Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

Abstract

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind reife Leukozyten, die eine wichtige physiologische Rolle als professionelle Phagozyten in der Lage, der clearing-einer Vielzahl von Teilchen dienen. Normalerweise BMDMs werden daran gehindert, das zentrale Nervensystem (ZNS), aber nach einer Verletzung können sie ohne weiteres zu infiltrieren. Einmal eignen sich in das verletzte Gewebe CNS, BMDMs Primärzelle verantwortlich für die Abfertigung von Verletzungen abgeleitet Zelltrümmer, einschließlich große Mengen an Lipid reichen Myelin Schutt. Die neuropathologische Auswirkungen BMDM Infiltration und Myelin Schutt Phagozytose innerhalb des ZNS sind komplex und nicht gut verstanden. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die direkten in-vitro- Untersuchung der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung. Wir decken murinen BMDM Isolierung und Kultur, Myelin Schutt Vorbereitung und Tests um BMDM Myelin Schutt Phagozytose zu beurteilen. Diese Techniken robuste quantifizierbare Ergebnisse ohne signifikante spezialisierte Geräte oder Materialien zu produzieren, aber können leicht angepasst werden, um die Bedürfnisse der Forscher.

Introduction

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunsystem. Als antigenpräsentierende Zellen (APCs) sie können mit Lymphozyten über beide Antigenpräsentation kommunizieren und Cytokine release1,2,3. Ihre primäre Funktion ist jedoch als professionelle Phagozyten, Krankheitserreger, gealterten Zellen und Zelltrümmer1,4löschen. Nach einer Rückenmarksverletzung ("SCI") ist verantwortlich für CNS Axon Myelinisierung5Zelltyp erhebliche Mengen von Myelin Schutt von sterbenden Oligodendrozyten generiert. Wir und andere haben gezeigt, dass Clearance von Myelin Schutt in erster Linie die Verantwortung der Infiltration BMDMs5,6,7. Allerdings wurde in Verletzung des Rückenmarks Websites Engulfment von Myelin Schutt vorgeschlagen, diese normalerweise entzündungshemmenden Zellen auf einer Pro-entzündliche Zustand5,8,9verschoben. Als wichtige Vermittler von Neuroinflammation im verletzten Rückenmark sind BMDMs wichtige klinische Ziele.

Um den Einfluss der BMDMs im verletzten Rückenmark untersuchen zu helfen, haben wir eine in-Vitro -Modell, um direkt zu studieren, wie BMDMs auf Myelin Schmutz reagieren entwickelt. Zur Verbesserung der biologischen Relevanz sind primären murinen BMDMs und frisch isolierte Myelin Ablagerungen in diesen Untersuchungen verwendet. Als solche, die hier vorgestellten Methoden auch detailliert die Isolation und die Kultur der primären murinen BMDMs und eine modifizierte Saccharose gradient Technik, murine CNS isolieren abgeleitet Myelin Schutt10,11,12. Myelin Schmutz kann leicht beschriftet werden, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), zu verfolgen, die die Internalisierung von BMDMs. CFSE-für diese Anwendung geeignet ist, denn es ist nicht zytotoxisch und seine schmalen Fluoreszenzspektrum Genehmigungen Multiplexen mit anderen fluoreszierende Sonden13,14. Nach Phagozytose Myelin Schutt Lipide sind durch den Lysosomen transportiert und als neutralen Lipiden in intrazellulären Lipid Tröpfchen5verpackt. Um diese intrazellulären Lipid-Ansammlung zu quantifizieren, präsentieren wir ein Öl rot O (ORO) Färbung Methode optimiert für quantitative Bildanalyse. Diese einfache Färbung Methode produziert robuste reproduzierbare Ergebnisse und Quantifizierung15. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Myelin Schutt Phagozytose und Lipid-Aufbewahrung mit begrenzten Spezialausrüstung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die Methoden hier beschrieben und in Abschnitt 2 von der Florida State University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und folgt die Vorgaben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren,8 Auflage . Alle Tiere, die in diesem in diesem Protokoll verwendeten sind Haus in einem speziellen Labor Tier bis zur Verwendung. Keine in-Vivo -Experimente wurde durchgeführt vor opfern. Tierzahlen beruhten auf experimentelle Notwendigkeit durchschnittliche Zelle und Myelin Sammlungen als Leitfaden verwenden, um die Nutzung zu minimieren.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Generation von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) (Abschnitt 1), die Vorbereitung von Eindringmittel beschrifteten Gehirn abgeleitet Myelin Schutt (Abschnitt 2), das allgemeine Verfahren für die Analyse von Myelin Schutt Phagozytose (Abschnitt 3), und das allgemeine Verfahren für die Analyse der Myelin Schutt Lipid Akkumulation (Abschnitt 4). Reagenz-Vorbereitung, Zelle Ernte und Manipulation, Myelin-Sammlung und Kennzeichnung und Testleistung sollte in einem laminaren Luftstrom Biosafety Kabinett abgeschlossen sein.

1. Generation der primären Knochenmark stammenden Makrophagen

  1. Erstellung von kompletten Makrophagen Kulturmedium (CMCM)
    Hinweis:     Makrophagen-Generation aus dem Knochenmark erfordert den Einsatz von Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF). Dieses Präparat nutzt L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien als Quelle für M-CSF.
    1. Generieren Sie L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien durch Kultivierung Zellen in 145 mm Schalen mit 50 mL des hohen Glukose (4500 mg/L L-Glukose) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 7 Tage mit 5 % neue geboren Kälberserum (NCS) und Penicillin/Streptomycin ergänzt.
    2. Sammeln Sie Medien aus Kulturen in 50 mL konische Zentrifuge Röhren und Zentrifuge für 30 Minuten bei 3500 X g, 4 ° C.
    3. Filtern Sie Überstände durch einen 0,2 µm Spritze Filter in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL. Konditionierte Medien können bis zu 6 Monaten bei-80 ° C aufbewahrt werden.
    4. Um hohe Glukose DMEM, fügen Sie 5 % Vol/Vol NCS, 15 % Vol/Vol L929 murine Fibroblasten bedingt DMEM und 1 % Penicillin/Streptomycin. Medien können 2-3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.
  2. Sammlung von primären Knochenmark-Zellen und Makrophagen Induktion
    Hinweis: Mit diesem Protokoll eine Maus erzeugt etwa 20 Millionen Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs).
    1. Einschläfern Sie die gewünschte Anzahl von 8-10 Wochen alte Mäusen mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien durch zervikale Dislokation gefolgt.
    2. Desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol (Vol/Vol): H2O, das Fell zu sättigen.
    3. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den Bauch und ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um das darunter liegende Gewebe sichtbar zu machen. Achten Sie darauf, keine Punktion der Bauchhöhle.
    4. Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte beginnend und endend am Knöchel. Ort der gesammelten Gewebe in eine 100 mm Petrischale mit 5-10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin.
      Hinweis: Beim Verarbeiten mehrerer Tiere achten, Gerichte auf Eis, Gewebe Abbau zu begrenzen zu halten.
    5. Entfernen Sie Muskel- und Bindegewebe aus dem Knochen mit einem Skalpell. Nur das Femur und Tibia dienen zur Zellentnahme, die Fibula verworfen werden kann.
    6. Aussetzen des Knochenmark-Hohlraums der gesammelten Knochen durch einen kleinen Ausschnitt von jedem Ende mit einem Skalpell zu trimmen.
    7. Mit einer 25g Nadel, spülen Sie das Knochenmark Hohlräume mit CMCM in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Die Knochen werden weiß angezeigt, sobald sie ausreichend geleert wurden.
    8. Nach Abschluss der Sammlung agitieren Sie Aspiraten mit einer Nadel 18g für 30-90 s erzeugt eine einzelne Zellsuspension.
      Hinweis: Ein optionale Erythrozyten (RBC) Lyse Schritt kann zu diesem Zeitpunkt ausgeführt werden. Es wurde vor kurzem vermutet, dass die intrazelluläre Eisengehalt der Auswirkungen von Myelin Schutt auf Makrophagen Polarisation16beeinflussen kann. Informationen über die Einbeziehung von RBC Zerstörung Schritt finden Sie unter Trouplin Et Al. 17.
    9. Filtern Sie die Aussetzung durch eine 70 µm sterile Zelle Sieb in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL.
    10. Samen Zellen gleichmäßig in 145 mm Zelle Kultur Speisen mit 15-20 mL CMCM gesammelt. Verwenden Sie ca. drei Kultur Gerichte per Mausklick geopfert. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2Kulturen.
    11. Nach 72 Stunden Platten einmal mit sterilen PBS waschen, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie dann 15-20mL frische CMCM. Weitere 4 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Kulturen. Nach 7 Tagen der gesamten Kultur werden die blutbildenden Knochenmarkzellen zunächst isoliert Reifen BMDMs (Abbildung 1).

2. Generation von Eindringmittel beschrifteten Brain-Derived Myelin Schutt

Hinweis: Alle Reagenzien können bis zu 1 Monat bei 4 ° C aufbewahrt werden.

  1. Vorbereitung von Myelin Schutt Sammlung Reagenzien
    1. Tris· vorbereiten CL-Pufferlösung.
      1. 800mL hinzufügen destilliertem entionisiertem H2O (DdiH2O), 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7,45 (20 mM Endkonzentration) und 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM Endkonzentration).
      2. Stellen Sie ein pH-Wert um 7.45 Uhr. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 mL mit DdiH2O. Filter-Lösung durch einen 0,2 µm Filtrationseinheit.
    2. Bereiten Sie 1 M Saccharoselösung.
      1. Auf 100 mL Tris· CL Puffer-Lösung, fügen Sie 68,46 g Saccharose. Lautstärke auf 200 mL mit Tris· CL-Pufferlösung. Filtern Sie die Lösung durch eine Filteranlage von 0,2 µm.
    3. Bereiten Sie 200 mL von 0,32 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).
    4. Bereiten Sie 150 mL 0,83 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).
  2. Sammlung von Brain-derived Rohöl Myelin Schutt
    Hinweis: Die hier beschriebene Methode der Sammlung ist für die Isolierung von Rohöl Myelin Schutt.
    1. Einschläfern Sie 10-12 Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien gefolgt von zervikale Dislokation.
    2. Sezieren Sie die Gehirne zu und legen Sie sie in eine 100 mm Schale mit 10 mL von 0,32 M Saccharoselösung.
Halten Sie die Schüssel auf dem Eis.
  • Mit sterile chirurgische Schere schneiden die Gehirne in Stücke ca. 5 mm3 in der Größe.
  • Übertragen Sie das Gewebe auf einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL und ca. 30 mL 0,32 M Saccharoselösung.
  • Homogenisieren Sie mit einer sterilen Handheld rotary Homogenisator, bis eine glatte Lösung erreicht ist.
  • Verdünnen Sie die homogenisierte Gehirne zu einem Endvolumen von 90 mL mit 0,32 M Saccharoselösung.
  • Hinzugeben Sie auf sechs 38,5 mL dünnwandigen Polypropylen Ultrazentrifugen Rohre 20 mL 0,83 M Saccharoselösung.
  • Fügen Sie sanft die homogenisierte Gehirn-Lösung an die Spitze der 0,83 M Saccharoselösung, kümmert sich nicht um die beiden Schichten zu mischen.
  • Jedes Rohr mit den 0,32 M Saccharoselösung auszugleichen.
  • Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Setzen Sie Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre minimale Werte um Myelin Schutt zu reduzieren.
  • Sammeln Sie die Myelin-Trümmer von der Schnittstelle der beiden Saccharose dichten.
    Hinweis: Schutt erscheint als ein weißes Band in Richtung der Mitte des Rohres.
  • Kombinieren Sie die grobe Myelin Trümmer in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und stellen Sie die Lautstärke auf ca. 35 mL mit Tris· CL-Pufferlösung.
  • Die grobe Myelin Trümmer mit einem sterilen Handheld rotary Homogenisator für 30-60 s zu homogenisieren.
  • Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 6 saubere Ultrazentrifugen Rohre und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.
  • Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen
  • Als feste weiße Pellets jetzt sichtbar sein werden, verwerfen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 10-15 mL Tris· CL-Pufferlösung.
  • Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 2 sauber Ultrazentrifugen Röhren und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.
  • Zentrifuge vorgekühlt wieder bei 100.000 x g 45 min bei 4 ° C mit einer geeigneten Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen
  • Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der Pellets in 5-6 mL sterile PBS und teilen Sie den Schwebezustand zwischen einer angemessenen Zahl von vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.
  • Zentrifuge bei 22.000 x g für 10 min bei 4 ° C.
  • Verwerfen Sie den Überstand und bestimmen Sie das Gewicht der Myelin-Schutt-Pellets.
  • Wieder aussetzen Sie, die Pellets in PBS, eine Endkonzentration von 100 mg/mL.
    Hinweis: zehn bis zwölf Gehirne ist genug, um 10-15 mL 100 mg/mL Myelin Schutt zu produzieren. Myelin Trümmer kann Speicher bei-80 ° C für 6 Monate sein.
  • Myelin Schutt fluoreszierende Kennzeichnung
    1. Bereiten Sie die 50 µM Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Lösung unmittelbar vor der Anwendung.
      1. Verwendung von sterilen PBS verdünnen Sie eine 5 mM-Stammlösung von CFSE-mit 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine Endkonzentration von Arbeiten von 50 µM vorbereitet.
      2. Filtern Sie Lösung durch einen 0,2 µm Spritze Filter.
    2. Tauen Sie die gewünschte Menge von 100 mg/mL Myelin Schutt und erneut mit einer sterilen 29 g Nadel auszusetzen.
      Hinweis: Einfrieren den Myelin-Schutt wird dazu führen, dass aus der Lösung erfordern Wiederfreisetzung vor Gebrauch fallen.
    3. Übertragen Sie Myelin Schutt auf eine vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen.
    4. Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4° C. Verwerfen Sie den überstand.
    5. Aufzuwirbeln Sie die Myelin-Trümmer in 200 µL der CFSE-Lösung pro 100 µL Myelin Schutt pelleted.
    6. Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT) vor Licht geschützt werden.
    7. Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
    8. Das Pellet in 600-800 µL Waschpuffer Aufschwemmen (0,2 µm-Filter sterilisiert 100 mM Glycin mit PBS-Puffer).
    9. Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.8-2.3.9 zweimal mehr.
    11. Bestimmen Sie nach der letzten Wäsche, das Gewicht des Pellet-Myelin Schutt und wieder auszusetzen Sie bis 100 mg/mL mit sterilen PBS.
      Bemerkung: Beschriftete Myelin Schutt kann Shop bei-80 ° C für bis zu 6 Monaten.

    • (3) Myelin Schutt Phagozytose Assay

    Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von Phagozytose Eindringmittel beschrifteten Myelin Schutt. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.

    1. Vorbereitung der Behandlung Platten
      1. Für jede Platte 145 mm Reifen BMDMs in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5-6 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) (pH 7,4) sammeln.
        Hinweis: Verwenden Sie Trypsin nicht, da es den Aktivierungsstatus der Zellen18verändern kann.
      2. Jedes Rohr gesammelt Zellen ein gleiches Volumen des vorgewärmten CMCM hinzufügen.
      3. Zentrifuge bei 180 X g für 8 min bei 20 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
      4. Wieder aussetzen Sie Zellen in CMCM und Count.
      5. Fügen Sie in jede Vertiefung einer 24-Well-Zelle-Kultur-Platte 1 x 105 Zellen in 1 mL der CMCM hinzu.
      6. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.
    2. Myelin Schutt Behandlung und Analyse
      1. Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL CFSE Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration) beschriftet.
      2. 1-3 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.
      3. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verschlungen Myelin Ablagerungen zu entfernen.
      4. 400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren
      5. Waschen Sie Platte 2 Mal mit sterilen PBS.
      6. Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT vor Licht geschützt werden.
      7. Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.
      8. Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung, Immunofluoreszenz zu reduzieren.
      9. Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop.
        Hinweis: Die Anregung und Emission Wellenlängen des CFSE-sind 494 nm und 521 nm, beziehungsweise.
      10. Teilen Sie die Anzahl der CFSE-positive Zellen durch die Anzahl der Nukleonen relative Myelin Schutt Aufnahme zu bestimmen.
      11. Pflegen Sie vor der Bildgebung Platten für bis zu 7 Tage bei 4 ° C, vor Licht geschützt.

    (4) Quantifizierung der intrazellulären Lipide über Öl Färbung rot-O

    Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von intrazellulären Myelin-Schutt-derived Lipide.Die Verwendung von CFSE beschriftet Myelin Schutt empfiehlt sich nicht für fluoreszierende Quantifizierung von ORO Färbung durch spektrale Überlappung. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.

    1. Vorbereitung der Färbung Lösungen
      1. 0,5 % Öl rot-O (ORO) Färbelösung vorzubereiten.
        1. Fügen Sie langsam 100 mL 100 % Propylenglykol (1,2-Propandiol) bis 0,5 g Oro (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) unter Rühren.
        2. Erhitzen Sie die Lösung bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis alle große Partikel aufgelöst haben.
          Hinweis: nicht erhitzen über 100 ° C.
        3. Lösung durch ein Stück Filterpapier während noch warm in einen neuen Container zu filtern.
        4. Lassen Sie zu, dass Lösung kühlen über Nacht bei RT-Lösung für bis zu 1 Jahr bei RT aufbewahrt werden können
      2. 85 % Propylenglykol Lösung ansetzen.
        1. 15 mL DdiH2O. rühren, bis gemischt fügen Sie 85 mL 100 % Propylenglykol hinzu. Lösung kann bis zu 1 Jahr bei RT gelagert werden
    2. Vorbereitung der Behandlung Platten
      1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte nach der in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.
      2. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.
    3. Myelin Schutt Behandlung
      1. Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration).
      2. 1-3 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.
      3. Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verdaut Myelin Ablagerungen zu entfernen.
        Hinweis: An dieser Stelle Platten können entweder sofortige Fixierung unterziehen oder frische CMCM kann hinzugefügt werden, und Zellen nach Inkubation für zusätzliche Zeitpunkte zurück.
      4. 400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren
      5. Waschen Sie die Platte 2 Mal mit sterilen PBS dann Handlungsschritte zu beflecken.
    4. ORO Färbung und Analyse
      1. Waschen Sie feste Platte mit DdiH2O. 3 Mal
      2. 400 µL 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung hinzufügen und 5 min bei RT inkubieren
        Hinweis: Dies reduziert die Übertragung von DdiH2O.
      3. Aspirieren Sie das Propylenglykol und jedes gut fügen Sie 400 µL ORO-Lösung hinzu.
      4. 8 min bei 60 ° c inkubieren
      5. Aspirieren Sie die ORO-Lösung. Dann fügen Sie 400 µL von 85 % Propylenglykol in jede Vertiefung und 5 Minumintes bei RT inkubieren
      6. Waschen der Platte 3 Mal mit DdiH2O.
      7. Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT, vor Licht geschützt werden.
      8. Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.
      9. Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung.
      10. Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. ORO kann mit einem standard Texas Red oder DsRed Filtersatz abgebildet werden.
      11. Quantifizieren Sie relative Lipid Aufbewahrung durch Bestimmung der ORO positiven Bereichs in jedem Bildfeld und dividiert sie durch die Anzahl der Nukleonen.
      12. Pflegen Sie Platten für 7 Tage bei 4 ° C vor Licht geschützt.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Behandlung von BMDMs mit CFSE beschriftet Myelin Ablagerungen sollten klare Internalisierung (Abbildung 2) ergeben. Während eine 3-stündigen Interaktionszeit für BMDMs, genügend zusätzlichen Myelin Schutt für robuste nachgelagerten Erkennung phagozytieren ausreicht, kann mit weniger als 1 Stunde von Interaktion intrazelluläre Akkumulation beobachtet werden. Jedoch kann einige Myelin Trümmer nach dem Waschen immer noch auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Dies ist möglicherweise aufgrund von nicht genügend Wasch- oder Partikel, die nicht vollständig in den frühen Phasen der Phagozytose verinnerlicht wird.

    Während BMDMs Myelin Schmutz schnell verinnerlichen können, lysosomalen Verarbeitung vor ORO färbbaren Lipid Tröpfchen Form erforderlich. Um zu demonstrieren, wurden BMDMs mit Myelin Schutt für 90 Minuten inkubiert, gewaschen und für zusätzliche Mengen an Zeit vor der Fixierung und Färbung (Abbildung 3) kultiviert. Abbildung 4 zeigt, dass es eine Verzögerung zwischen dem Behandlungsbeginn und neutral Lipid aussehen. Anzumerken ist, dass Lipid Aufbewahrung während der Kultur nicht stabil ist. BMDMs startet um kumulierte Lipide bald nach Tropfenbildung zu metabolisieren. Daher empfehlen wir warten nicht länger als 24 Stunden zwischen waschen Weg nicht verschlungen Myelin Schutt und Fixierung.

    Quantifizierung der ORO gefärbten Bereich zeigt die Rate der Myelin Fettstoffwechsel in BMDMs (Abbildung 5). Nach einer 90-minütigen Interaktion wurden Zellen nach Inkubation in frischen CMCM zurückgegeben. In der Frühzeit der Chase in frisches Medium verstoffwechseln die BMDMs die phagozytiertes Myelin Schutt Lipidkomponente in neutralen ORO färbbaren Lipide. Eine stetige Zunahme im positiven Bereich ORO ist typisch in den Stunden nach der Interaktion. Nach 24 Stunden jedoch die BMDMs Effluxed haben oder einen erheblichen Teil der intrazellulären Lipide metabolisiert.

    Figure 1
    Abbildung 1 : Vertreter BMDM Kulturen. Paar adhärente Zellen werden zunächst beobachtet werden. Am 3. Tag werden alle nicht-anhaftende Zellen entfernt. Tag 7 werden Reifen Knochenmark stammenden Makrophagen eingehalten. Skala = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2 : Vertreter Bilder von BMDM Myelin Schutt Phagozytose Assay. Zellen wurden behandelt mit 1mg/mL CFSE beschriftet Myelin Schutt für 1 Stunde vor dem Waschen und Fixierung mit 4 % PFA. Verinnerlichten Myelin Trümmer kann mit standard GFP Filtersätze auf einem Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop visualisiert werden. Skala = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3 : Diagramm der Versuchsplanung Öl rot O (ORO). BMDM sind mit 1mg/mL Myelin Schutt (1: 100 Verdünnung) für 90 Minuten, gefolgt von Wasch- und Kultur in frischem Medium vor Fixierung behandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4 : ORO Färbung des BMDM nach Myelin Schutt Phagozytose. Folgenden Fixierung mit 4 % PFA zu den angegebenen Zeitpunkten, BMDMs mit ORO und Hoechst 33258 befleckt waren. Repräsentative Bilder für jeden Zeitpunkt angezeigt werden. Skala = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5 : Quantitative Bildanalyse von ORO beflecken. Für die Quantifizierung der ORO Färbung wurden 3 Brunnen bei 20 X mit 5 Bildern pro Bohrloch abgebildet. Alle Bildeinstellungen Erwerb waren identisch. Fehlerbalken = SEM (n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Die hier beschriebenen Verfahren nutzen frisch isolierte Rohöl CNS Myelin Schutt und primäre Knochenmark stammenden Makrophagen. Um tierische Ausgaben zu reduzieren, empfehlen wir, die beiden Gehirne und Knochenmarkzellen von jeder Maus zum Zeitpunkt des Opfers geerntet werden. Zwei Forscher gemeinsam können beide Materialien gleichzeitig zubereiten. Alternativ können Gehirne bei-80 ° C in PBS mit Antibiotika vor dem Myelin Schutt Isolierung ergänzt gespeichert werden. Es ist gewesen, dass unsere Erfahrung, die Gehirne unter diesen Bedingungen bis zu 1 Monat ohne nennenswerten Verlust von Myelin Schutt Generation Potenzial aufrechterhalten werden kann.

    CFSE wird verwendet, um Myelin Ablagerungen aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit und fluoreszierendem Intensität zu beschriften. Der Farbstoff bleibt abgeschreckt, bis zelluläre Esterasen die Acetat-Gruppe auf der Molekül-14Spalten. Der Estergruppe befreiten Succinimidyl kann dann mit primäre Amide reagieren was in kovalente Bindung an zelluläre Proteine14. Während CFSE mit grün fluoreszierenden Standardkanäle erregbar ist, gibt es verschiedene Derivate mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften im Handel erhältlich. Somit ist es möglich, eine ähnliche Phagozytose-Assay mit mehreren Leuchtstofffärbungen zu entwerfen. Anzumerken ist, dass da der Farbstoff leicht Plasmamembranen kreuzt, es Label Apoptotic Zellen in einer ähnlichen Weise als Myelin Schutt19verwendet werden kann. Darüber hinaus während unsere Methode auf standard Bildanalyse mit Benutzer-Optimierung basiert, Quantifizierung erfolgt mittels Durchflusszytometrie oder ein hoher Durchsatz-Platte imaging-System.

    Öl rot O (auch bekannt als Lösungsmittel rot 27 oder Sudanrot 5 b) ist eine fettlösliche Farbstoff, der weitgehend neutralere Lipiden in histologischen Proben Fleck verwendet worden ist. Seine tiefrote Pigmentierung ermöglicht die Visualisierung von intrazellulären Lipiden über Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie5,20. Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht Einkanal Bildgebung und robuste Quantifizierung von ORO gebeizt Lipid-Tröpfchen. Während die Färbung Methode einfach und hoch reproduzierbare, muss während der Probenvorbereitung zu achten. Es ist wichtig, dass Alkohol oder Säure-basierte Fixiermittel nicht verwendet werden, als sie intrazelluläre Lipide, was zu einem deutlichen Rückgang der Intensität Färbung auflösen können. Darüber hinaus kann nicht wie bei einer quantitativen Bildanalyse, die Bedeutung von standardisierten Bild Aufnahmeeinstellungen und ausreichend unvoreingenommene Probenahme zu unterschätzen. Die Färbung Steuerelemente wird empfohlen, für jede Probe Auto-Fluoreszenz zu berücksichtigen. Diese Färbung Kontrollen sollten gleich behandelt werden, aber links ungefärbt mit ORO zur Messung der Hintergrund Auto-Fluoreszenz. Trotzdem erfordert unsere Bild-Analyse-Methode weniger Optimierung als andere Lipid Quantifizierung Techniken, wie die ORO Extraktion Methode21, die Standardkurve Vorbereitung erfordert, anfälliger für experimentelle Variabilität ist und erfordert Zerstörung der Probe. Die Verwendung von Bild-basierte Analyse hat mehrere Vorteile gegenüber traditionellen ORO Extraktionsmethoden, dass es nicht-destruktiv und ist kompatibel mit Immunostaining21,22 .

    Schließlich während die beschriebenen Verfahren relativ geradlinig sind, ist es wichtig, dass richtige aseptische Technik verwendet werden, da Makrophagen mehrere Rezeptoren zum Ausdruck bringen, die erkennen, dass Erreger molekulare Muster (PAMPS) wie zum Beispiel das Endotoxin verbunden Lipopolysaccharid (LPS)23. Interaktion mit bakteriellen Verunreinigungen werden in Makrophagen Aktivierung zur Folge und kann dramatisch ändern ihre Funktion24,25. In Bezug auf die gesammelten Myelin-Trümmer empfiehlt sich für Kontamination testen. Endotoxin Nachweismethoden wie Limulus Amebocyte lysate (LAL) Assay haben hohen Empfindlichkeit und habe bisher für diese Anwendung5,19.

    Makrophagen spielen eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, doch die Rolle der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung ist derzeit ein wichtiges Thema der Untersuchung. Hier beschriebenen Methoden verwenden, können Forscher beginnen, besser zu verstehen, den Mechanismus der Myelin Schutt Phagozytose durch BMDMs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Die Autoren haben keine Angaben.

    Acknowledgments

    Die Autoren möchten Glenn Sanger-Hodgson, Medien-Spezialist an der FSU College of Medicine für seine Arbeit in video-Produktion, Bearbeitung und Voice-over zu danken.

    Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01GM100474 und R01GM072611) unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Ausgabe 130 Knochenmark stammenden Makrophagen Phagozytose Neurowissenschaften Myelin Schutt Öl rot O Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester Verletzungen des Rückenmarks Neurotrauma
    <em>In-vitro-</em> Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter