Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Fagocytos av Myelin skräp av benmärgen-Derived makrofager

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Vi presenterar metoder för att bedöma den fagocytos kapaciteten av primära murina benmärg-derived makrofager med fluorescently märkta myelin skräp och intracellulära lipid droplet färgning.

Abstract

Benmärg-derived makrofager (BMDMs) är mogna leukocyter som tjänar en kritiska fysiologiska roll som professionella fagocyter kan rensa en mängd partiklar. Normalt BMDMs är begränsade från det centrala nervsystemet (CNS), men efter en skada, kan de lätt infiltrera. En gång inom den skadade CNS-vävnaden, BMDMs är den primära celltypen ansvarar för clearance av skada-derived cellulära skräp, inklusive stora mängder lipid rika myelin skräp. BMDM infiltration och myelin skräp fagocytos inom CNS neuropatologiska förgreningar är komplexa och inte förstådda. De protokoll som beskrivs här, möjliggör direkt in vitro- studier av BMDMs i samband med CNS-skada. Vi täcker murina BMDM isolering och kultur, myelin skräp förberedelse och analyser för att utvärdera BMDM myelin skräp fagocytos. Dessa tekniker ger robust kvantifierbara resultat utan att behöva betydande specialiserad utrustning eller material, men kan enkelt anpassas för att möta behoven hos forskare.

Introduction

Benmärg-derived makrofager (BMDMs) är en viktig länk mellan medfödd och adaptiv immun system. Som antigen presenterande celler (APC), de kan kommunicera med lymfocyter via både antigen-presentation och cytokinfrisättning1,2,3. Dock som professionella fagocyter är deras primära funktion att rensa patogener, åldern celler och cellulära skräp1,4. Efter en ryggmärgsskada (SCI) genereras betydande mängder av myelin skräp från döende oligodendrocyter, celltypen som är ansvarig för CNS axon myelinisering5. Vi och andra har visat att clearance av myelin skräp är primärt ansvar infiltrera BMDMs5,6,7. Dock inom ryggmärgsskada har platser omvälvning av myelin skräp föreslagits för att skifta dessa normalt anti-inflammatoriska celler mot en pro-inflammatoriska tillstånd5,8,9. Som viktiga mediatorer av neuro-inflammation i den skadade ryggmärgen är BMDMs viktiga kliniska mål.

För att undersöka påverkan av BMDMs i den skadade ryggmärgen, har vi utvecklat en in vitro- modell för att direkt studera hur BMDMs reagerar på myelin skräp. För att förbättra biologiska betydelse, används både primära murina BMDMs och nymalen isolerade myelin skräp vid dessa undersökningar. Som sådan, de metoder som presenteras här detalj också isolering och kultur av primära murina BMDMs, och en modifierad sackaros gradient teknik används för att isolera murina CNS härrör myelin skräp10,11,12. Myelin skräp kan lätt märkas med ett fluorescerande färgämne, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), att spåra dess internalisering av BMDMs. CFSE är väl lämpad för det här programmet eftersom det är icke-cytotoxiska, och dess smala fluorescerande spektrum tillstånd Multiplexing med andra fluorescerande sonder13,14. Efter fagocytos, myelin skräp lipider transporteras genom lysosomerna och paketeras som neutrala lipider i intracellulära lipid droppar5. För att kvantifiera detta intracellulära lipid ackumulering, presenterar vi en olja Red O (ORO) färgning metod optimerad för kvantitativ bildanalys. Denna enkla färgningsmetod producerar robusta reproducerbara resultat och kvantifiering15. Dessa metoder underlätta studiet av myelin skräp fagocytos och lipid lagring med begränsad specialutrustning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metoderna som beskrivs här och i avsnitt 2 har godkänts av Florida State University institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) och följer de riktlinjer som anges i Guide för skötsel och användning av försöksdjur, 8: e upplagan . Alla djur som används i detta i detta protokoll är hus i en dedikerad laboratorium djuranläggningen fram till användning. Inga in-vivo -experiment var utförda före att offra. Antalet djur var baserat på experimentella behov med genomsnittlig cell och myelin samlingar som en guide för att minimera användningen.

Obs: Det här protokollet beskriver generationen av benmärgen-derived makrofager (BMDMs) (avsnitt 1), utarbetande av fluorescently märkt brain-derived myelin skräp (avsnitt 2), det allmänna förfarandet för att analysera myelin skräp fagocytos (avsnitt 3), och det allmänna förfarandet för analys av myelin skräp lipid ackumulering (avsnitt 4). REAGENSBEREDNING, cellen skörd och manipulation, myelin samling och märkning och analysens prestanda bör fyllas i ett laminärt luftflöde biosäkerhet skåp.

1. generering av primära benmärg-Derived makrofager

  1. Beredning av komplett makrofag odlingsmedium (CMCM)
    Obs:     makrofag generation från benmärg kräver användning av makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (M-CSF). Detta preparat använder tredjeparts L929 murina fibroblast luftkonditionerade medier som källa för M-CSF.
    1. Generera L929 murina fibroblast luftkonditionerade medier genom odling av celler i 145 mm rätter med 50 mL av hög glukos (4500 mg/L L-glukos) Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 5% nya född kalvserum (NCS) och Penicillin/Streptomycin för 7 dagar.
    2. Samla in media från kulturer i 50 mL koniskt centrifugrör och Centrifugera i 30 minuter vid 3500 x g, 4 ° C.
    3. Filtrera supernatanterna genom ett 0,2 µm spruta filter i en ny 50 mL koniskt centrifugrör. Konditionerat media kan lagras vid-80 ° C i upp till 6 månader.
    4. Till hög glukos DMEM, lägga till 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 murina fibroblast luftkonditionerade DMEM och 1% Penicillin/Streptomycin. Media kan lagras vid 4 ° C i 2-3 månader. Varma till 37 ° C före användning.
  2. Samling av primära benmärgsceller och makrofag induktion
    Obs: Med detta protokoll en mus kommer att generera cirka 20 miljoner benmärg-derived makrofager (BMDMs).
    1. Euthanize önskat antal 8-10 vecka gamla möss använder standardriktlinjer för kvävning av CO-2 följt av cervikal dislokation.
    2. Sanera djuret använder 70% (vol/vol) etanol: H2O, mättar päls.
    3. Skär en liten öppning i buken och dra försiktigt tillbaka huden för att avslöja underliggande vävnad. Var noga med att inte punktera i bukhålan.
    4. Ta bort båda bakbenen börjar vid höften och slutar vid ankeln. Plats samlas in vävnaden i en 100 mm petriskål som innehåller 5-10 mL steril fosfat buffrad saltlösning (PBS) kompletteras med 1% Penicillin/Streptomycin.
      Obs: När bearbetning flera djur se till att hålla rätter på is att begränsa vävnad nedbrytning.
    5. Ta bort muskler och bindväv från benet med en skalpell. Endast lårben och skenben används för insamling av cellen, fibula kan kasseras.
    6. Exponera märg hålighet i insamlade benen genom att beskära ett litet avsnitt från varje ände med en skalpell.
    7. Använder en 25g nål, spola märg hålrum med CMCM i en 50 mL konisk centrifugrör. Ben visas vitt när de har varit tillräckligt spolas.
    8. När samlingen är klar, skaka enkelarmade med en 18g nål för 30-90 s genereras en enda cellsuspension.
      Obs: Ett valfritt röda blodkroppar (RBC) lysis steg kan utföras på denna punkt. Det har nyligen föreslagits att intracellulära järn innehåll kan påverka effekterna av myelin skräp på makrofag polarisering16. För information om införande av ett RBC lysis steg se Trouplin et al. 17.
    9. Filtrera suspensionen genom en 70 µm sterila cell SIL i en ny 50 mL koniskt centrifugrör.
    10. Utsädet samlas celler jämnt i 145 mm cell kultur rätter som innehåller 15-20 mL CMCM. Använd cirka tre kultur rätter per mus offras. Inkubera kulturer vid 37 ° C, 5% CO2.
    11. Efter 72 timmar tvätta plattorna en gång med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att avlägsna icke-anhängare celler, tillsätt sedan 15-20mL färsk CMCM. Inkubera kulturer i ytterligare 4 dagar vid 37 ° C, 5% CO2. Efter 7 dagar av total kultur blir de hematopoetiska benmärgsceller som initialt isolerade mogen BMDMs (figur 1).

2. generering av Fluorescently märkt Brain-Derived Myelin skräp

Obs: Alla reagenser kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 månad.

  1. Beredning av myelin skräp samling reagenser
    1. Förbereda Tris· Cl buffertlösning.
      1. 800mL Tillsätt destillerat avjoniserat H2O (ddiH2O) 20 mL av 1 M Tris· Cl, pH 7,45 (20 mM slutlig koncentration) och 20 mL 100 mM Na2EDTA (2 mM slutlig koncentration).
      2. Justera pH till 7,45. Justera volymen med ddiH2O. filtrera lösningen genom ett 0,2 µm filtrering enhet till 1000 mL.
    2. Bered 1 M sackaros.
      1. Till 100 mL Tris· Cl buffert lösning, tillsätt 68.46 g sackaros. Justera volymen till 200 mL med Tris· Cl buffertlösning. Filtrera lösningen genom ett 0,2 µm filtrering enhet.
    3. Förbereda 200 mL 0.32 M sackaroslösning genom spädning av 1 M lösningen med Tris· Cl buffert lösning 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. Förbereda 150 mL 0,83 M sackaroslösning genom spädning av 1 M lösningen med Tris· Cl buffert lösning 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. Samling av brain-derived rå myelin skräp
    Obs: Vilken insamlingsmetod som beskrivs här är för isolering av rå myelin skräp.
    1. Avliva 10-12 möss 8-10 veckors ålder med hjälp av CO2 kvävning standardriktlinjer följt av cervikal dislokation.
    2. Dissekera hjärnor och placera dem i en 100 mm maträtt innehållande 10 mL 0.32 M sackaroslösning.
Hålla skålen på is.
  • Med sterila kirurgiska sax klippa hjärnor i bitar ca 5 mm3 i storlek.
  • Överför vävnaden till en 50 mL konisk centrifugrör och tillsätt cirka 30 mL 0.32 M sackaroslösning.
  • Homogenisera med en steril handhållna roterande Homogenisatorer, tills en smidig lösning uppnås.
  • Späd de homogeniserade hjärnorna till en slutlig volym av 90 mL med 0.32 M sackaroslösning.
  • Till sex 38,5-mL tunnväggiga polypropylen ultracentrifugen rör, tillsätt 20 mL 0,83 M sackaroslösning.
  • Försiktigt lägga homogeniserad hjärnan lösningen till toppen av 0,83 M sackaros lösningen, noga med att inte blanda de två lagrarna.
  • Balansera varje tub med 0.32 M sackaros lösningen.
  • Centrifugera vid 100 000 x g i 45 minuter vid 4° C med hjälp av en lämplig kyls före ultracentrifugen rotor. Ställa in rotorn acceleration och retardation till deras minsta värden att minska myelin skräp förlusten.
  • Samla in myelin skräp från gränssnittet för två sackaros tätheter.
    Obs: skräp ska visas som ett vitt band mot mitten av röret.
  • Kombinera rå myelin skräp till en 50 mL konisk centrifugrör och justera volymen till ca 35 mL med hjälp av Tris· Cl buffertlösning.
  • Homogenisera rå myelin skräp med en steril handhållna roterande Homogenisatorer för 30-60 s.
  • Jämnt fördela suspensionen mellan 6 ren ultracentrifugen rör och balans med en lämplig volym av Tris· Cl buffertlösning.
  • Centrifugera vid 100 000 x g i 45 minuter vid 4° C med hjälp av en lämplig kyls före ultracentrifugen rotor. Ställa in rotorn acceleration och retardation till deras maximala värden.
  • Som solid vit pellets kommer nu att vara synlig, avlägsna supernatanten och slamma pellets i 10-15 mL Tris· Cl buffertlösning.
  • Jämnt fördela suspensionen mellan 2 rena ultracentrifugen rör och balans med en lämplig volym av Tris· Cl buffertlösning.
  • Centrifugera igen kyls vid 100 000 x g i 45 minuter vid 4 ° C med hjälp av en lämplig före ultracentrifugen rotor. Ställa in rotorn acceleration och retardation till deras maximala värden.
  • Avlägsna supernatanten och återsuspendera pellets i 5-6 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och dela upp suspensionen mellan ett lämpligt antal pre vägde 1,5 mL mikro-centrifugrör.
  • Centrifugera vid 22 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
  • Avlägsna supernatanten och fastställa vikten av myelin skräp pellets.
  • Återsuspendering pellets i PBS till en slutlig koncentration av 100 mg/mL.
    Obs: tio till tolv hjärnor är tillräckligt för att producera 10-15 mL 100 mg/mL myelin skräp. Myelin skräp kan vara förvaras vid-80 ° C i 6 månader.
  • Myelin skräp fluorescerande märkning
    1. Förbereda 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) lösningen omedelbart före användning.
      1. Med hjälp av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, späd en 5 mM stamlösning av CFSE tillagas med 100% dimetyl sulfoxid (DMSO) till en slutkoncentration arbeta 50 µm.
      2. Filtrera lösningen genom ett 0,2 µm spruta filter.
    2. Tina den önskade mängden 100 mg/mL myelin skräp och resuspendera med ett sterilt 29 g nål.
      Obs: frysning myelin skräp kommer att få den att släppa ur lösning som kräver resuspension före användning.
    3. Överföra myelin skräp till ett pre vägde 1,5 mL mikro-centrifugrör.
    4. Centrifugera vid 14 800 x g under 10 minuter vid 4° C. Kassera supernatanten.
    5. Återsuspendera myelin skräp i 200 µL CFSE lösning per 100 µL myelin skräp pelleterat.
    6. Inkubera i 30 min i rumstemperatur (RT) skyddas från ljus.
    7. Centrifugera vid 14 800 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    8. Återsuspendera pelleten i 600-800 µL tvättlösning (0,2 µm filter steriliseras 100 mM glycin i PBS).
    9. Centrifugera vid 14 800 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    10. Upprepa steg 2.3.8-2.3.9 två gånger.
    11. Efter den sista tvättningen, fastställa vikten av myelin skräp pelleten och slamma 100 mg/ml med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
      Obs: Märkt myelin skräp kan vara förvaras vid-80 ° C i upp till 6 månader.

    • 3. myelin skräp fagocytos Assay

    Obs: Följande är den grundläggande metoden för att observera fagocytos av fluorescently märkt myelin skräp. Tillägg av andra behandlingar och experimentella förhållanden behöver optimeras av prövaren.

    1. Beredning av behandling plattor
      1. För varje 145 mm platta, samla in mogna BMDMs i en 15 mL koniskt centrifugrör med 5-6 mL 10 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (dPBS) (pH 7,4).
        Obs: Använd inte trypsin eftersom det kan förändra tillståndet aktivering av cellerna18.
      2. Tillsätt en motsvarande volym av pre värmde CMCM i varje rör insamlade celler.
      3. Centrifugera vid 180 x g i 8 min vid 20 ° C. Kassera supernatanten.
      4. Resuspendera cellerna i CMCM och antal.
      5. Till varje brunn 24-väl cell kultur platta, lägga till 1 x 105 celler i 1 mL CMCM.
      6. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 24 h.
    2. Myelin skräp behandling och analys
      1. Lägg till 10 µL av 100 mg/mL CFSE märkt myelin skräp till varje brunn (1 mg/mL koncentration).
      2. Inkubera i 1-3 timmar vid 37 ° C, 5% CO2.
      3. Tvätta plattan 3 gånger med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att avlägsna icke-uppslukade myelin skräp.
      4. Tillsätt 400 µL av 4% PARAFORMALDEHYD till varje brunn. Inkubera i 30 min på RT.
      5. Tvätta plattan 2 gånger med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
      6. Tillsätt 400 µL av Hoechst 33258 lösning till varje brunn. Inkubera i 5 min på RT skyddas från ljus.
      7. Tvätta plattorna 2 gånger med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
      8. Tillsätt 200 µL av Fluoro-gel med Tris buffert till varje brunn för att minska fotoblekning.
      9. Bildceller genom en inverterad epi-fluorescerande kapabel Mikroskop.
        Obs: De excitation och utsläpp våglängderna av CFSE är 494 nm och 521 nm, respektive.
      10. Dividera antalet CFSE positiva celler med antalet kärnor att bestämma relativa myelin skräp upptag.
      11. Innan imaging, upprätthålla plattor för upp till 7 dagar vid 4 ° C skyddas från ljus.

    4. kvantifiering av intracellulära lipider Via olja röd-O färgning

    Obs: Följande är den grundläggande metoden för att observera intracellulära myelin-skräp-härledda lipider.Användning av CFSE märkt myelin skräp rekommenderas inte för fluorescerande kvantifiering av ORO färgning på grund av spektral överlappning. Tillägg av andra behandlingar och experimentella förhållanden behöver optimeras av prövaren.

    1. Beredning av färgning lösningar
      1. Förbereda 0,5% olja röd-O (ORO) färglösningen.
        1. Tillsätt långsamt 100 mL 100% propylenglykol (1,2-propandiol) till 0,5 g ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) under omrörning.
        2. Värm lösningen vid 95 ° C i 15 min eller tills alla stora partiklar löses.
          Obs: Värm inte över 100 ° C.
        3. Filtrera lösningen genom en bit av filterpapper medan fortfarande varm till en ny behållare.
        4. Låt lösningen till cool övernattning på RT. lösning kan förvaras upp till 1 år på RT.
      2. Bered 85% propylenglykol.
        1. Tillsätt 85 mL 100% propylenglykol till 15 mL ddiH2O. rör om tills det är blandat. Lösningen kan förvaras upp till 1 år på RT.
    2. Beredning av behandling plattor
      1. Förbereda en 24-well platta efter den metod som anges i avsnitt 3.
      2. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 24 h.
    3. Myelin skräp behandling
      1. Tillsätt 10 µL av 100 mg/mL myelin skräp till varje brunn (1 mg/mL koncentration).
      2. Inkubera i 1-3 h vid 37 ° C, 5% CO2.
      3. Tvätta plattan 3 gånger med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att avlägsna icke-smält myelin skräp.
        Obs: Vid denna punkt, plattor kan antingen genomgå direkta upptagning eller färska CMCM kan läggas och celler återvände till inkubation för ytterligare tidpunkter.
      4. Tillsätt 400 µL av 4% PARAFORMALDEHYD till varje brunn. Inkubera i 30 min på RT.
      5. Tvätta plattan 2 gånger med steril PBS sedan procced till färgning.
    4. ORO färgning och analys
      1. Tvätta fast plattan 3 gånger med ddiH2O.
      2. Tillsätt 400 µL 100% propylenglykol i varje brunn och inkubera i 5 min på RT.
        Obs: detta kommer att minska överföring av ddiH2O.
      3. Aspirera på propylenglykol och lägga 400 µL ORO lösning till varje brunn.
      4. Inkubera i 8 min vid 60 ° C.
      5. Aspirera ORO lösningen. Sedan lägga till 400 µL av 85% propylenglykol i varje brunn och inkubera i 5 minumintes på RT.
      6. Tvätta plattan 3 gånger med ddiH2O.
      7. Tillsätt 400 µL av Hoechst 33258 lösning till varje brunn. Inkubera i 5 min på RT, skyddas från ljus.
      8. Tvätta plattorna 2 gånger med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
      9. Tillsätt 200 µL av Fluoro-gel med Tris buffert till varje brunn.
      10. Bildceller genom en inverterad epi-fluorescerande kapabel Mikroskop. ORO kan avbildas med en Texas röd eller DsRed filter standarduppsättning.
      11. Kvantifiera relativa lipid lagring genom att bestämma området ORO positiv i varje bildfält och dividera det med antalet kärnor.
      12. Upprätthålla plattor för 7 dagar vid 4 ° C skyddas från ljus.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Behandling av BMDMs med CFSE märkt myelin skräp bör ge tydliga internalisering (figur 2). Medan en 3 timmars interaktion tid räcker för BMDMs att phagocytose nog extra myelin skräp för robust nedströms upptäckt, kan intracellulär ansamling observeras med så lite som 1 timme av interaktion. Dock kan vissa myelin skräp finnas kvar på cellytan efter tvätt. Detta kan bero på otillräcklig tvättning eller partiklar som inte är fullt internaliserat under de tidiga stadierna av fagocytos.

    Medan BMDMs kan snabbt internalisera myelin skräp, krävs lysosomala bearbetning innan ORO stainable lipid droppar form. För att demonstrera, var BMDMs inkuberas med myelin skräp i 90 minuter, tvättas och odlade för ytterligare belopp före fixering och färgning (figur 3). Figur 4 visar att det finns en fördröjning mellan behandlingsstart och neutrala lipid utseende. Det bör också noteras att lipid lagring inte är stabil under kultur. BMDMs börjar att metabolisera ackumulerade lipider snart efter droplet bildandet. Som sådan, rekommenderar vi väntar längre än 24 timmar mellan tvätt bort icke-uppslukade myelin skräp och fixering.

    Kvantifiering av ORO målat område visar graden av myelin lipidmetabolism i BMDMs (figur 5). Efter en 90 minuters interaktion period återlämnades celler till inkubation i färska CMCM. Under början chase i färskt medium metabolisera BMDMs komponenten fagocyteras myelin skräp lipid i neutrala ORO stainable lipider. En stadig ökning av ORO positiva område är typiskt i timmarna efter interaktionen. Efter 24 timmar dock BMDMs kommer att ha effluxed eller metaboliseras en betydande del av de intracellulära lipider.

    Figure 1
    Figur 1 : Representant BMDM kulturer. Några vidhäftande celler observeras från början. Dag 3, tas icke-anhängare celler bort. Av dag 7 observeras mogen benmärg-derived makrofager. Skala = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2 : Representativa bilder av BMDM Myelin skräp fagocytos Assay. Celler som behandlats med 1mg/mL CFSE märkt myelin skräp för 1 timme före tvätt och fixering med 4% PFA. Internaliserad myelin skräp kan visualiseras med standard GFP filteruppsättningar på ett epi-fluorescerande kapabel Mikroskop. Skala = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3 : Diagram över olja röd O (ORO) experimentell Design. BMDM behandlas med 1mg/mL myelin skräp (1: 100 utspädning) för 90 minuter, följt av tvättning och kultur i färskt medium före fixering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4 : ORO färgning av BMDM efter Myelin skräp fagocytos. Följande fixering med 4% PFA på de angivna tidpunkterna, BMDMs var fläckade av ORO och Hoechst 33258. Representativa bilder för varje tidpunkt visas. Skala = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5 : Kvantitativ bildanalys av ORO färgning. För kvantifiering av ORO färgning, var 3 brunnar avbildade 20 X med 5 bilder per brunn. Alla bildinställningar förvärvet var identiska. Felstaplar = SEM. (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De förfaranden som beskrivs här utnyttja både färska isolerade rå CNS myelin skräp och primära benmärg-derived makrofager. För att minska djurens expenditures, rekommenderar vi att både hjärna och benmärgsceller skördas från varje mus vid tidpunkten för offer. Två forskare arbetar tillsammans kan förbereda båda materialen samtidigt. Alternativt, hjärnor kan lagras vid-80 ° C i PBS kompletteras med antibiotika innan myelin skräp isolering. Det har varit vår erfarenhet att hjärnor kan upprätthållas i dessa villkor för upp till 1 månad utan märkbar förlust av myelin skräp generation potential.

    CFSE används för att märka myelin skräp på grund av dess användarvänlighet och fluorescerande intensitet. Färgen är kylda tills cellulära esteraser klyva gruppen acetat på molekylen14. Frigjorda succinimidyl ester gruppen kan sedan reagera med primära amider, vilket resulterar i kovalent fastsättning cellproteiner14. Medan CFSE är retbara använder grön fluorescerande standardkanaler, finns det flera derivat kommersiellt tillgängliga med olika spektrala egenskaper. Det är således möjligt att utforma en liknande fagocytos analys med flera fluorescerande färger. Det bör också noteras att eftersom färgämnet korsar lätt plasma membran, det kan användas till etikett apoptotiska celler på ett liknande sätt som myelin skräp19. Dessutom medan vår metod bygger på standard bildanalys, med användaren optimering, kan kvantifiering utföras med hjälp av flödescytometri eller en hög genomströmning tallrik imaging system.

    Olja röd O (även känd som lösningsmedel röd 27 eller Sudan röd 5B) är ett fettlösligt färgämne som har använts i stor utsträckning att färga neutrala lipider i histologiska prover. Dess djup röd pigmentering möjliggör visualisering av intracellulära lipider via både ljusa fält och fluorescerande mikroskopi5,20. Med hjälp av fluorescerande mikroskopi kan för enda kanal imaging och robust kvantifiering av ORO målat lipid droppar. Medan färgningsmetod är enkel och mycket reproducerbara, måste försiktighet iakttas under provberedning. Det är viktigt att alkohol eller syra-baserade fixativ inte användas, eftersom de kan lösa upp intracellulära lipider, vilket leder till en betydande minskning av färgning intensitet. Dessutom, som med någon kvantitativ bildanalys, kan inte standardiserade bild fånga inställningar och tillräcklig opartisk provtagning betydelse underskattas. Användning av färgning kontroller rekommenderas att ta hänsyn till eventuella prov auto-fluorescens. Sådana färgning kontroller bör behandlas identiskt, men vänster ofärgade med ORO att mäta nivån på bakgrunden auto-fluorescens. Även så, kräver vår bild analysmetod mindre optimering än andra lipid kvantifiering tekniker, såsom den ORO utvinning metod21, som kräver standardkurvan förberedelser, är mer benägna att experimentella variabilitet, och nödvändiggör förstörelse av provet. Användning av baserat bildanalys har flera fördelar över traditionella ORO extraktionsmetoder som det icke-förstörande och är kompatibel med immunfärgning21,22 .

    Slutligen, medan de förfaranden som beskrivs är relativt rakt fram, det är viktigt att korrekt aseptisk teknik användas, eftersom makrofager uttrycker flera receptorer som känner igen patogen-associerade molekylära mönster (PAMPS) såsom endotoxin lipopolysackarid (LPS)23. Interaktion med bakteriell förorenar kommer resultera i makrofag aktivering och kan dramatiskt ändra deras funktion24,25. När det gäller insamlade myelin skräp rekommenderas testning för förorening. Endotoxin identifieringsmetoder såsom limulus amebocyte lysate (LAL) analysen har hög känslighet, och har tidigare använts för denna ansökan5,19.

    Makrofager spelar en viktig roll i hälsa och sjukdom, men rollen som BMDMs i samband med CNS-skada är för närvarande ett viktigt ämne för utredning. Forskare använder de metoder som beskrivs här, och kan börja att bättre förstå mekanismen av myelin skräp fagocytos av BMDMs.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna har inga upplysningar.

    Acknowledgments

    Författarna vill tacka Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist vid FSU College of Medicine för allt hans arbete i video produktion, redigering och voice-over.

    Detta arbete stöds av National Institutes of Health (R01GM100474 och R01GM072611).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Fråga 130 fagocytos benmärg-derived makrofag neurovetenskap myelin skräp olja röd O carboxyfluorescein succinimidyl ester ryggmärgsskada neurotrauma
    <em>In Vitro</em> Fagocytos av Myelin skräp av benmärgen-Derived makrofager
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter