Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Published: December 30, 2017 doi: 10.3791/56322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

Summary

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Abstract

Makrofajlar (BMDMs) kemik iliği elde edilen profesyonel fagositler olarak kritik bir fizyolojik rolü parçacıklar çeşitli Temizleme yeteneğine hizmet olgun lökosit vardır. Normalde, BMDMs merkezi sinir sistemi (MSS) sınırlı ama bir yaralanma, onlar kolayca sızmak olabilir. Bir kez yaralı CNS doku içinde BMDMs lipid zengin miyelin enkaz büyük miktarlarda dahil olmak üzere yaralanma kaynaklı hücresel enkaz için izni sorumlu birincil hücre türü vardır. BMDM infiltrasyon ve miyelin enkaz fagositoz MSS içinde neuropathological yansımaları karmaşık ve iyi anlaşılan. Burada, açıklanan protokollere izin ver BMDMs doğrudan vitro çalışma bağlamında, CNS yaralanma için. Biz fare BMDM yalıtım ve kültür, miyelin enkaz hazırlama ve deneyleri BMDM miyelin enkaz fagositoz değerlendirmek için kapağı. Bu teknikler önemli özel ekipman veya malzemeler için gerek kalmadan sağlam ölçülebilir sonuçlar üretmek henüz araştırmacılar ihtiyaçlarını karşılamak üzere kolayca özelleştirilebilir.

Introduction

Makrofajlar (BMDMs) kemik iliği türevi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri arasında önemli bir bağlantı vardır. Antijen sunan hücreler (ZPT), olarak her iki antijen sunumu ile lenfositler ile iletişim kurabilir ve sitokin yayın1,2,3. Ancak, profesyonel fagositler onların birincil işlevi patojenler, yaşlı hücreler ve hücresel enkaz1,4temizlemektir. Bir omurilik yaralanması (SCI), miyelin enkaz önemli miktarda hücre tipi CNS axon myelination5için sorumlu ölmek üzere olan oligodendrocytes oluşturulur. Biz ve diğerleri miyelin enkaz temizleme BMDMs5,6,7infiltre öncelikle sorumluluğu olduğunu göstermiştir. Ancak, Medulla Spinalis Yaralanmalarında içinde siteleri engulfment miyelin enkaz bir pro-inflamatuar durumu5,8,9karşı bu normalde anti-inflamatuar hücreleri kaydırmaya sürülmüştür. Anahtar arabulucu nöro-inflamasyon yaralı spinal kord BMDMs önemli klinik hedefleridir.

BMDMs etkisi yaralı spinal kord araştırmak yardımcı olmak için nasıl BMDMs miyelin enkaz için yanıt doğrudan çalışmaya bir vitro modeli geliştirdik. Biyolojik alaka artırmak için birincil fare BMDMs ve taze izole miyelin enkaz bu araştırmalarda kullanılır. Bu nedenle, burada sunulan yöntemleri de detay yalıtım ve birincil fare BMDMs kültürünü ve fare CNS ayırmak için kullanılan bir değiştirilmiş Sükroz degrade teknik miyelin enkaz10,11,12türetilmiş. Miyelin enkaz kolayca floresan bir boya carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), sitotoksik sigara çünkü onun içselleştirilmesi BMDMs. CFSE tarafından de bu uygulama için uygun izlemek ve kendi dar floresan spektrum izni ile Etiketlenmiş diğer floresan ile çoğullama13,14sondalar. Fagositoz, miyelin enkaz lipidler organellerin taşınır ve nötr lipitler gibi hücre içi lipid damlacıkları5paketlenmiş. Bu hücre içi lipid birikimi ölçmek için boyama yöntemi kantitatif görüntü analizi için en iyi duruma getirilmiş bir yağ kırmızı O (ORO) mevcut. Bu basit boyama yöntemi sağlam tekrarlanabilir sonuçlar ve miktar15üretir. Bu yöntemlerden miyelin enkaz fagositoz ve lipid saklama sınırlı özel ekipman ile çalışma kolaylaştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Yöntemleri burada açıklanan ve Bölüm 2'de Florida Eyalet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olan ve ileri Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının, 8th edition için belirlenen kuralları izler . Bunda bu protokol için kullanılan tüm özel laboratuvar hayvan tesisi evde kadar kullanmak hayvanlardır. Vivo deneyler gerçekleştirilen öncesinde kurban oldu. Hayvan sayıları ortalama hücre ve miyelin koleksiyonları kullanımını en aza indirmek için bir kılavuz olarak kullanarak deneysel ihtiyacına göre.

Not: Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) (Bölüm 1), fluorescently etiketli beyin kaynaklı miyelin enkaz (Bölüm 2), miyelin enkaz fagositoz (Bölüm 3), analiz genel yordamı hazırlanması nesil açıklar ve Genel yordam miyelin enkaz lipid birikimi (Bölüm 4) çözümlenmesi için. Reaktif hazırlık, hücre hasat ve işleme, miyelin koleksiyonu ve etiketleme ve tahlil performans Laminer hava akımı Biyogüvenlik kabini tamamlanmalıdır.

1. birincil kemik iliği türevi makrofajlar nesil

  1. Hazırlık tam makrofaj kültür ortamının (CMCM)
    Not:     kemik iliği nesilden makrofaj makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanımını gerektirir. Bu hazırlık L929 fare fibroblast şartına medya M-CSF kaynağı olarak kullanır.
    1. L929 fare fibroblast şartına medya kodlamayla hücreleri tarafından 145 mm yemekleri ile 50 mL, yüksek glikoz (4500 mg/L L-glikoz) Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 5 yeni doğan buzağı serum (NCS) ve penisilin/streptomisin ile 7 gün boyunca takıma DMEM) oluşturun.
    2. Medya 3500 x g, 4 ° c'de 30 dakika 50 mL konik santrifüj tüpleri ve santrifüj kültürler toplamak
    3. Supernatants yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne 0.2 µm şırınga filtre ile filtre. Klimalı ortam-80 ° C'de 6 aya kadar muhafaza edilebilir.
    4. DMEM yüksek glikoz için % 5 vol/vol NCS ekleyin, DMEM ve %1 %15 vol/vol L929 fare fibroblast şartına penisilin/streptomisin. Medya 4 ° C'de 2-3 ay boyunca saklanır. Kullanmadan önce 37 ° c sıcak.
  2. Birincil kemik iliği hücreleri ve makrofaj indüksiyon koleksiyonu
    Not: Bu iletişim kuralı bir fare kullanarak yaklaşık 20 milyon kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) oluşturur.
    1. 8-10 hafta standart CO2 boğulma yönergeleri kullanarak eski fareler tarafından servikal yerinden çıkması takip için istediğiniz sayıyı ötenazi.
    2. % 70 (vol/vol) etanol: H2O kullanarak, kürk doyurarak hayvan sterilize.
    3. Karın küçük bir açılış kesmek ve dikkatli bir şekilde geri çekin temel doku ortaya çıkarmak için cilt. Periton boşluğuna delik değil için dikkat ediniz.
    4. Kalçada başlayıp ayak bileği her iki arka ayakları kaldırın. Yer 5-10 mL steril fosfat içeren 100 mm Petri kabına toplanan dokusuna arabelleğe alınmış serum (PBS) % 1'ile desteklenmiş penisilin/streptomisin.
      Not: Otelde çeşitli hayvanlar işleme yemekleri doku bozulması sınırlamak için buz üzerinde tutmak emin olun.
    5. Kas ve bağ dokusu bir neşter kullanarak kemiğinden kaldırın. Sadece femur ve tibia kullanılan hücre koleksiyonu için fibula atılır.
    6. Toplanan kemik iliği boşluğuna her iki ucu bir neşter ile küçük bir bölümünden çıkararak maruz.
    7. 25 g iğne kullanarak, CMCM ile kemik iliği boşluklar içine 50 mL konik santrifüj tüpü sifonu çek. Bir kez onlar yeterince temizlenen kemikleri beyaz görünür.
    8. Koleksiyon tamamlandığında, örnekleri oluşturulan bir tek hücre süspansiyon 30-90 s için bir 18 g iğne ile tahrik.
      Not: Bir isteğe bağlı kırmızı kan hücresi (RBC) lizis adım bu noktada gerçekleştirilebilir. Son zamanlarda hücre içi demir içeriği miyelin enkaz makrofaj polarizasyon16üzerine etkilerini etkileyebilir sürülmüştür. RBC lizis adım olmasıyla ilgili bilgi için Trouplin ve arkbakın. 17.
    9. Süspansiyon 70 µm steril hücre süzgeç aracılığıyla yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne filtre.
    10. Tohum hücrelerini eşit olarak 15-20 mL CMCM içeren 145 mm hücre kültür yemekleri toplanan. Yaklaşık üç kültür yemekleri feda fare başına kullanın. Kültürler 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.
    11. 72 saat yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için bir kez steril PBS ile plakalar yıkadıktan sonra 15-20 mL ekleyin taze CMCM. Kültürler için 37 ° c, % 5 CO2ek bir 4 gün kuluçkaya. Toplam kültürünün 7 gün sonra başlangıçta izole kemik iliği hematopoetik hücreler olgun BMDMs (şekil 1) olacaktır.

2. nesil Fluorescently etiketli beyin kaynaklı miyelin enkaz

Not: Tüm reaktifler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.

  1. Miyelin enkaz toplama reaktifler hazırlanması
    1. Tris· hazırlamak CL arabellek çözüm.
      1. 800 mL distile deiyonize H2O (ddiH2O) eklemek 1 M Tris· 20 mL CL, pH 7,45 (20 mM son konsantrasyonu) ve 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM son konsantrasyonu).
      2. PH 7,45 için ayarlayın. DdiH2O. filtre solution'ı 0.2 µm filtrasyon ünitesi ile 1000 ml ses düzeyini ayarlayın.
    2. 1 M Sükroz çözüm hazırlamak.
      1. Tris· 100 mL için CL arabellek çözüm, 68.46 g Sükroz ekleyin. Tris· ile 200 mL için ses düzeyini ayarlama CL arabellek çözüm. 0.2 µm filtrasyon ünitesi ile çözüme filtre.
    3. Tris· 1 M Çözümle sulandrarak 200 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi hazırlamak CL arabellek çözüm 0.83:0.16 (vol/vol).
    4. Tris· 1 M Çözümle sulandrarak 150 mL 0,83 M Sükroz çözeltisi hazırlamak CL arabellek çözüm 0.83:0.16 (vol/vol).
  2. Beyin elde edilen ham miyelin enkaz topluluğu
    Not: Burada açıklanan koleksiyonu ham miyelin enkaz yalıtım için yöntemidir.
    1. 10-12 fareler 8-10 hafta-in yaş servikal çıkığı tarafından izlenen standart CO2 boğulma yönergeleri uygulayarak ötenazi.
    2. Beyni incelemek ve 10 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi içeren bir 100 mm tabak koyun.
Buz üzerinde çanak tutmak.
  • Beyin içine kesilmiş steril Cerrahi makas kullanarak boyutu yaklaşık3 5 mm parçaları.
  • 50 mL konik santrifüj tüpü doku transferi ve yaklaşık 30 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi ekleyin.
  • Düzgün bir çözüm elde kadar steril bir el döner homogenizer ile homojenize.
  • Homojenize beyin son hacmiyle 0.32 M Sükroz çözüm ile 90 mL seyreltik.
  • Altı 38,5-mL ince duvarlı polipropilen ultracentrifuge tüpler için 20 mL 0,83 M Sükroz çözeltisi ekleyin.
  • Yavaşça homojenize beyin çözüm iki kat karıştırmak için değil dikkat çekici 0,83 M Sükroz çözüm en üstüne ekleyin.
  • Her tüpün 0.32 M Sükroz çözüm ile denge.
  • Uygun bir kullanarak 4° C'de 45 dk için 100.000 x g, santrifüj ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama miyelin enkaz kaybını azaltmak için en düşük değerlerine geri ayarlayın.
  • Miyelin enkaz iki Sükroz yoğunlukları arabiriminden toplamak.
    Not: enkaz tüp merkezine doğru beyaz bir grup olarak görünmelidir.
  • Ham miyelin enkaz bir 50 mL konik santrifüj tüpüne birleştirmek ve yaklaşık 35 ml Tris· kullanarak ses seviyesini CL arabellek çözüm.
  • 30-60 s için steril bir el döner homogenizer ile ham miyelin enkaz lunaparkçı.
  • Süspansiyon 6 temiz ultracentrifuge tüpleri ve Tris· uygun bir hacmi ile denge arasında eşit olarak bölmek CL arabellek çözüm.
  • Uygun bir kullanarak 4° C'de 45 dk için 100.000 x g, santrifüj ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine döndürecek.
  • Katı beyaz granül şimdi görünür olacak gibi süpernatant atmak ve granül 10-15 mL Tris· yeniden askıya alma CL arabellek çözüm.
  • Süspansiyon 2 temiz ultracentrifuge tüpler ve Tris· uygun bir hacmi ile denge arasında eşit olarak bölmek CL arabellek çözüm.
  • Santrifüj tekrar 100.000 x g için uygun bir kullanarak 4 ° C'de 45 dk de ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine döndürecek.
  • Süpernatant atın ve 5-6 mL steril PBS granül resuspend ve süspansiyon önceden ağırlığını 1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri uygun sayıda arasında bölün.
  • 4 ° C'de 10 dakika için 22.000 x g, santrifüj
  • Süpernatant atın ve miyelin enkaz parçaları ağırlığını belirlemek.
  • Granül, yeniden 100 mg/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde askıya alma.
    Not: on kadar twelve beyin da 10-15 mL 100 mg/mL miyelin enkaz üretmek için yeterlidir. Miyelin enkaz-80 ° C'de deposu için 6 ay olabilir.
  • Miyelin enkaz floresan etiketleme
    1. 50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) çözüm kullanımdan hemen önce hazırlayın.
      1. Steril PBS kullanarak, 5 mM stok çözeltisi % 100 Dimetil sülfoksit (DMSO) 50 µM son çalışma konsantrasyon için hazırlanan CFSE oranında seyreltin.
      2. Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre.
    2. 100 mg/mL miyelin enkaz istenilen miktarda çözülme ve steril 29 g iğne ile yeniden askıya alma.
      Not: miyelin enkaz buz gibi o çözüm resuspension kullanmadan önce gerektiren kadar neden olur.
    3. Miyelin enkaz önceden ağırlığını 1.5 mL mikro-santrifüj tüpü aktarın.
    4. 4° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.
    5. CFSE çözüm pelleted 100 µL miyelin enkaz başına 200 µL miyelin enkaz resuspend.
    6. Oda sıcaklığında ışıktan korunan (RT) 30 dk için kuluçkaya.
    7. 4 ° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.
    8. Pelet yıkama arabellek 600-800 µL içinde resuspend (0.2 µm filtre sterilize PBS 100 mM glisin).
    9. 4 ° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.
    10. Adımları 2.3.8-2.3.9 iki kez daha tekrarlayın.
    11. Son yıkama sonra miyelin enkaz Pelet ağırlığını belirlemek ve 100 mg/mL steril PBS ile yeniden askıya alabiliriz.
      Not: Etiketli miyelin enkaz 6 aya kadar-80 ° C'de deposu olabilir.

    • 3. miyelin enkaz fagositoz tahlil

    Not: Fagositoz fluorescently etiketli miyelin enkaz gözlemlemek için temel yöntem aşağıdadır. Diğer tedaviler ve deneysel koşullar ek araştırmacı tarafından optimize edilmiş olması gerekir.

    1. Tedavi plakaları hazırlanması
      1. Her 145 mm plaka için olgun BMDMs Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (dPBS) (pH 7,4) 5-6 mL 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kullanarak bir 15 mL konik santrifüj tüpüne toplamak.
        Not: Hücreleri18etkinleştirme durumunu değiştirebilir tripsin kullanmayın.
      2. Önceden ısıtılmış CMCM eşit bir hacmi kendine hakim hücre her tüp için ekleyin.
      3. 8 dk. 20 ° C'de için 180 x g, santrifüj Süpernatant atmak.
      4. Hücreleri CMCM ve sayısı alanındaki yeniden askıya alma.
      5. 24-şey hücre kültür plaka her şey için CMCM 1 mL 1 x 105 hücreleri ekleyin.
      6. 37 ° c, % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.
    2. Miyelin enkaz tedavi ve analiz
      1. Miyelin enkaz için her şey (son konsantrasyonu 1 mg/mL) olarak 100 mg/mL CFSE 10 µL etiketli ekleyin.
      2. 1-3 saat 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.
      3. Plaka sigara yuttu miyelin enkaz kaldırmak için 3 kez steril PBS ile yıkayın.
      4. 400 µL % 4 paraformaldehyde, her şey için ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya
      5. Plaka 2 kez steril PBS ile yıkayın.
      6. Höchst 33258 çözüm 400 µL her şey için ekleyin. Işıktan korunan RT, 5 min için kuluçkaya.
      7. Tabak 2 kez steril PBS ile yıkayın.
      8. Fluoro-jel 200 µL Tris arabelleği ile photobleaching azaltmak için her şey için ekleyin.
      9. Görüntü hücre ters bir epi-floresan yetenekli mikroskop kullanarak.
        Not: CFSE uyarma ve emisyon dalga boylarında 494 vardır nm ve 521 nm, anılan sıraya göre.
      10. CFSE pozitif hücre sayısı çekirdeği göreli miyelin enkaz alımını belirlemek için sayıya bölme.
      11. Görüntüleme önce plakaları ışıktan korunan 4 ° C'de 7 güne kadar korumak.

    4. yağ kırmızı-O boyama ile hücre içi lipidler miktar

    Not: Hücre içi miyelin enkaz türetilmiş lipidler gözlemlemek için temel yöntem aşağıdadır.Miyelin enkaz etiketli CFSE kullanımı nedeniyle spektral örtüşme boyama ORO floresan miktar için tavsiye edilmez. Diğer tedaviler ve deneysel koşullar ek araştırmacı tarafından optimize edilmiş olması gerekir.

    1. Hazırlık çözümler boyama
      1. % 0,5 yağ kırmızı-O (ORO) Boyama çözüm hazırlamak.
        1. Yavaş yavaş ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) karıştırma süre. 0,5 g % 100 propilen glikol (1,2-Propanediol) 100 mL eklemek
        2. Çözüm 95 ° C'de 15 dakika veya tüm büyük parçacıklar çözünene kadar ısı.
          Not: üzerinde 100 ° c ısı değil
        3. Solution'ı filtre kağıt hala sıcak iken yeni bir konteyner içine filtre.
        4. Serin gecede RT. çözüm çözüm-ebilmek var olmak stok RT. ilâ 1 yıl için izin
      2. %85 propilen glikol çözeltisi hazırlamak.
        1. % 100 propilen glikol 85 mL ddiH2O. kadar karışık heyecan için 15 mL ekleyin. Çözüm-ebilmek var olmak stok ilâ 1 yıl RT.
    2. Tedavi plakaları hazırlanması
      1. Tabi belgili tanımlık yöntem Bölüm 3'te özetlenen bir 24-şey tabak hazırlamak.
      2. 37 ° c, % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.
    3. Miyelin enkaz tedavi
      1. 100 mg/mL miyelin enkaz 10 µL her şey (son konsantrasyonu 1 mg/mL) ekleyin.
      2. 1-3 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya.
      3. Plaka sigara sindirilmiş miyelin enkaz kaldırmak için 3 kez steril PBS ile yıkayın.
        Not: Bu noktada, tabaklar da hemen fiksasyon uygulayabilir veya taze CMCM eklenebilir ve hücreleri kuluçka için ek zaman Puan girildi.
      4. 400 µL % 4 paraformaldehyde, her şey için ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya
      5. 2 kez ile steril PBS sonra procced boyama için plaka yıkayın.
    4. ORO boyama ve analiz
      1. Sabit plaka ddiH2O. ile 3 kez yıkamak
      2. Her şey % 100 propilen glikol 400 µL ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya
        Not: Bu ertelenmiş ddiH2O. azaltır
      3. Propilen glikol Aspire edin ve her şey için 400 µL ORO çözüm ekleyin.
      4. 8 dk. 60 ° C'de için kuluçkaya
      5. ORO çözüm Aspire edin. Daha sonra her şey için % 85 propilen glikol 400 µL ekleyin ve RT., 5 minumintes için kuluçkaya
      6. Plaka ddiH2O. ile 3 kez yıkamak
      7. Höchst 33258 çözüm 400 µL her şey için ekleyin. RT, ışıktan korunan, 5 min için kuluçkaya.
      8. Tabak 2 kez steril PBS ile yıkayın.
      9. Fluoro-jel 200 µL Tris arabelleği ile her şey için ekleyin.
      10. Görüntü hücre ters bir epi-floresan yetenekli mikroskop kullanarak. ORO standart bir Texas kırmızı veya DsRed filtre seti kullanarak yansıma.
      11. ORO olumlu alanını her resim alanı belirleme ve çekirdeği sayısına bölen tarafından göreli lipid saklama ölçmek.
      12. İçin 7 gün 4 ° c seramik plakalar ışıktan korunan korumak.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Miyelin enkaz etiketli CFSE ile BMDMs tedavisinde açık içselleştirilmesi (Şekil 2) verim. 3 saatlik etkileşim vakit BMDMs sağlam aşağı akım algılama için yeterli eklenen miyelin enkaz phagocytose için yeterli olsa da, hücre içi birikimi ile etkileşim 1 saat kadar görülebilir. Ancak, bazı miyelin enkaz hala yıkandıktan sonra hücre yüzeyinde mevcut olabilir. Bu yetersiz yıkama veya tam değil içselleştirilmiş fagositoz erken evrelerinde parçacıkları nedeniyle olabilir.

    BMDMs hızla miyelin enkaz içselleştirmesi iken, lizozomal işleme önce ORO stainable lipid damlacıkları formu gereklidir. Göstermek için BMDMs miyelin enkaz ile 90 dakika boyunca inkübe, yıkanmış ve ek fiksasyon ve (şekil 3) boyama önce zaman miktarda için kültürlü. Şekil 4 tedavi başlatma ve tarafsız lipid görünümü arasında bir gecikme olduğunu gösterir. Ayrıca lipid saklama sırasında kültür istikrarlı değil dikkat edilmelidir. BMDMs yakında damlacık oluşumu sonra birikmiş yağlar metabolize etmeye başlayacaktır. Bu nedenle, bekleyen çamaşır uzak olmayan yuttu miyelin enkaz ve fiksasyon arasında 24 saat daha uzun öneririz.

    Miktar alan lekeli ORO miyelin lipid metabolizması BMDMs (şekil 5) oranını gösterir. 90 dakika etkileşim süre sonrasında, hücreleri taze CMCM kuluçka için iade edildi. Taze ortamda erken chase döneminde BMDMs fagosite miyelin enkaz lipid bileşen tarafsız ORO stainable lipidler metabolize. ORO pozitif alan sürekli bir artış etkileşim aşağıdaki saat içinde normaldir. 24 saat sonra ancak, BMDMs effluxed ya da hücre içi lipidler önemli bir kısmını metabolize edilir.

    Figure 1
    Resim 1 : Temsilcisi BMDM kültürler. Kaç yapışık hücreleri başlangıçta tespit edilecektir. 3 günde yapışık olmayan hücreler kaldırılır. Gün 7 tarafından olgun kemik iliği türevi makrofajlar gözlenir. Ölçek = 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 2
    Resim 2 : BMDM miyelin enkaz fagositoz görüntülerini temsilcisi tahlil. Hücreleri 1mg/mL 1 saat önce çamaşır ve % 4 ile fiksasyon miyelin enkaz etiketli CFSE ile tedavi PFA. İçselleştirilmiş miyelin enkaz bir epi-floresan yetenekli mikroskobunun standart GFP filtre kümesi kullanma görüntülenmeyecektir. Ölçek = 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 3
    Şekil 3 : Yağ kırmızı O (ORO) deneysel tasarım diyagramı. BMDM tedavi edilir 1 mg/mL miyelin enkaz (1: 100 seyreltme) ile 90 dakika boyunca ardından yıkama ve kültür fiksasyon önce taze ortamda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 4
    Şekil 4 : ORO miyelin enkaz fagositoz takip BMDM boyama. Aşağıdaki fiksasyon ile belirtilen zaman puan, BMDMs, PFA lekeli ORO ve Höchst 33258 ile % 4. Her zaman-nokta için temsil edici görüntüleri gösterilir. Ölçek = 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 5
    Şekil 5 : Sayısal görüntü analizi ORO boyama. Boyama ORO miktar için 3 Kuyu başına iyi 5 resim ile 20 X görüntüsü. Tüm görüntü alma ayarlarını aynıydı. Hata çubukları SEM = (n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Burada açıklanan yordamları taze izole kaba CNS miyelin enkaz ve birincil kemik iliği türevi makrofajlar kullanmaktadır. Hayvan harcamaları azaltmak için her iki beyin önerilir ve kemik iliği hücreleri kurban anda her fare--dan hasat. Birlikte çalışan iki araştırmacı aynı anda her iki malzeme hazırlayabilirsiniz. Alternatif olarak, beyin-80 ° c miyelin enkaz yalıtım önce antibiyotik ile takıma PBS içinde saklanır. Hiç beyin bizim deneyim ilâ 1 ay miyelin enkaz üretme potansiyeli sezilebilir kaybı için bu koşullarda muhafaza edilebilir.

    CFSE miyelin enkaz, kullanım kolaylığı ve floresan yoğunluğu nedeniyle etiketlemek için kullanılır. Hücresel esterazlar asetat grubu molekül14tarihinde ayırmak kadar boya yüzeyi kalır. Bırakılmış succinimidyl ester grubu sonra hücresel proteinler14kovalent bağlanma sonuçlanan birincil amidler ile tepki verebilir. CFSE standart yeşil flüoresan kanallarını kullanarak heyecanlı olmakla birlikte, var çeşitli türevleri farklı spektral özellikleri ile ticari olarak elde edilebilir. Böylece, birden çok floresan boyalar kullanarak benzer bir fagositoz tahlil tasarlamak mümkündür. Ayrıca boya kolayca plazma membran geçer çünkü bu etiket apoptotik hücreler için benzer bir şekilde miyelin enkaz19kullanılabileceğini belirtmek gerekir. Kullanıcı optimizasyon ile standart görüntü analizi üzerine bizim yöntem dayanır Ayrıca, miktar Akış Sitometresi veya görüntüleme sistemi yüksek işlem hacmi plaka kullanılarak gerçekleştirilemez.

    Yağ kırmızı o. (Solvent Kırmızı 27 veya Sudan kırmızı 5B olarak da bilinir) yoğun histolojik örneklerinde nötr lipitler leke için kullanılan yağda çözünen bir boya olduğunu. Koyu kırmızı onun pigmentasyon parlak alan ve floresan mikroskopi5,20ile hücre içi lipidler görselleştirme sağlar. Floresan mikroskopisi kullanılarak tek kanal görüntüleme ve sağlam miktar, lipid damlacıkları lekeli ORO için sağlar. Boyama yöntemi basit ve son derece tekrarlanabilir olmakla birlikte, numune hazırlama sırasında özen göstermelidir. Hücre içi lipidler, yoğunluk boyama içinde belirgin bir şekilde azaltılmasına yol çözünebilmektedir gibi alkol veya asit tabanlı Fiksajlar kullanılmaması, önemlidir. Ayrıca, herhangi bir sayısal görüntü analizi ile standart görüntü yakalama ayarlarını ve yeterli yansız örnekleme önemini gösterişsiz değil. Denetimleri boyama kullanımı herhangi bir örnek otomatik Floresans için hesap için önerilir. Boyama gibi denetimleri aynı şekilde tedavi edilmelidir, ama sol arka plan otomatik Floresans düzeyini ölçmek için ORO ile günahı. Öyle olsa bile, bizim görüntü analiz yöntemi diğer lipid miktar teknikleri, daha az optimizasyonu gerektirir gibi standart eğri hazırlık gerektiren ORO ayıklama yöntemi21için deneysel değişkenliği daha yatkın ve gerektirir örnek imha. Temel görüntü analizi kullanımı birkaç vardır o geleneksel ORO çıkarma yöntemleri üzerinde tahribatsız bu avantajları ve immunostaining21,22 ile uyumludur.

    Açıklanan yordamları nispeten düz ileri olmakla birlikte, son olarak, bu makrofajlar patojen endotoksin gibi moleküler desenleri (PAMPS) ilişkili tanımak birden çok reseptörleri hızlı beri uygun aseptik tekniği, kullanılması önemlidir lipopolysaccharide (LPS)23. Bakteriyel ile etkileşim kirlenmektedir neden makrofaj harekete geçirmek içinde ve onların işlevi24,25dramatik değişiklik yapabilirsiniz. Toplanan miyelin enkaz gelince kirlenme için test tavsiye edilir. Endotoksin algılama yöntemleri limulus amebocyte lysate (LAL) tahlil gibi yüksek hassasiyet var ve daha önce bu uygulama5,19için kullanılmıştır.

    Makrofajlar sağlık ve hastalığında önemli bir rol oynamaktadır, henüz BMDMs rol CNS yaralanma bağlamında şu anda soruşturma önemli bir konudur. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, araştırmacılar tarafından BMDMs miyelin enkaz fagositoz mekanizmasının daha iyi anlamaya başlayabilirsiniz.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

    Acknowledgments

    Yazarlar Glenn Sanger-Hodgson, medya uzmanı FSU Üniversite Tıp video prodüksiyon, düzenleme ve ses çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum.

    Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (R01GM100474 ve R01GM072611) destek verdi.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM GE Healthcare Life Sciences SH30243.01 High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate
    Penicillin-Streptomycin Solution Corning 30-002-CI 100X Solution
    New Born Calf Serum (NCS) Rocky Mountain Biologics NBS-BBT-5XM United States Origin
    NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]  ATCC CCL-1 L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation
    24-well Cell Culture Plates VWR 10062-896 
    Cell Culture Dish Greiner Bio-One 639960 Polystyrine, 145/20mm
    CFSE Cell Proliferation Kit Thermo Fisher C34570 DMSO for Reconsitution Provided
    Fluoro-gel with Tris Buffer  Electron Microscopy Sciences 17985-11
    Oil Red O Sigma Aldrich O0625
    Equipment
    Materials Company Catalog Number Comments
    Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 326823 Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor Beckman Coulter 369650 SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium
    Hand Held Rotary Homogenizer Fisher Science 08-451-71

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
    2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
    3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
    4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
    5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
    6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
    7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
    8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
    9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
    10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
    11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
    13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
    14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
    15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
    16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
    17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
    18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
    19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
    20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
    21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
    22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
    23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
    24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
    25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

    Tags

    Neuroscience sayı: 130 kemik iliği türevi makrofaj fagositoz miyelin enkaz yağ kırmızı O carboxyfluorescein succinimidyl ester Medulla Spinalis Yaralanmalarında neurotrauma
    <em>Vitro</em> Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B.,… More

    Rolfe, A. J., Bosco, D. B., Broussard, E. N., Ren, Y. In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (130), e56322, doi:10.3791/56322 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter