Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Muntlig Biofilm prøvetaking for Microbiome analyse i friske barn

Published: December 31, 2017 doi: 10.3791/56320
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Oral Surgery and Orthodontics, Department of Dental Medicine and Oral Health, Medical University of Graz, 2Division of Preventive and Operative Dentistry, Periodontology, Prosthodontics and Restorative Dentistry, Department of Dental Medicine and Oral Health, Medical University of Graz

Summary

Endringer i den muntlige microbiome i barndommen er av økende interesse. Sammenligning av ulike microbiome studier avslører mangelen på standardiserte Prøvetaking protokoller. Begrenset plass gjør prøvetaking lyd subgingival sulcus av barn utfordrende. Papir punktet prøvetaking er presentert her i detalj som metoden for valg for dette området.

Abstract

Muntlig biofilm og molekylære analyse gir grunnlag for å undersøke ulike tannlege forskning og klinisk spørsmål. Kunnskap om biofilm komposisjon fører til en bedre forståelse av cariogenic og periopathogenic. Mikrobiell endringer som skjer i munnhulen i løpet av barndommen er av interesse for flere grunner. Utviklingen av barn muntlig bakterieflora og endringer i komposisjonen må analyseres videre for å forstå og muligens hindre utbruddet av sykdommen. Samtidig, er avansert kunnskap om den naturlige sammensetningen av muntlig biofilm nødvendig. Tidlige stadier av karies uten permanent dentition med sunn tannkjøtt gir et mye upåvirket subgingival habitat som kan tjene som en i situ baseline for å studere oral helse og sykdom. Analyse av barns muntlig biofilm under ulike stadier i livet er dermed et viktig tema i feltet. Moderne molekylær analyseteknologi gir omfattende informasjon om bakteriell mangfoldet av slike biofilm. For å aktivere bakterieflora sammenligning av data, er det viktig å standardisere hvert trinn i prosedyren for molekylære data generasjon. Denne prosedyren spenner fra klinisk prøvetaking, neste generasjons sekvensering (NGS), bioinformatic databehandling til taksonomisk tolkning. En av de mest kritiske faktorene her er biofilm prøvetaking. Prøvetaking i barn er enda mer utfordrende spesielt på grunn av begrenset plass i subgingival områder. Derfor fokuserer vi på bruk av papir poeng for subgingival prøvetaking. Denne artikkelen inneholder en detaljert protokoll for muntlig biofilm prøvetaking av subgingival sulcus, mucosa og spytt i barn.

Introduction

Human muntlige biofilm består av et bredt fellesskap bestående hovedsakelig av commensals og gunstig mikroorganismer1,2,3. Arter her kolonisere alle nisjer at munnhulen tilbyr4,5,6. Biofilm komposisjon i disse nisjene varierer så bredt som habitatene. Spytt viser for eksempel forskjellige bakteriell profiler enn plakk prøver. I plakk prøver av friske voksne er den relative overfloden av Actinobacteria over 20%, mens mindre enn 7% er funnet i spytt. Bacteroidetes og Firmicutes vises i kontrast i mye høyere tall i spytt7. Derfor er det viktig å prøve på forskjellige steder i munnen for å få hele bildet. I tillegg gjør ulike faktorer som geografisk og etniske forskjeller, alder, kjønn og mange andre faktorer det vanskelig å identifisere generelle regler for biofilm utvikling og sykdom utbruddet8,9. I mange år har etterforskningen av periopathogenic og cariogenic biofilm vært en sentral bekymring8,10,11,12,13.

De siste årene fått forskning på friske betydning ikke bare for en bredere forståelse av sykdom, men også for gjennomføringen av forebyggende tiltak14. Nye teknologier og molekylære analyser ytterligere belyse muntlig biofilm dannes og funksjon15,16, og aktiverer komplett profilering av mikrobielle mangfold17,18. Forventes også føre til en ny forståelse av mikrobielle endringer under ortodontiske behandling19. Innvirkning på utviklingen av ortodontiske biologisk materiale er overskuelig. Forbedret perspektivet vil kaste nytt lys over komplikasjoner av ortodontiske behandling tilknyttet biofilm, som emalje demineralisering og periodontal sykdommer12,20,21. For å tillate verdensomspennende data sammenligninger, er det avgjørende å standardisere alle trinnene i data generasjon. Mindre endringer i laboratorium prosedyrer kan sterkt påvirke resultatene. I tillegg kan bruk av varierende beregningsorientert plattformer i databehandling føre til ikke-sammenlignbare datasett. Endelig har valg av statistiske tester og rettelser en innflytelse på resultatene. Men prøvetaking skjevhet kan allerede oppstå lenge før noen laboratoriearbeid eller bio-computing begynner. Ikke standardiserte Prøvetaking metoder føre til en iboende partisk studie. I lys av lav til moderat nivåer for standardisering i de relevante studiene finnes lite bevis på forholdet mellom kjeveortopedi og microbiomes19. Derfor vil utviklingen av standardiserte metoder lette kvalifiserte sammenligning av dataene i feltet.

Denne artikkelen presenterer standardisert muntlig biofilm utvalgstrekking. Protokollen er ment å bidra til å generere globalt sammenlignbare samlinger av mikrobielle sekvens databehandling. En trinnvis protokoll for muntlig biofilm prøvetaking i friske barn presenteres. Metoden valgfrihet er papir poeng satt inn atraumatically inn i lyden subgingival sulcus. For å lette habitat sammenligninger, Samples kinnet mucosa etter samme protokoll. Denne artikkelen viser i tillegg parallelle og grupperte prøvetaking. Videre vises saliva prøving. En enkel fargekodet transport og lagringssystem er også presentert, tilrettelegge prøven ledelse for videre behandling. Valg av nedstrømsvirksomhet om lagringsmedium, metagenomic analyser og bioinformatikk avhenger av klinisk spørsmålene fra ulike felt i muntlig forskning. I dette manuskriptet har DNA prøvetaking for NGS blitt valgt som et eksempel av en mulig for ortodontiske forskning.

Protocol

Protokollen og video skyting ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret medisinske universitet av Graz (Votum 27-126ex14/15). Skriftlig samtykke for video publikasjonen ble Hentet fra barnet og hennes overordnede.

1. instrumenter og materialer

  1. Kutt kalibrert (ISO 015/02) og sterile papir poeng, vanligvis brukes i endodontiske terapi, på det første ring-merket for å standardisere sine lengde (figur 1).
  2. Bruke UV lys irradiation 260 nm i 30 min for å unngå DNA og RNA forurensning av papir poeng (figur 2).
  3. Autoclave rør for lagring på 120 ° C og 1.2 bar for 20 min og UV-irradiate dem også eller ansette klar-å-bruke gamma irradiated rør.

2. forberedelse av fag

Merk: Skriftlig samtykke ble innhentet fra barnet og hennes foreldre før registrering.

  1. Bruke kakao smør på leppene.
  2. Montere kinnet og tungen festepunkt for full tilgang til begge dental buer.
  3. Stain dental plakk med plakett avsløring.
  4. Fjerne tørr feltet apparatet.
  5. Skyll munnen med vann inntil vannet er fargeløs.
  6. Børste tennene grundig med en elektrisk tannbørste på 45 ° angulation. Bruke vann bare ingen tannkrem, som dette ville endre den muntlige biofilm.
  7. Montere tørr feltet apparatet igjen, inkludert tunge vakten å holde munnen åpen og tørr.
  8. Ren og tørr indeks tennene med steril bomull vattpinner å unngå absorpsjon supragingival væske under papir punktet prøvetaking.

3. Biofilm prøvetaking

  1. Papir punktet prøvetaking av subgingival sulcus
    1. Forstå papir poeng med sterilt dental pinsett.
    2. Sett inn papir poeng tangentially opp til en definert lengde av 4 mm. Ta spesiell omsorg ikke traumatize junctional epitel (Figur 3).
    3. Fjern papir poeng etter 20 s.
    4. Samle papir poeng direkte inn forberedt rør: plassere papir punkt direkte i et sterilt og DNA-fri hetteglass, og kutte den på tredje merket en standardisert lengden på 4 mm (Figur 4).
    5. Hvis angitt av studien protokollene, kan du sette inn to papir poeng parallelle og samtidig på samme sted (figur 5A).
    6. Alternativt, samle papir poeng fra flere steder Hvis studie protokollen krever "gruppert samples" (figur 5B).
    7. Fjerne tørr feltet apparatet for slimhinnene og saliva prøving.
  2. Slimhinnene papir Velg prøvetaking
    1. Bruke papir poeng vestibular fold av øvre kinnet (figur 6).
    2. Lukk kinnet og massasje det kort.
    3. Åpne kinnet og fjerne papiret poeng etter 20 s.
    4. Kutt papiret poeng på tredje merket og plassere dem i et sterilt rør som angitt for subgingival prøvetaking.
  3. Saliva prøving
    1. La barnet spytte unstimulated spytt i en sterilisert samling fartøyet (figur 7).

4. overføring og lagring

  1. Samle papir poeng som enkelt, gruppert eller parallell prøver avhengig av studien design (Figur 8).
  2. Bruke et fargekodet lagringssystem for å lette videre eksempel administrasjonen (figur 9).
  3. Til slutt, lagre eksemplene på −80 ° C ventende microbiome analyse.

Representative Results

I den nåværende publikasjonen vises DNA prøvetaking for NGS som et eksempel av en mulig for ortodontiske forskning. Bakteriell DNA er hentet direkte fra papir punkt prøvene. Denne DNA kan brukes i studier av mikrobielle sammensetningen for klinisk eller forskning spørsmål (slik Figur 10).

Moderne molekylær analyse metoder som NGS metoden 454-pyrosequencing gir en oversikt over den komplette bakterieflora av en prøve. DNA av bakterier er identifisert samtidig på ulike Fylogenetiske nivåer over 16s rRNA sekvens forskjeller. Bioinformatic plattformer må genereres for strukturering i klynger informasjon Hentet fra de store datasettene. Statistisk analyse kan deretter brukes bakterieflora DataSet.

Samlet relative overflod av enkelte bakterielle arter kan analyseres kan endringer i bakterieflora på grunn av skiftende habitat forhold. Stolpediagrammer (Figur 11) og heatmaps (Figur 12) viser subgingival bakteriell sammensetningen på rekke nivå eller på nivået. Ulike individer og behandlinger kan sammenlignes med beskrivende og inferential statistikk. Figur 13 presenterer en histogrammet sammenligning av to moduser av subgingival papir prøvetaking på ulike taksonomiske nivåer. Tabell 1 viser skiftet i biofilm komposisjon under en i vitro studie sammenligne to tidspunkt (T1- og T3). Statistisk betydelige endringer ble beregnet med Diversified signert-rank test og følgende Bonferroni korreksjon fra 454-pyrosequencing data.

Til slutt, rektor Coordinate analyse (PCoA) kan direkte 3D sammenligning på operative taksonomisk enhet (OTU) nivå som er identifisert i forskjellige prøver. PCoA tomter i figur 14 vise intra - og inter - individual forskjeller i subgingival microbiome i en sak serie av fem barn. Figur 15 , viser resultatene av en ortodontiske case-kontroll studie: rosa til røde prikkene er tilfeller, er lys til mørk blå prikker kontrollene, alle samplet gjentatte ganger over en periode på fire måneder. En klar klynging tilfeller etter ortodontiske intervensjon (røde prikker) representerer et skifte i microbiome. Blå prikker, representerer kontrollgruppen, fordeles jevnt.

Figure 1
Figur 1 : Forberede papir poeng av standardiserte lengder. Sterilt kalibrert papir poeng er kuttet på første ring merket å standardisere sine lengde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Sterilize og gratis papir peker DNA. Standardisert papir poeng er sterilisert og UV bestrålt i en ren benk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Subgingival papir punkt innsetting. Sterilt kalibrert papir poeng inn tangentially subgingival sulcus til 4 mm ring merke for 20 s.

Figure 4
Figur 4 : Kutte papiret punkt inn røret. Direkte etter prøvetaking, papir poeng er kuttet på tredje ring merke (4 mm) i et sterilt og DNA-fri 1,5 mL flaske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Gruppert og parallelle prøvetaking. To papir poeng settes samtidig i den subgingival sulcus en tann (A) eller flere papir punkter i de subgingival sulci flere tenner (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Mucosal prøvetaking. Sterilt kalibrert papir poeng legges til mucosa i vestibulærsystemet fold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Spytt samling. Unstimulated spytt er spytte i et sterilt beger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Sampling ordningen. Eksempler kan samles som enkelt (venstre side, en tann) samlet (flere til alle striper i en flaske) eller parallell (blå striper, to papir poeng på en tann) prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 : Fargekodet lagring. En henvisende fargekode for ark og ampuller muliggjør ytterligere prøve håndtering.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 : Subgingival biofilm analyse. Skjematisk presentasjon av klinisk biofilm prøvetaking (A), DNA utvinning (B) og ulike NGS teknologier (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11 : Stolpediagrammet. Viser relative overflod av bakterier på rekke nivå analyseres med 454-pyrosequencing. Bildet endres fra Santigli et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12 : Heatmap. Viser relative abundances av bakteriell bestillinger analysert ved hjelp av 454-pyrosequencing. Mørk rød representerer en høy relative overflod (> 10%). Mørk blå representerer en svært lav til ingen relative overflod av bakteriell rekkefølgen. Bildet endres fra Santigli et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13 : Histogrammet. Sammenligning av to moduser av papir peke utvalg (modus A og B) på ulike taksonomiske nivåer. Data som er generert med 454-pyrosequencing. Bildet endres fra Santigli et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 14
Figur 14 : 2D PCoA tomt. En sak serie (n = 5) viser intra individuelle og inter-individuelle forskjeller som følge av to subgingival Prøvetaking metoder (1 farge er 1 emne). Data som er generert med 454-pyrosequencing. Bildet endres fra Santigli et al. 22 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 15
Figur 15 : Bilde av en 3D PCoA plot animasjon. Viser subgingival microbiome skift i en ortodontiske tilfelle kontroll studie (n = 16; hver grupper, 3 poeng i tid; tilfeller: rosa til rød, kontroller: lys til mørk blå). Data som er generert med 454-pyrosequencing.Upubliserte data fra gruppe Santigli. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Gruppe (biologi): Bacteriae Punkt 1 [%] Punkt 3 [%] Diversified signert-rank test
Rekke/slekt 25 Median 75 25 Median 75 p-verdien p-verdien justert #
Andre
Andre 0.70 1,07 1,28 1.32 1,63 1.93 .000 .005
Actinobacteria
Actinomyces 0,00 0,04 0,13 0,06 0,30 0,97 .001 .021
Rothia 0,00 0,00 0,05 0,00 0,13 0,32 .001 .009
Bacteroidetes
Prevotella 0,00 0,01 0.22 0,15 1.02 2.44 .000 .006
Firmicutes
Andre (bakterier) 0,00 0,01 0,06 0,00 0,04 0,10 .706 1.000
Stafylokokker 0,00 0,01 0,12 0,00 0.07 0,17 .548 1.000
(Gemellaceae) 0,00 0,00 0.07 0,12 0.77 1.24 .005 .091
(Lactobacillales) 0,00 0,00 0,04 0,00 0,12 1.50 .004 .073
Granulicatella 0.09 0,23 0,37 0.64 1,59 2.28 .000 .003
Melkesyrebakterier 0,00 0,00 0,18 0,00 0,00 0,04 .700 1.000
Andre (Streptococcaceae) 0,00 0,04 0,13 0,00 0,10 0,19 .768 1.000
(Streptococcaceae) 0,04 0,10 0,23 0,12 0,37 0.69 .005 .083
Streptokokker 53.42 61.96 88.38 48.44 60.83 73.97 .055 .930
Andre (Lachnospiraceae) 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,11 .003 .058
Dialister 0,00 0,00 0,04 0,00 0,00 0,04 .240 1.000
Veillonella 3.43 27.15 42.78 6.69 13.38 27.05 .157 1.000
Proteobacteria
Haemophilus 0,00 0,00 0,03 0.31 0.84 2,38 .000 .008
#p-verdien Diversified signert-rank test justert ifølge Bonferroni korreksjon
En p < 0.0026 ble ansett som vesentlige

Tabell 1: Statistisk analyse. Forskjeller i muntlig microbiome av friske barn ved to punkter i tid. Data som er generert med 454-pyrosequencing. Bildet endres fra Klug et al. 23

Discussion

Bakterier er funnet på alle områdene i munnhulen24,25,26. Mange studier har fokusert på bruk av spytt som prøvetaking medium tilordne muntlig kolonisering som det lett kan bli samplet gjennom spytter27,28,29,30,31, 32. Salivary biofilm gjenspeiler imidlertid ikke subgingival biofilm komposisjon. Dermed bruk av andre Prøvetaking metoder er avgjørende for å lage hele bildet, og vil fremkalle nye diskusjoner i dental forskning. Flere artikler sammenligne bruken av curettes og papir poeng for subgingival utvalg av periodontally syke fag8,33,34. Ingen forskningsgruppe kjent ennå har fokusert på anvendelse av standardiserte prøvetaking enheter for ulike aldersgrupper, spesielt for barn19.

I denne videoen presenteres muntlig biofilm utvalg av tre muntlig habitater på friske barn.

Endringer og feilsøking:

Målet med manuskriptet fokuserer på klinisk protokollen for subgingival biofilm utvalg av friske barn. Metoden for valg refererer til lyd subgingival sulci der begrenset plass gjør prøvetaking spesielt utfordrende. I denne videoen ble metoden brukt til tidlig permanent dentition. Det kan også brukes til å blandet eller eldre dentition og barn og/eller voksne. Våre sampling metoden gjør endringer som enkelt-eller gruppert. Sistnevnte kan bli en avgjørende faktor for molekylær analyser på grunn av den lille mengden av DNA collectable fra den sunn subgingival sulcus. Valg av indeks tennene kan endres etter behov. en annen tann kan spesielt være samplet som et alternativ når epitel er traumatisert og blødning, dermed papir poenget ubrukelig. Parallell prøvetaking bruke to papir poeng samtidig på ett nettsted gjengir eksempel replikat i ett trinn, i tillegg til raskere stol tid for barn.

Med små modifikasjoner kan syke og minsker lommer samplet. Her må papir poeng settes til hele lengden av lommen, som kan nå opp til 10 mm. Lengden og conus papir poeng og dybden av innsetting må tilpasses intraoral habitat rundt, men bør alltid være standardiserte av materialer og dimensjoner. Eksempler kan også hentes fra mucosa bruker papir poeng. Identiske protokoller gjør sammenligninger av ulike muntlige habitater og ulike tannlege materialer. Pasienten forberedelse og prøve lagring kan utføres som beskrevet i denne videoen. For metatranscriptome forskning, kan RNA prøves med samme metode. Dermed etter prøvetaking, skal papir punktene settes inn direkte i RNA stabilisering løsning.

Begrensninger av teknikken:

Uansett modifikasjoner er klinisk sampling metoden vi beskriver begrenset til den lyd subgingival sulcus. Andre målestasjoner, som for eksempel periodontally syke lommer, var ikke en del av vår studie. Prøvetaking til full dybden av slike lommer er nødvendig papir poeng kan ikke være stor nok til å samle inn eksempler tilstrekkelig. Hvis eksperimentelle målet er å sammenligne data samplet lyd subgingival sulci og periodontally syke lommer, er det viktig å være klar over det iboende skjevhet som er knyttet til forskjellige kliniske Prøvetaking metoder. Det derfor er ikke tilrådelig å sammenligne slike data.

En begrensning av metoden presenteres her prøvetaking uten påfølgende bruk av propidium monoazide. Legger til denne agenten direkte etter prøvetaking gir konkrete analyser bare levende cellene i biofilm analysert. Sampling metoden beskrevet her gjenspeiler antall levende og døde celler. For forskning av alvorlig periodontitt må papir poeng sannsynligvis erstattes av curettes, biofilm formasjon i dype lommer er sterk. Papir punktet prøvetaking ikke kanskje reflektere hele mikrobiell spekteret i disse tilfellene som deres overflaten kan være mettet for fort.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder:

Foreslåtte manuskriptet er først av sitt slag å standardisere subgingival prøvetaking i den sunne sulcus med papir poeng. Andre rapporter har referert til bruk av metall curettes35,36 eller papir poeng 37,38,39, men ikke beskrive prosessene som finner sted før prøvetaking, slik plakk kontroll, tann rensning, tann isolasjon og tørking, og prosessene som skyldes utilstrekkelig spesifikasjoner på prøvetaking teknikk og tid linjer.

I to tidligere artikler viser vi at bruk av papir poeng er en reproduserbar metode for subgingival biofilm prøvetaking i barn22,40. På grunn av deres design er curettes for stor for den grunne sulcus med begrenset plass og også skarp for anbudet junctional epitel. Det er avgjørende å adgang det subgingival sulcus uten traumatisk epitel. På denne måten unngås skjevhet som følge av blødning. Dermed er bruk av slim og ømme punkter foretrukket for dette området. Papir er funksjonell å overvåke endringer i biofilm komposisjon under ortodontiske behandling21,41. De er slank og fleksibel nok til å passe mellom elementene i faste ortodontiske apparater. Dette er en stor fordel til andre Prøvetaking metoder som curettes. Atraumatiske prøvetaking er forenklet og utvalg av små mengder DNA er mulig.

Fremtidige programmer:

I denne videoen viste vi metoden på ikke-syke, tidlig, permanente dentition. Det kan også brukes på blandet eller eldre dentition. Med en er det mulig å prøve periodontally syke nettsteder som tenner eller implantater og andre nisjer på grunn av dentale materialer ved å følge samme protokoll. Karies forskning kan ha nytte av denne standardisert protokollen, i bestemt studier på roten tannråte. Den viktigste foredraget fra våre prøvetaking video er standardisering av protokoller for å gjøre data tilsvarende, uansett hva og hvordan prøver måles.Fremtidige video demonstrasjoner kan styrke feltet av klinisk prøvetakingen generelt.

Muntlig biofilm oppnås som vist i videoen brukes i klinikker og vitenskapelige undersøkelser. Denne i vivo representerer et godt tillegg til i vitro molekylær teknikker som fluorescens i situ hybridisering og AC confocal mikroskopi15for laserskanning. NGS metoder, tillate som pyrosequencing vist her, brukes den innsamlede biofilm, analyse av den komplette bakterieflora. Beregne den relative abundances av enkelte bakterielle arter kan brukes til å støtte behandlinger eller sammenligne pasienter eller forskjellige behandlinger. Sammen med en standardisert sekvensering protokollen og rekkefølgen analyse arbeidsflyt som vi har tidligere beskrevet40, denne sampling metoden tillater sekvens analyse ned til slekten nivå. Videre "meta"-studier som metatranscriptomic eller metabolomic studier er mulig basert på prøvetaking protokollen presentert i denne videoen.

Avgjørende skritt:

Unngå forurensning er et kritisk punkt: sterile instrumenter må installeres i et ikke-sterilt i vivo -miljø. Overføring fra munnen til benken må utføres raskt og sikkert av en erfaren sensor å holde stol tid for deltagerne så kort som mulig. Det viktigste trinnet i protokollen er atraumatiske innsetting av papir poenget inn den subgingival sulcus. Avbrudd i junctional epitel og blødning absolutt må unngås. Ytterligere omsorg må tas for å ikke forurense papir poeng og lagring ampuller med eksogene DNA eller RNA. Lagring seg deretter er også et avgjørende skritt. Prøvene skal fryses direkte, i beste fall på −80 ° C. Dette unngår endringer i bakteriell komposisjon innlegget sampling, noe som ville forfalske sekvensering resultater.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen konflikter av interesse knyttet til denne vitenskapelige videoproduksjon.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlig til Joachim Theussl (Center for medisinsk forskning, medisinske universitet av Graz) for utmerket teknisk assistanse i video produksjon og Monica Farrell (Research Management, medisinske universitet av Graz) som tale talent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paper Points Taper .02, sterilised VDW Dental 550 029 015 http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash=
1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g GC EUROPE N.V. 000387 http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22
Rondells blue DIRECTA AB Rondell Tablets http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767
Great Lakes Nola Dry Field System Great Lakes Ortho 300-401 http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626
tooth brush Oral-B http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro
micro-Ident plus11 Hain Lifescience GmbH 23312 http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html
ParoCheck Greiner Bio One International GmbH 460020 https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/
Carpegen Perio Diagnostik Carpegen GmbH http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml Lactan CH77.1  to CH81.1 www.lactan
cotton swabs Henry Schein 9003182 www.henryschein.at

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paster, B., et al. Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque. J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).
  2. Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
  3. Ledder, R., et al. Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease. Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).
  4. Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities. BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).
  5. Alcaraz, L. D., et al. Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics. Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).
  6. Dewhirst, F., et al. The Human Oral Microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  7. Keijser, B. J. F., et al. Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults. Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).
  8. Könönen, E., Müller, H. Microbiology of aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).
  9. Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. Global diversity in the human salivary microbiome. Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).
  10. Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).
  11. Ouhara, K., et al. Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).
  12. Belda-Ferre, P., et al. The oral metagenome in health and disease. ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).
  13. Holt, S., Ebersole, J. Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis. Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).
  14. Gomez, A., Nelson, K. The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health. Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).
  15. Klug, B., et al. Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy. J Vis Exp. , e2967 (2011).
  16. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J Vis Exp. , (2016).
  17. Kilian, M., et al. The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals. British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).
  18. Razzouk, S., Termechi, O. Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy. J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).
  19. De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review. Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).
  20. Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems. Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).
  21. Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat? Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).
  22. Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children. Frontiers Microbiol. 7, 2142 (2017).
  23. Klug, B., et al. From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth. Frontiers Microbiol. 7, 1448 (2016).
  24. Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis. J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).
  25. Zijnge, V., et al. Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth. PLoS ONE. 5 (2), e9321 (2010).
  26. Diaz, P. I., et al. Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities. Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).
  27. Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing. J Vis Exp. , (2014).
  28. Hodgson, N., Granger, D. Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers. J Vis Exp. , e50815 (2013).
  29. Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition. Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).
  30. Nasidze, I., et al. Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches. Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).
  31. Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications. Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).
  32. Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry. J Vis Exp. , e4108 (2012).
  33. Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette. Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).
  34. Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition. Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).
  35. Papaioannou, W., et al. The microbiota on different oral surfaces in healthy children. Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).
  36. Abusleme, L., et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).
  37. Griffen, A., et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing. ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).
  38. Jünemann, S., et al. Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing. PLoS ONE. 7 (8), e41606 (2012).
  39. Cortelli, J., et al. Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition. European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).
  40. Trajanoski, S., et al. Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children. JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).
  41. Jongsma, M., et al. Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials. Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).

Tags

Medisin problemet 130 Subgingival mucosal papir peker prøvetaking muntlig biofilm spytt bakterieflora microbiome barn kjeveortopedi
Muntlig Biofilm prøvetaking for Microbiome analyse i friske barn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santigli, E., Koller, M., Klug, B.… More

Santigli, E., Koller, M., Klug, B. Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children. J. Vis. Exp. (130), e56320, doi:10.3791/56320 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter