lie l’ADN en réplication fourchettes11 et par conséquent, la méthylation génomique niveaux pic au cours de la phase S du cycle cellulaire12; DNMT1 méthyle cytosines non modifiés ainsi distinguer des brins d’ADN nouvellement synthétisés, promotion d’inactivation du chromosome x et le maintien de répression transcriptionnelle profils13. Par la reconnaissance de séquences d’ADN CpG hemi-méthylé, DNMT1 maintient des profils établis de méthylation délimités par novo de méthylation par exemple répression de Long 1 entrecoupées d’élément nucléaire (ligne1) rétrotransposon promoteurs pour empêcher sa propagation potentiellement cancérigène14. Bien que possédant l’affinité de liaison préférentielle ADN hémi-méthylé, DNMT1 peuvent méthyler des séquences de l’île (CGI) CpG non méthylés dans les cellules mutantes DNMT3a/b - / - , remplir un rôle de la méthylation d’urgence de novo 15 . Ainsi en raison de la nature semi conservatrice de la réplication de l’ADN16, méthylation de l’entretien peut récapituler fidèlement des signatures de méthylation du parent à la cellule fille17.
Toutefois, pour gene expression méthylation modulé dynamiquement, répressif modification doit être effacée, qui peut être réalisé par déméthylation passive et active des mécanismes18. Les protéines de Translocase (TET) de dix-onze appartenant à une famille conservée des protéines dioxygénase sont capables d’oxydation itérative des groupes méthyles sur CpG résidus19. Ces protéines Tet, homologues à des protéines de liaison de J-Base (JBP) découverts en bruceii Trypanosome, reconnaître et de lier l’ADN modifié par exemple 5mC des bases et oxygéner ces résidus 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Protéines TET facilité oxydation des résultats 5mC dans changement de conformation progressive de méthyle aux configurations hydroxyle, carbonyle et carboxylate, mais des modifications 5FC et 5caC peuvent être synthétisées directement à partir de 5mC oxydation21, 22 , 23 , 24.
Une indication informative de l’activité de protéines TET à comprendre leur régulation étudie la répartition et l’abondance des marques oxi-methyl-cytosine. 5mC importante présence au CpG pauvres promoteurs est détectable par contraste avec les régions riches de CpG non méthylées, ce dernier étant caractéristique du CpG des Iles25. Dans l’ensemble de tissus, tissu plu spécifique méthylation est observée dans le cerveau, les testicules et les sang tandis que la muqueuse buccale pièce plus grande hypométhylation, indiquant un patron de méthylation différentielle se produisant à des tissus spécifiques promoteurs26.
Par utilisant anti-5mC sensibles et anti-5hmC anticorps en sélectif de méthyle/hydroxyméthyl ADN immunoprécipitation (meDIP/hmeDIP) et le séquençage subséquent à haut débit, Ficz et coll. démontre 5hmC haute occupation aux promoteurs, exons et LINE-1 séquences des rétrotransposons qui corrélé avec le niveau de réduction 5mC à ces endroits en souris embryonnaire souches cellules27. Inversement, plus grand enrichissement de 5mC a été observée à des séquences répétitives satellite où 5hmC présence était limitée28. Études réalisées sur des tissus cérébraux humains lobe frontal révèlent l’enrichissement 5hmC hautement significative, quatre fois plus élevée que chez les cellules souches embryonnaires de souris28. En concordance avec les observations précédentes, le séquençage à haut débit de lobe frontal tissus illustrés majorité 55 à 59 % du signal de 5hmC localisée à faible densité régions promotrices de CpG, 35 à 38 % au sein des organes de gène et environ 6 % d’occupation à intergénique régions. En revanche, 5mC s’est enrichi à régions intergéniques (25-26 %) et plus au sein des organes de gène (52-55 %), mais réduit (22-24 %) au promoteur séquences29. Ces études indiquent l’abondance des 5hmC dans les cellules souches embryonnaires et somatiques tissulaires, en particulier le cerveau, mais les enquêtes sur les distributions 5FC et 5caC sont limitées.
Fait intéressant, récemment découvert chez les eucaryotes, la méthylation des résidus adénine à l’azote position 6 (N6) (6 ma) Visualisez une abondance génomique profil inverse à celle de 5mC30. Observations de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse révèlent des niveaux absolus de 6mA d’exister en excès dans le poisson zèbre et porcines jeunes embryons par rapport au sperme avec ses niveaux (0,003 % des adénines génomiques) augmente régulièrement après la fécondation, atteignant le stade de développement de morula (33 fois plus élevée que les spermatozoïdes) et atteignant des niveaux de l’état stationnaire somatique de 0,004 % de génomique adénines31. Immunoprécipitation 6mA enrichi de séquences d’ADN a démontré occupation prédominante (environ 80 % d’enrichissement) de cette marque en régions élément répétitif et transcriptionnelle début sites32. Ces observations contextualisent et de valider la découverte de 6mA déméthylase null embryonic des cellules souches présentant 6mA accumulé médiée par LINE-1 rétrotransposon silencieux par rapport aux éléments transcriptionnellement actifs dans les cellules de type sauvage. Ces résultats suggèrent une fonction régulation transcriptionnelle pour 6mA33.
Tandis que les balises biochimiques conjugués couplés aux déterminations ultérieures de DIP indiquent présence ou absence de dérivés oxydés méthylcytosine (oxi-mCs), qu’ils ne puissent communiquer distribution spatiale ou informations quantifiables de ces marques34, 35. un protocole pour la sensibilité de détection immunochimique de 5hmC et de 5caC a été récemment mis au point36. Cette méthode d’immunomarquage de base d’anticorps secondaire fluorophore conjugué couplée avec utilisant la microscopie confocale à balayage laser possède l’avantage unique de fournir une localisation visuelle de ces modifications de l’ADN dans les cellules, ainsi, mettant l’accent sur différents positivement ou négativement colorées cases correspondant à la présence hétérogène de ces marques. Les intensités de signal absolu 5hmC et 5caC comme amplifiée par l’anticorps conjugués aux semiquantitative interprétations à proposer sur l’ampleur et les positions de ces marques dans le noyau par exemple les régions hétérochromatiques et euchromatiques 37 , 38. ici on décrit une technique pour l’analyse informatique des images de microscopie confocale. La génération de distribution spatiale 2,5 D parcelles pour l’affichage des 5hmC distincts et 5caC lueurs par pixel et leurs emplacements dans les noyaux est démontrée. Histogramme des parcelles de 5hmC et profils d’intensité signal 5caC peuvent illustrer des tendances dans l’abondance de ces marques comme les pics et creux est pointés comme des canaux séparés sans chevauchement. Enfin, en mettant en œuvre la fonction de colocalisation, le degré de proximité d’un signal à un autre peut être déterminé et en conséquence, leurs coordonnées respectives de génomiques peuvent être identifiées.
Protocol
1. génération des Images confocales
- en préparation pour l’analyse des formes modifiées de la cytosine, effectuer immunohistochemical souillant tel que décrit par la justice et al. 34.
- réaliser l’imagerie de coulisse à l’aide d’un microscope et d’enregistrer des fichiers dans un format LSM.
Remarque : Quand comparant intensité des profils entre les échantillons, les valeurs utilisées pour la puissance du laser et de gain pour chaque canal doit être maintenue tout au long de l’image en tenant la procédure pour permettre une comparaison directe au stade de l’analyse d’image.
2. Génération de 2,5 D intensité parcelles
- Ouvrez le logiciel (p. ex., Zen noir), puis sélectionnez ' Image Processing '.
- Allez dans le menu fichier et sélectionnez Ouvrir. Sélectionnez l’image qui nécessite un traitement.
- Cliquez sur ' afficher tout ' au-dessous de l’image à faire tous les contrôles graphiques visibles. Dans la moitié inférieure de l’écran, il y a trois onglets ; ' Dimensions ', ' affichage ' et ' graphique ', sélectionnez le ' graphique ' Tab
- Choisir le ' rectangle ' outil pour sélectionner les noyaux/domaine d’intérêt.
- Select ' couper la région ' de recadrer l’image. Cela va générer une nouvelle image pour la région rognée dans un onglet séparé
- Allez dans le menu fichier et sélectionnez Save As. donner un nom de fichier et enregistrez-le sous un fichier LSM ou CZI.
- Ouvrez le logiciel (p. ex., Zen bleu) et sélectionnez le ' Zen Desk '.
- Envoyer l’image recadrée de Zen Black Blue Zen en sélectionnant le fichier et en cliquant sur le menu fichier et sélectionnez Envoyer à l’édition 2012 de Zen-bleu. L’image recadrée ouvrira ensuite dans le programme pertinent.
Remarque : Le fichier image est transféré car la fonction de traçage de 2,5 D intensité en Zen noir 2012 n’affiche pas les images de canaux multiples simultanément. - Sur le côté gauche de l’image, choisissez l’onglet étiqueté ' 2,5 D ', cela permet la visualisation de l’image en 2, 5D. Cliquez sur ' afficher tout ' de faire tous les contrôles graphiques visibles.
- Alter paramètres de visualisation à l’aide de quatre barres grises situées à gauche et en dessous de l’image.
Remarque : barre gauche, haut de l’écran = zoom. Volet situé à gauche, en bas de l’écran = tourner l’image sur l’axe. Fond d’écran, main gauche bar = rotation de l’image. Fond d’écran, bonne main bar = dilater et se contracter échelle bars. - Veiller à ce que le mode de rendu choisi est surface car cela donne la meilleure visualisation des sommets individuels.
- Modifier la distance de la grille en modifiant le pourcentage, moins le pourcentage le plus défini chaque pic individuel.
- Pour enregistrer l’image de 2,5 D, abord masquer la liste de fichiers sur le côté droit et les outils graphiques de l’image ci-dessous en cliquant sur la flèche grise sous l’intrigue 2,5 D (à côté de ' afficher tous '), cela permet de masquer les onglets graphiques permettant l’image pour l’agrandir pour remplir les éboulis n. pour sauvegarder l’intrigue 2,5 D, appuyez sur la ' PrtSc ' touches sur le clavier. Cette capture une capture d’écran de l’écran. Collez la capture d’écran dans Microsoft Paint et recadrer l’image avant d’enregistrer.
3. Profilage d’intensité
- Ouvrez le logiciel (p. ex., Zen noir) et sélectionnez Image Processing.
- Allez dans le menu fichier et sélectionnez Ouvrir. Sélectionnez l’image qui nécessite un traitement.
- Comme l’image apparaitra sur l’écran, sur le côté gauche de l’image, sélectionnez l’onglet étiqueté ' profil '.
- Dans la partie inférieure de l’écran Sélectionner (cocher) les ' afficher tout ' onglet. Cela permettra d’accéder à toutes les options de formatage.
- Dans la moitié inférieure de l’écran, il y a trois onglets ; ' Dimensions ', ' écran ' et ' ProfileƆ select ' profil ' et sélectionner (cocher) les ' Table ' boîte. Sélectionnez le ' Arrow ' bouton.
- Sur l’image, utilisez la souris pour sélectionner un point de départ et faites glisser la souris sur un nombre continu de cellules. Relâchez le bouton de la souris pour produire un complot d’intensité pour les cellules le long de la ligne ; en outre la table sera remplie par les données de mesure d’intensité pour les pixels le long de la ligne pour chaque longueur d’onde.
Remarque : Le tableau fournira la distance (µm) à pixel intensité est lue pour la fluorescence rouge, verte et bleue. - Pour exporter ces données, faites un clic droit sur la table, sélectionnez ' enregistrer table … ' et l’enregistrer à un emplacement approprié comme un fichier .txt.
- Pour enregistrer l’image de profil d’intensité sélectionnée, sélectionnez le menu fichier et sélectionnez ' exportation … '. Dans le menu contextuel, choisissez ' Tagged Image File (Format) ' et ' contenu de la fenêtre d’Image - simple vitrage (données) ' puis en cliquant sur ' sélectionnez nom de fichier et enregistrer … ' choisir un emplacement approprié, puis cliquez sur ' enregistrer '.
- Répéter le processus pour chaque profil d’intensité différentes selon les champs de vision et le nombre de profils d’analyser.
- Importation intensité profils des données sauvegardées (voir 3.7) et analyser dans une feuille de calcul suivi d’analyse statistique.
4. Analyse de co-localisation
- Ouvrez le logiciel et sélectionnez ' traitement de l’Image '.
- Allez dans le menu fichier et sélectionnez Ouvrir. Sélectionnez l’image qui nécessite un traitement.
- Comme l’image apparaitra sur l’écran, sur le côté gauche de l’image, sélectionnez l’onglet étiqueté ' Coloc '.
- Dans la partie inférieure de l’écran Sélectionner (cocher) les ' afficher tout ' onglet. Cela permettra d’accéder à toutes les options de formatage.
- Dans la moitié inférieure de l’écran, il y a quatre onglets ; ' Dimensions ', ' écran ', ' graphique ' et ' ColocalizationƆ select ' colocalisation ' et cocher la case pour ' Table ' et ' Image '.
- , Sélectionnez la troisième icône le long dans la partie supérieure de cet onglet (Bézier proche texte s’affiche lorsque la souris survole l’outil) puis utilisez cet outil pour encercler un noyau unique, les valeurs de cette volonté de noyaux puis apparaissent dans le tableau.
Remarque : Pour chaque noyau entouré un diagramme de dispersion est produit pour rouge par rapport à fluorescence verte qui est visualisé dans le panneau de gauche sur l’écran. L’axe est alors déplacé pour les cellules selon le seuil de la porte. Comme les noyaux d’intérêt sont sélectionnés manuellement dans les images, l’adaptation des seuils de déclenchement au-dessus de zéro n’est pas nécessaire. Toutes les valeurs de pixel intensité observées dans les périmètres nucléaires sont considérés comme des signaux positif.
- , Sélectionnez la troisième icône le long dans la partie supérieure de cet onglet (Bézier proche texte s’affiche lorsque la souris survole l’outil) puis utilisez cet outil pour encercler un noyau unique, les valeurs de cette volonté de noyaux puis apparaissent dans le tableau.
- Répéter ce processus en sélectionnant la troisième icône dans l’onglet et encerclant les noyaux subséquents jusqu'à ce que le dataset est rempli.
- Pour exporter ces données, faites un clic droit sur la table, sélectionnez Enregistrer table et enregistrer à un emplacement approprié.
- Pour enregistrer l’image de la colocalisation, sélectionnez le menu fichier et sélectionnez ' exportation … ' puis choisissez ; Tagged Image File (Format) et ' contenu de la fenêtre d’Image – seul plan (données) ' puis en cliquant sur ' sélectionnez nom de fichier et enregistrez … ', choisissez un emplacement approprié, puis cliquez sur ' enregistrer '.
- Tracer des données de colocalisation dans une feuille de calcul suivi d’analyse statistique.
Representative Results
Pour déterminer la distribution spatiale des 5hmC et 5caC pour différencier les diapositives immunomarquage progéniteurs hépatiques pour ces modifications de l’ADN ont été projetés à l’aide d’un microscope.
L’analyse initiale de la distribution spatiale de ces oxi-mCs a été effectué par le biais de la génération des parcelles de 2,5 D intensité (Figure 1 a, 1 b). Les pics rouges et verts semblaient être bien définis avec la présence limitée de pics orange indiquant seulement un petit chevauchement des signaux 5caC et 5hmC. En accord avec ces résultats, les profils d’intensités 5hmC et 5caC dans la case correspondante ne coïncident pas fortement avec l’autre (Figure 1). Cela illustre que 5caC et 5hmC présentent des profils distincts de distribution nucléaire dans des progéniteurs hépatiques suggérant que l’oxydation du Tet dépendant de 5mC conduit à la génération des différents dérivés oxydés de cette modification de l’ADN en chromatine spécifique régions.
Pour comparer les niveaux de 5caC et 5hmC en Daoy médulloblastome et cellules épendymome BXD-1425EPN, immunomarquage pour ces oxi-mCs a été réalisée sur les deux échantillons dans les mêmes conditions expérimentales. Intensités des signaux 5caC et 5hmC ont ensuite été comparées à 20 profils générés dans les 3-5 cellules enregistrées pour chaque lignée cellulaire (Figure 2 a-2D). La quantification de ces résultats a révélé que BXD-1425EPN cellules affichent des taux significativement plus faibles de fois 5hmC et 5caC immunomarquage par rapport aux cellules Daoy (Figure 2D).
Compte tenu de deux canaux rouge (5hmC) et vert (5caC) qui peut être désigné comme R et G respectivement, coefficient de corrélation de Pearson (PCC) décrit le degré de chevauchement spatial et ségrégation Co de R & G en supposant que les deux marques existe dans un linéaire relation entre eux, précédé de statistique R34. Quadrature de la valeur de la PCC, notée R2 permet la mesure de la variation d’intensité de signal vert qui est influencée par l' intensité de signal rouge34. C’est superflu pour notre analyse de co-localisation 5caC vs 5hmC.
Pour examiner la distribution spatiale des 5caC et 5hmC dans l’indifférencié (Undiff) hiPSCs et de l’endoderme hépatique 24 heures (HE24) après l’induction, analyse de colocalisation de ces modifications de l’ADN a été effectuée sur les mêmes images confocales, avec des valeurs de R pour 20 noyaux analysés pour chaque lignée cellulaire (Figure 3 a-3 C).
La quantification de ces résultats ont démontré que le degré de colocalisation est significativement plus élevée (P < 0,05) dans HE24 par rapport aux Undiff (Figure 3C). Cela peut être attribuable à l’ampleur réduite de 5caC présence et donc son intensité de signal réduite dans les cellules Undiff.
Figure 1 : marquage immunohistochimique des progéniteurs hépatiques endoderme à 72 heures après induction de la différenciation. (A) coloration co 5hmC (rouge), 5caC (vert), des taches de compteur nucléaire DAPI (bleu). La flèche blanche en pointillés « B » indique la direction du profilage échantillonnés par le noyau, illustré dans 1C. Barre d’échelle représente 5 µm. canal rouge : gagner 800, laser 1 %. Circuit vert : gagner 750, laser 2,4 %. Canal DAPI : gagner 750, laser 2,6 %. (B), 2,5 D intrigue d’intensité 5hmC, 5caC, des signaux DAPI. Sommets individuels représentent les intensités du signal absolue de chaque pixel. Vues fusionnées et canaux individuels sont représentés. (C), l’intensité des profils 5hmC, 5caC, des signaux DAPI dans des progéniteurs hépatiques à 72 heures après induction de la différenciation. Intensités maximales ont été enregistrées selon les dimensions de la flèche blanche en pointillés « B » et sont indiquées par une flèche en pointillé noire, le long de l’axe des abscisses de profil intensité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse des 5hmC et 5caC signal intensités Daoy médulloblastome et lignées de cellules épendymome BXD-1425EPN. (A) la coloration par immunofluorescence de 5hmC (rouge) et 5caC (vert) dans les cellules Daoy et BXD-1425EPN. Des images ont été capturées avec 63 x huile d’immersion objectif, tous les deux avec les mêmes paramètres. Vues fusionnées et canaux individuels sont représentés. Barres d’échelle représentent 10 µm. canal rouge : gagner 746, laser 1 %. Circuit vert : gagner 750, laser 2,4 %. Des cellules Daoy (B) et (C) BXD-1425EPN individuelles sont développées en chiffres adjacents. L’échelle bars pour (B) et (C) représentent 5 µm. (D) de l’intensité de fluorescence moyenne des 5hmC vs 5caC signaux dans les cellules Daoy et BXD-1425EPN (n = 20, SD). Signification a été évaluée à l’aide d’un test F et deux échantillons t-test astérisques indiquent les p-valeurs statistiquement significatifs de ** p < 0,01 et *** p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse de colocalisation des signaux absolues, 5hmC et 5caC, dans hiPSCs indifférencié (Undiff) comparée à endoderme hépatique 24 heures post différenciée des progéniteurs (HE24). Images de microscopie confocale de (A) indifférencié hiPSCs et (B) HE24 cellules colorées pour 5hmC (rouge), 5caC (vert) et DAPI (bleu). Les cellules ont été projetés avec 63 objectif d’immersion X huile à réglages identiques. 20 noyaux encerclés illustrent les cellules prélevés pour l’analyse de la colocalisation. Barres d’échelle représentent 20 µm. canal rouge : gagner 800, laser 1 %. Circuit vert : gagner 750, laser 2,4 %. Canal DAPI : gagner 750, laser 2,6 %. (C) analyse de colocalisation de la présence du signal 5caC à portée de la proximité de 5hmC dans undiff et HE24 (n = 20, SD). Signification a été évaluée à l’aide d’un test F et deux échantillons t-test astérisques indiquent les p-valeurs statistiquement significatifs de * p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce protocole décrit le processus par étapes de génération des représentations visuelles des modifications de l’ADN dans les noyaux. Tandis que sensible et percutants, ces techniques possèdent un certain nombre de limitations.
Il est nécessaire de souligner que les données générées de 2,5 D parcelles, profils d’intensité de signal et analyse de colocalisation sont semi-quantitatifs dans la nature. En raison de l’éclairage point par point de l’échantillon au cours de l’acquisition d’images sur microscope confocal à balayage laser, intensités absolues signal de chaque canal sont enregistrées. Cependant, ce ne sont pas des magnitudes absolues de 5hmC et 5caC être détecté et seulement représentent des indications de la présence, l’absence ou l’échelle de ces marques épigénétiques.
En raison de la nature répétitive de l’amplification du signal, les limites compatibles avec l’ampleur des machines appliquées afin d’améliorer le signal inévitablement confondent approximations de la vraie physique occupation génomique de ces marques34. La vraie localisation génomique de ces marques peut-être être cachée par ces protéines volumineuses qui occupent physiquement des zones insolubles même à la limite de résolution confocal optimale de 200-300 nm34. En outre, les intensités du signal des canaux individuels pour chaque marque n’est pas comparable à l’autre en raison des différences de sensibilité des anticorps et fluorophore conjugaison34. Cependant les informations obtenues avec l’imagerie met en lumière l’organisation spatiale et temporelle des marques génomiques.
Pour le dosage précis des signaux 5hmC et 5caC, noyaux sont mis en évidence et encerclés contre le contre-colorant DAPI, délimitant clairement la région pour être analysés. Cette procédure dispense de l’obligation pour l’étalonnage des seuils de déclenchement comme bruit de fond n’est pas respectée par le biais du processus manuel de sélection des noyaux1. Une automatisation de ce processus peut être réalisée dans la dernière version du logiciel qui permet de segmentation nucléaire à être exécutée. Alors que les logiciels alternatifs libres paquets tels que Fidji sont disponibles pour l’analyse de la colocalisation, inconvénients tels que l’obligation de convertir les images aux formats binaires de 8 bits, masquage des images et l’entrée de données d’exclusion de taille pour sélectionner les régions d’intéressent limite la accessibilité de ce programme. En outre, compte tenu de que l’ensemble limité des niveaux de 5hmC et 5caC dans le génome couplé avec leur localisation prédominante à régions euchromatiques et, l’épuisement des séquences génomiques de CpG en général, manuel encerclant des noyaux introduit préjugé favorable aux utilisateurs. Par conséquent, la mise en évidence des noyaux automatiquement suppose que tous les événements qui se produisent dans la région délimitée comme positif et ignore les pixels d’arrière-plan qui peuvent être présents. Ainsi, l’analyse d’images basées sur l’intensité du pixel peut être plus significatif. Ces facteurs sont importants lors de l’examen de l’utilisation du coefficient de colocalisation de Mander d’analyser le degré de chevauchement spatial entre deux signaux, indépendamment de leurs intensités du signal que s’opposer au coefficient de corrélation de Pearson qui suppose une relation linéaire entre les signaux.
Dans l’ensemble, les techniques décrites ici portent le thème de la représentation visuelle des données biologiques dans un format intuitif. Alors que l’analyse semi-quantitative image ne peut pas supplanter puissantes techniques comme la spectrométrie de masse en termes de sensibilité ou de la simple résolution de base du génome large séquençage, il fournit des données complémentaires, ce qui permet des inférences et hypothèses d’être conçue à partir de l’analyse d’images avec précision.
Disclosures
Ne révélaient aucun conflit d’intérêt potentiel.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par Biotechnology and Biological Sciences Research Council [BB/N005759/1 à A.R.]. NRFH a été financée par The Rosetrees Trust and The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Le microscope Zeiss Elyra PS.1, le traitement des ordinateurs et des logiciels ont été financés par la BB/L013827/1 BBSRC (Super multidisciplinaire résolution Microscopy Facility à grant de l’Université de Nottingham)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
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