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Cancer Research

Micro-ARN après biopsie liquide : L’expérience de la miRNA Plasma Signature classificateur (SMC) pour le dépistage du Cancer du poumon

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56326
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici le protocole détaillé adopté dans le BioMILD screening trial pour réaliser le test de classificateur de signature microARN circulants pour une détection précoce de cancer du poumon.

Abstract

Le développement d’un test peu invasif, comme la biopsie liquide, pour la détection précoce du cancer du poumon en phase préclinique est essentiel pour améliorer les résultats de cette maladie mortelle. MicroARN (miARN) sont des tissus spécifiques, petites, non-codage RNAs régulant l’expression de gène, qui pourrait agir comme messagers extracellulaires de signaux biologiques provenant de la diaphonie entre la tumeur et son microenvironnement environnant. Elles pourraient représenter ainsi les candidats idéaux pour la détection précoce du cancer du poumon. Dans cet ouvrage, un flux de travail méthodologique pour la validation prospective d’un test de miRNA circulant à l’aide de cartes personnalisé fait microfluidique et quantitative Real-time PCR dans des échantillons de plasma de volontaires inscrits à un essai de dépistage le cancer du poumon est proposé. En outre, étant donné que la libération des miARN liées à une hémolyse et questions techniques plus générales peut-être affecter l’analyse, les mesures de contrôle de la qualité incluses dans les procédures d’utilisation normalisées sont également présentées. Le protocole est reproductible et donne des résultats quantitatifs fiables ; Toutefois, lorsque vous utilisez de grandes séries cliniques, caractéristiques fois pré-analytique et analytiques doivent être prudemment évaluées.

Introduction

Cancer du poumon est le plus couramment diagnostiqué du cancer dans le monde entier, soit environ 25 % des diagnostics du cancer1. Malgré la réduction constante depuis 2 décennies, principalement en raison de l’usage du tabac réduit, taux de mortalité pour le cancer du poumon, cancer du poumon demeure la principale cause de décès par cancer chez les hommes et les femmes. En 2017, il est prédit à compte pour environ 25 % et 20 % de la mortalité par cancer total aux États-Unis et en Europe, respectivement1,2.

Étant donné que les symptômes ne se produisent pas habituellement en précoce de la maladie, la majorité des cancers du poumon est diagnostiquée aux derniers stades. Cela conduit à une possibilité limitée d’intervention thérapeutique et la faible efficacité des traitements3. Par conséquent, beaucoup d’efforts scientifiques visent à identifier un test efficace pour la détection précoce de cancer du poumon.

Une variété d’essais de dépistage indique que la radiographie pulmonaire n’a aucune valeur dans le dépistage du cancer du poumon, tandis que le faible dose calculé tomographie (TPMD) est un meilleur outil par rapport à la radiographie pour la détection précoce stade lung cancer4. En outre, il a été démontré thatscreening avec l’utilisation du TPMD mortalité due au cancer du poumon a réduit jusqu'à 20 % chez les actuels et anciens gros fumeurs5. Ces données appuient l’utilisation du dépistage du cancer du poumon dans une population à risque élevé tels que définis dans les lignes directrices de plusieurs sociétés professionnelles4,6.

Noter que, parmi les principales préoccupations sur le dépistage du TPMD, il y a le taux élevé de faux positifs et de surdiagnostic. Que dans ces conditions, la communauté scientifique est à la recherche d’une stratégie surmonter ces problèmes et d’augmenter la spécificité du dépistage TPMD. Le développement de biomarqueurs complémentaires non invasive pourrait être utile ici. A ce jour, il y a une longue liste de biomarqueurs candidats incriminés, tels que les miARN, ADN acellulaire, méthylation de gène, petites protéines et autres7.

Biomarqueurs sanguins, y compris les biomarqueurs de la réponse immunitaire et de brassage de miARN, sont ceux qui atteignent la phase de validation plus avancé8. Les biomarqueurs de la réponse immunitaire sont basés sur la connaissance que les réponses immunitaires contre les deux antigènes intracellulaires et surface de tumeur sont fondés en lung cancer patients9. Par exemple, Ajona et al. évalué le rôle de C4d, un produit de dégradation de la voie classique de complément, dans le diagnostic et le pronostic du cancer de poumon10. Dans le cas contraire, un sérum d’autoanticorps commercialement disponible test examen sept tumeur aux antigènes a été validée dans des patients de cancer du poumon non à petites cellules et a montré les 36 % de sensibilité et de 91 % de spécificité11. Biomarqueurs de la réponse immunitaire sont intéressantes, mais les études de validation supplémentaires sont nécessaires pour une application clinique potentielle.

miARN est endogènes petit non-codantes RNAs avec un mécanisme conservée et une grande importance fonctionnelle partout dans les royaumes animales et végétales. Le rôle des miARN est de réglementer la traduction des protéines : ils répriment l’expression d’un grand nombre de gènes de cible12. Il a été bien documenté qu’expression des altérations ofmiRNAs contribue à la pathogenèse de la plus humaine du cancer12,13,14. En outre, les tumeurs et cellules stromales libèrent miARN, stabilisé par leur incorporation dans des microvésicules ou par l’intermédiaire de liaison aux protéines de liaison à l’ARN, dans les liquides organiques comme le sérum et le plasma15,16, urine17 et18de la salive. Circulation des miARN peut refléter ainsi la réponse de l’hôte et l’interaction dynamique entre la tumeur et son microenvironnement19. Pris ensemble ces observations ont fait miARN circulant une classe prometteuse de biomarqueurs pour la détection du cancer chez l’homme.

MiARN en circulation peut être détecté à l’aide de différentes méthodes : microarray plates-formes20, quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR)21et la prochaine génération séquençage (NGS)14,22. Diverses études de profil d’expression basées sur les technologies susmentionnées ont été développés ces dernières années. « Microarray » est une technologie de haut-débit, capable d’analyser des milliers de miARN en un seul essai. Toutefois, il a une plage dynamique plus faible et une spécificité par rapport à la RT-qPCR ou NGS. En outre, « microarray » est une méthode non quantitatifs, outre la validation expérimentale est requise. Méthodes axées sur la séquence peuvent permettre l’identification des miARN inconnu et conviennent notamment dans une phase de découverte. En revanche, méthodes end sont encore coûteux et nécessitent un équipement spécial et les bioinformaticiens experts, ce qui limite leur utilisation dans les cohortes de validation grandes et dans des milieux cliniques23. Pour le moment, RT-qPCR est la plate-forme plus adoptée pour détection de miRNA dans un contexte clinique/diagnostic24en circulation. Il existe différentes RT-qPCR technologies disponibles pour l’analyse des miARN, mais la tige-boucle RT suivie TaqMan PCR est le plus largement utilisé25. Cette technique est extrêmement sensible et précis (simple discrimination de nucléotides) et a une plage dynamique élevée ; Cependant, il permet la détection des miARN connus seulement.

Le contrôle de qualité des micro-ARN Mestdagh et coll. étudiées les caractéristiques de certaines plates-formes disponibles dans le commerce de miARN profilage basé sur les trois technologies susmentionnées26étude (étude miRQC). En analysant les 196 miARN dans les tissus et les échantillons de sérum, les performances des différentes plates-formes a été évaluée en termes de reproductibilité, sensibilité, précision, spécificité et concordance de l’expression différentielle. Les résultats ont montré que plates-formes basées sur la NGS et microarray technologies avaient une reproductibilité et une spécificité plus élevée, mais RT-qPCR plates-formes étaient plus précis et sensible et avaient un taux de détection plus élevé, surtout pour les faibles échantillons d’ARN d’entrée, tels que les corps fluides. RT-qPCR semble donc être la méthode la plus appropriée pour une application potentielle dans le diagnostic clinique de routine.

En 2011, Sozzi et coll. a analysé le profil de miRNA d’échantillons plasmatiques prélevés volontaires inscrits dans une première TPMD screeningtrial (procès INT-IEO)27 et quatre signatures de miRNA, composés par des rapports réciproques parmi les 24 circulant miARN ont été générés. Ces signatures ont été capables de discriminer les individus libres de la maladie chez les patients avec n’importe quel ou mortelle du cancer du poumon au temps ou jusqu'à 2 ans avant TPMD maladie détection28. Dans un autre document, le même groupe a décrit pour la première fois le classificateur de signature de miRNA (MSC), obtenu en combinant les quatre signatures de miRNA afin de répartir les patients en trois niveaux de risque : faible, intermédiaire et élevé. Son utilité clinique a été validée dans un grand ensemble de rétrospectif de plus de 1 000 individus inscrits dans l’essai de dépistage doux, une étude randomisée comparant annuelles ou bisannuelle armes TPMD avec une observation bras29. En effet, la combinaison du CSM et du TPMD réduit le taux de faux positifs du TPMD par environ 5 fois, et les trois groupes de risque MSC étaientassociée à la survie globale.

Plus tard, en 2013 à la « Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori » (Milan, il) un éventuel dépistage du procès (BioMILD) portant application du TPMD présentant le plasma fonction MSC test a été lancé. Volontaires, recrutés pour l’essai BioMILD subissent retrait TPMD et le sang qui est traitée immédiatement pour séparer le plasma pour miRNA profilage à l’aide de cartes personnalisé fait microfluidique. La combinaison des résultats TPMD et MSC définit le spécifique dépistage algorithme24.

Dans le présent travail, l’ensemble du protocole méthodologique utilisé dans le procès de BioMILD est décrit, à partir de prélèvement d’échantillons de sang, à l’isolement de plasma, extraction de l’ARN, et l’expression de 24 miARN profilage à l’aide personnalisée fait RT-qPCR microfluidique cartes. Compte tenu de la haute consistance et la reproductibilité, ces procédures peuvent également servir pour le développement de biopsies liquides miRNA-basés dans d’autres maladies.

Protocol

le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de recherche de notre institution.

1. prélèvement d’échantillons de plasma

  1. collecter 10 mL de sang total échantillon en tubes Vacutainer avec enduit de jet K 2 EDTA et conserver à température ambiante.
    Remarque : Afin de minimiser l’hémolyse, séparer le plasma moins de 2 h. Ne pas stocker le sang total à basse température (i.e., 4 ° C) pour éviter tout choc thermique et cell lyse qui aboutira à une libération de miRNA non-spécifique.
  2. Dans 1 h, séparer le plasma par une première étape de centrifugation à 1 258 x g et 4 ° C pendant 10 min.
  3. Transférer le plasma surnageant dans un tube de 15 mL, évitant soigneusement le contact avec la bague lymphocytique.
  4. Centrifugation du plasma une seconde fois à 1 258 x g et 4 ° C pendant 10 min.
  5. Aliquot 1 mL de plasma dans 1,5 mL cryovials, évitant la collecte de la fraction du plasma à la base du tube de.
  6. Stocker tous les aliquotes à − 80 ° C, sauf pour l’évaluation de l’hémolyse. L’analyse moléculaire doit être effectuée dans les 5 semaines.

2. Évaluation de l’hémolyse par mesure spectrophotométrique

  1. immédiatement après l’étape de séparation de plasma, dans une cuvette pour spectrophotométrie, faire un 01:10 dilution de l’échantillon de plasma en 1 X PBS (p. ex., 100 µL de plasma en 900 µL de 1 X PBS) et remuer pour homogénéiser it.
    Remarque : L’échantillon de plasma ne doit pas être congelé avant les mesures spectrophotométriques, comme le gel-dégel de l’échantillon (et en particulier dans les échantillons lipémiques), pourraient former flocule qui interfèrent avec l’analyse spectrophotométrique.
  2. Lire l’absorbance à 375 nm, 414 nm, 541 nm et 576 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, avec une correction de base s’établit à 750 nm et une longueur de chemin d’accès de 10 mm. effectuent une mesure vide en utilisant 1 mL de PBS 1 x.
  3. Calculer le rapport entre l’absorbance à 414 nm et 375 nm ; si supérieure à 1.4, examiner les échantillons hémolysés et répéter le prélèvement de sang (QC1 dans le tableau 1).

3. Extraction de l’ARN plasmatique Total

  1. préparer une solution de 1-thioglycérol/homogénéisation (OMG) avec 20 µL de 1-thioglycérol / mL de Solution d’homogénéisation. 1-thioglycérol étant visqueuse, Pipetter soigneusement pour une mesure précise. Refroidir la Solution OMG sur glace ou entre 2 et 10 ° C avant de l’utiliser.
    Remarque : La solution de travail est stable à 2-10 ° C pendant 1 mois.
  2. Suspendre la lyophilisé DNase I en ajoutant 275 µL d’exempte de nucléase dans le flacon de l’eau et mélanger délicatement (ne pas de vortex). Comme une aide visuelle, ajouter 5 µL de bleu teindre à la DNase reconstituée j’et verser la solution dans des jetables aliquotes dans des tubes exempte de nucléase. Stocker reconstitué DNase I à-30 ° C à -10 ° C.
  3. à partir de 200 µL de plasma, ajouter 200 µL de la solution OMG réfrigérée.
  4. Vortex 15-30 s afin d’assurer une homogénéisation complète. En cas de formation de mousse, laisser l’échantillon s’installent sur Ice.
  5. Ajouter 200 µL de tampon de lyse et 25 µL de protéinase K dans l’échantillon homogénéisé et vortexer pendant 20 s.
  6. Incuber les échantillons pendant 15 min dans un thermomixer préalablement chauffés à 37 ° C.
  7. Charger une cartouche pour chaque échantillon sur le plateau de la platine de l’instrument et placer le plugger dans la bonne position.
  8. à la position appropriée dans la cartouche de l’instrument de transfert le lysat.
  9. Ajouter 5 µL de DNase I solution vers la position appropriée dans la cartouche.
  10. Ajouter 60 µL d’eau exempte de nucléase à la base de chaque tube d’élution.
  11. Sélectionner le " RSC miRNA tissu " méthode et commencer l’épuration automatisée exécute. Les échantillons d’ARN totales peuvent être conservés à − 80 ° C.

4. Axée sur le TAQ RT

  1. utiliser le Taq RT Primer Pool avec le miARN d’intérêt afin de convertir l’ARN d’ADNc avec le Kit de Transcription inverse Taq microARN.
  2. Préparer 12 µL du mélange réactionnel RT sur la glace dans un tube de microtubes de 1,5 mL selon les instructions du kit, avec 6 µL du Taq personnalisé RT Primer Pool.
  3. Ajouter 3 µL d’ARN pour un volume final de 15 µL de total et incuber dans la glace pendant 5 min.
  4. Charger la réaction de RT sur un thermo-cycler configuré comme suit : 16 ° C, pendant 30 min, 42 ° C pendant 30 min, 85 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.
    Remarque : L’ACQ peut être conserver à -15 à-20 ° C pendant au moins une semaine.

5. Pré-amplification

  1. Mix 2,5 µL de chaque produit RT avec 12,5 µL du mélange réactionnel Taq x 2, 3,75 µL Taq Custom piscine et 6,25 µL exempte de nucléase l’eau, pour un volume total de 25 µL.
  2. Effectuer la réaction de pré-amplification à l’aide d’un thermo-cycler selon le profil thermique suivant : 95 ° C pendant 10 min, 55 ° C pendant 2 min, 72 ° C pendant 2 min, 12 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 4 min , puis maintenez à 99,9 ° C pendant 10 min et à 4 ° C.
  3. Diluer le produit en ajoutant 175 µL de 0,1 X TE, pH 8.0.
    Remarque : Le produit dilué peut être conserver à -15 à-20 ° C pendant au moins une semaine.

6. Réaction de RT-qPCR sur Custom Taq tableau microARN cartes

  1. utiliser le microfluidicCustom 384 puits Taq tableau MicroRNA carte pour mesurer les concentrations plasmatiques des 24 miRNAs spécifiques (repérés en double exemplaire) sur 8 échantillons simultanément. MiRBase ID (v21) pour les 24 miARN sont : a-miR-101-3 p. p a-miR - 106 a - 5p, a-miR-126-3, p a-miR - 133 a - 3P, a-miR-140-3, a-miR-140-5 p, p a-miR-142-3, a-miR-145-5, a-miR - 148 b - 3P, p a-miR - 15 b - 5p, a-miR-16-5, a-miR-17-5 p, a-miR-197-3 p, p a-miR - 19 b - 3P, a-miR-21-5, a-miR-221-3 p, p a-miR-28-3, a-miR - 30 b - 5p, a-miR - 30C - 5p, a-miR-320 a, a-miR-451a, a-miR-486-5 p, a-miR-660-5 p et a-miR - 92 a - 3P
  2. Mix 1.13 µL de l’échantillon dilué de préampli avec 56,25 µL de 2 X Taq Universal Master Mix et 55.69 µL d’eau exempte de nucléase dans un tube de 0,5 mL.
  3. Charger jusqu'à 8 mélange de réaction PCR sur les cartes personnalisées Taq tableau microARN.
  4. Centrifuger à 311 x g pendant 2 min.
  5. Joint la carte personnalisée avec le scellant de carte tableau.
  6. Fonctionner le temps réel de réaction à l’aide d’un système de PCR en temps réel modifiant les paramètres comme suit : 94,5 ° C pendant 10 min, 40 cycles de 97 ° C pendant 30 s et 59,7 ° C pendant 60 s.

7. Extrapolation de données et génération de rapports

  1. utilisation du logiciel pour obtenir les valeurs brutes de Ct, définissant une base automatique pour éliminer les signaux de fond et un seuil fixe de 0,15 pour tous les échantillons et les analyses. Enlever les taches avec courbes de pauvres amplification et/ou mauvaise référence passive signaux.
  2. Exporter les valeurs brutes de Ct en " .xls " format et utilisez la valeur Ct moyenne des deux doublons pour une analyse ultérieure.
  3. Corrélation miARN ' des niveaux d’expression de mesures historiques sur des échantillons de l’étude clinique (Tableau 2). Si au moins 50 % des échantillons sur chaque carte personnalisée microfluidique fait entraîner un Pearson ' corrélation s < 97,5, répétez la carte (QC2 dans le tableau 1).
  4. Calculer le − ΔCts entre tous les miARN, équivalent aux valeurs des ratios miRNA log2.

8. Évaluation de l’hémolyse par le miRNA connexe Signature

  1. générer la signature de miRNA hémolyse liés en utilisant les ratios de miRNA suivants avec les seuils respectifs (valeurs log2) pour les échantillons de plasma de stockage courte (1 à 5 semaines à − 80 ° C) : miR-126/451 < − 0,07, 15 b/451 < − 3,67, 221/451 < − 3.18, 30 b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0,33, 15 b/486-5 p < − 3,86, 221/486-5 p < − 3,17, 30 b/486-5 p < − 1.42, 126/92 a < 1.8, 15 b/92 a < − 1.8, 221/92 a < − 1.04, 30 b/92 a < 0,87, 126/16 < − 2,85, 15 b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30 b/16 < − 3.68.
  2. Classer comme échantillons hémolysés dont au moins 50 % des ratios (8 sur 16) dépasse coupure respectif (QC3 dans le tableau 1).

9. Définition du niveau de risque : élevé, intermédiaire et basse

  1. définir les quatre signatures, des ratios de miRNA composer le SMC, comme indiqué dans la Figure 3 : risque de maladie (RD), risque de maladie agressive (RAD), présence de la maladie et présence d’une maladie agressive (PAD).
  2. Pour chaque signature, de définir les ratios dépassant la valeur seuil respectifs pour les échantillons de plasma de stockage courte (1 à 5 semaines à − 80 ° C). Le nombre de rapports dépassant devaient être prises en considération positive est 9 des 27 pour RD et PD et 14 des 28 pour RAD et PAD ( Figure 3 A).
    3. Attribut
  3. de chaque échantillon le niveau de risque MSC respectif comme suit : risque faible si RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg ; risque intermédiaire si RD pos ∪ PD pos ∩ RAD neg ∩ PAD neg ; ou un risque élevé si RAD pos ∪ PAD pos ( Figure 3 B).

Representative Results

Le procès de BioMILD est une étude prospective pour la détection précoce du cancer du poumon dans le but de tester l’efficacité d’une approche combinée du TPMD-MSC comme les tests de dépistage de première intention dans une grande cohorte d’individus gros fumeur. Une classe de risque est attribuée à chaque volontaire selon le critère de miRNA, qui évalue les rapports entre 24 plasmatique circulante miARN. Largement rapporté30,31,32, hémolyse est une question essentielle pour l’analyse de circulation miRNA, étant donné que les fausses résultats pouvaient être obtenus due à une libération non spécifique des miARN de globules. Dans le flux de travail méthodologique proposé, un contrôle de qualité pré-analytique étape (QC1 dans le tableau 1) afin d’identifier hémolysés et donc non analysables, les échantillons de plasma a été décrite. Figure 1 rapporte une analyse spectrophotométrique des hémolysés (Figure 1A) et des échantillons de plasma non hémolysé (Figure 1B) avec des valeurs respectives d’A414 versés conformément aux/A375 Office. Dans un contexte clinique étaient le résultat d’un test moléculaire est crucial pour la gestion des bénévoles, permet à cette QC1 répétant les prélèvements sanguins et, dans la plupart des cas, rétablir l’échantillon.

Après la transformation moléculaire, le rendement de la RT-qPCR doit être évalué avec précision afin d’identifier les problèmes techniques. Figure 2 A montre un RT-qPCR avec un faible rendement en raison d’un signal de mauvaise référence passive. Rechargement dans ce cas le produit de pré-amplification sur une nouvelle carte de microfluidique est recommandé. Lorsque la RT-qPCR fonctionne bien, comme dans la Figure 2B, la carte se rend à la première étape de contrôle de qualité analytique de post pour s’assurer que les valeurs d’expression de miRNA sont comparables avec la mesure historique (QC2 dans le tableau 1). Si l’étape QC2 échoue, un problème technique est survenu au cours de la transcriptase inverse ou dans les réactions de pré-amplification, et il convient de répéter le traitement moléculaire entière à partir de la transcription inverse.

La dernière étape de contrôle de la qualité (QC3 dans le tableau 1) évalue l’hémolyse également au niveau moléculaire. Les niveaux d’expression des 4 miARN spécifique des érythrocytes (mir-16, mir-451, p mir-486-5 et mir-92 a) ont été comparés à ceux de 4 non-hémolyse des miARN (mir-126, mir-15 b, mir-221 et mir-30 b), générer la signature de l’hémolyse liés miRNA composée par la 16 (4x4) ratios de miRNA. Les échantillons positifs sont classées comme hémolysés, tandis que des échantillons négatifs procéder pour le classement final du niveau de risque MSC comme décrit dans le protocole de l’article 9 et la Figure 3.

Figure 1
Figure 1 : Analyse spectrophotométrique des échantillons de plasma frais. Profils spectrophotométriques de (A), 2 échantillons hémolysés et échantillons de 2 plasma non hémolysé (B), mesurant le rapport d’absorbance entre les longueurs d’onde A414 versés conformément aux et A375 Office. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : RT-qPCR performance en microfluidique cartes analyse. Amplification et composants multiples terrains pauvres en comparant (A) et (B) cartes de bonne qualité microfluidiques. Tous les 24 miARN et un seul miRNA adaptables sont rapportés dans chaque panneau. Les parcelles multicomposants illustrent les signaux de référence passive qui se produisent dans ces réactions de la RT-qPCR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Algorithme MSC pour la stratification du risque. Les résultats représentatifs considérant 6 échantillons de plasma provenant de volontaires inscrits dans BioMILD screening trial. ()A) signatures des miRNA-ratios de risque de maladie (RD), risque de maladie agressive (RAD), présence de la maladie, présence d’une maladie agressive (PAD) et des valeurs seuils correspondantes (log2) pour les échantillons de plasma stockées à-80 ° C pendant au moins de 1 semaine et jusqu'à 5 semaines. (B) combinaison des quatre signatures de stratifier les échantillons analysables en haute (H), intermédiaire (I) et la faible maîtrise de (L) niveau de risque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Pièges et défis du flux de travail méthodologique
Comme BioMILD est la première étude prospective analyse des miARN circulants comme outil de diagnostic, seuils et seuils utilisés pour l’analyse de données sont extraits d’une série rétrospective. Afin de surmonter le problème de l’intervalle de stockage différent d’échantillons plasmatiques, les paramètres peuvent être affinées pour éventuellement obtenir une augmentation de la performance de MSC. Néanmoins, avant de commencer l’analyse de miARN, plusieurs aspects du processus global doivent être soigneusement évalués, tels que les critères d’inclusion, le prélèvement et le traitement, et l’algorithme de bioinformatique a adopté pour l’analyse des données. Les sections suivantes porteront sur les plupart des points critiques du flux de travail décrit dans le présent document, abordant les grands enjeux de chaque étape et puis proposer des stratégies pour les surmonter.

Population étudiée
Les critères de participation pour la BioMILD essai de dépistage sont : 50 à 75 ans vieux et lourds des fumeurs actuels ou anciens (moins de 10 ans) au moins 30 paquets-années et aucun antécédent de cancer dans les cinq ans. Dans cette population, la prévalence du cancer de poumon estimée et l’incidence par an étaient environ 1 % et 0,7 %, respectivement. Pour appliquer le critère MSC comme décrit dans la proposition de protocole, la population analysée devrait maintenir des caractéristiques semblables. En particulier, l’étape de QC2 décrite ci-dessus implique la comparaison avec les données historiques provenant d’une population semblable. Alors qu’une corrélation ci-dessous 97,5 pourrait être révélateur de problèmes techniques, d’autre part, la plupart des individus avec altérée taux circulants de miRNA reflétant le risque d’avoir un cancer du poumon sont en fait sous ce seuil. En d’autres termes, si l’étape QC2 avec les paramètres présentés ici s’applique à une population à risque plus élevé de développer un cancer du poumon, il peut exclure des échantillons acceptables. Paramètres de nouvelle, bonne référence devraient alors être définis qui sont spécifiques pour chaque population analysée en fonction de résultats escomptés.

Hémolyse et collecte de sang
La collecte d’échantillons biologiques est une étape cruciale pré-analytique, car elle peut altérer les caractéristiques et la qualité de l’échantillon et ainsi modifier les résultats définitifs des analyses. Au sujet des échantillons de sang, il est important de collecter du sang frais et de traiter l’échantillon aussi rapidement que possible. Échantillons doivent être conservés à 4 ° C ni congelés après le prélèvement de sang, puisque gel et de dégel des passages peuvent provoquer la lyse cellulaire (hémolyse) et dégradation de l’ARN. Pour minimiser le processus d’hémolyse, il est suggéré de séparer le plasma moins de 2 h de sang collection31 .

Hémolyse est en grande partie en raison de la dégradation des globules rouges (hématies) et sortie conséquente de leur contenu dans le milieu environnant. Cela pourrait être un problème pour faire circuler des miARN tests parce que sortie de globules rouges contenu intracellulaire modifie considérablement le profil de micro-ARN dans le sang, pouvant affecter l’exactitude de l’analyse fondée sur le plasma30.

Être capable d’identifier également un niveau minimal d’hémolyse dans des échantillons de plasma est crucial pour les études basées sur la circulation des miARN comme biomarqueurs. Hémolyse peut être évaluée initialement par inspection visuelle depuis après les deux étapes de centrifugation, que la couleur du plasma peut varier du jaune au rouge pour les échantillons fortement hémolysés. Toutefois, une inspection visuelle simple peut-être pas assez sensible dans le contexte de la recherche de biomarqueurs moléculaires.

Une méthode simple et pré-analytique pour identifier les échantillons hémolysés plasmatiques est la mesure spectrophotométrique à longueur d’onde (λ) = 414 nm de l’absorbance de crête principale de l’oxyhémoglobine, après rajustement approprié pour n’importe quelle autre source d’interférence. Pour cette raison, nous avons normalisé les 414 nm crête à la valeur de l’absorbance à 375 nm, indicative du contenu lipidique33. Alternativement, ou mieux, en combinaison, une hyperlipidémie-independenthemolysis score (HS) peut être utilisé34. Cette procédure par spectrophotométrie permet d’identifier au moins 6,1 mg/dL d’hémoglobine libre. Dans le cas contraire, les échantillons hémolysés peuvent être identifiés par le biais de la détection des miARN spécifique des érythrocytes. Étant donné que même un très faible pourcentage d’hémolyse peut induire une augmentation considérable de miRNA spécifique des érythrocytes niveaux32, Fortunato et coll. identifié une signature spécifique liée à l’hémolyse basée sur 16 miARN-ratios qui peuvent efficacement classer une hémolyse dans des échantillons de plasma33. Tous les essais mentionnés peuvent être utilisés en association depuis le rapport de l’absorbance 414/375 et/ou les HS sont adoptés dans une phase pré-analytique des économies supplémentaires, tandis que les miARN axés sur l’hémolyse de mesure peut être utilisé dans une phase post analytique comme un contrôle de la qualité étape.

Circulation des miARN d’isolement et de la pureté de l’ARN
L’extraction procédure RNA est une étape très influente pour le succès des analyses ultérieures. Extraction à partir d’un échantillon d’entrée faible, tels que plasma, doit être aussi efficace que possible pour assurer une quantification précise des miARN. Plasma est caractérisé par des concentrations élevées de beaucoup de protéines, y compris les nucléases et autres composants qui peuvent interférer avec les réactions enzymatiques en aval de la RT-qPCR et susceptibles d’affecter la détection en circulation-miARN. Plusieurs méthodes d’extraction ont été utilisées dans ces types d’études, mais en général, extraction organique suivie d’enrichissement de RNA à base de silice permet l’élimination des inhibiteurs de plasma mieux puis TRIzol seul35. Néanmoins, dans ces dernières années, extraction manuelle a été remplacée par extraction automatisée. Le risque minime de contamination, la reproductibilité supérieure et l’utilisation des temps économiques sont les principaux avantages des systèmes automatisés par rapport aux protocoles d’isolement manuel. En outre, les méthodes d’extraction automatisée a donné les plus hauts montants de miRNA d’échantillons de sang et de la plus grande efficacité par rapport aux protocoles manuel36.

Question de la normalisation
Normalisation des taux plasmatiques de miRNA est toujours un sujet controversé. En effet, les différences dans la qualité de l’échantillon ou la quantité peuvent interférer avec l’identification des véritables changements dans les niveaux d’expression de miARN causées par la présence ou le risque de maladies et donc conduisant à des interprétations données ambigu et trompeur des conclusions. Jusqu'à présent, l’absence de consensus a entraîné diverses de stratégies de normalisation37.

L’ARN total extrait d’échantillons de plasma est généralement au-dessous du seuil de méthodes de quantification standard telles que la spectrophotométrie UV ou basés sur la fluorescence spectrophotométrie, empêchant ainsi les RNA normalisation masse38. Par conséquent, un volume fixe plutôt qu’un montant fixe de l’ARN éluée doit être choisi comme entrée pour la réaction de RT39.

Entretien ménager transcriptions utilisées pour l’analyse de miRNA dans des échantillons de tissus, tels que RNU48 et RNU6, ne conviennent pas pour normaliser les mesures de miRNA extracellulaire, car les deux ne sont pas toujours détectables en circulation, en raison de la dégradation induite par la RNase40, et sont aussi déréglés dans une manière spécifique à une maladie37. On ne sait pas si toute circulation miARN pourrait servir efficacement en tant que contrôles de référence. Par exemple, miR-16 est fréquemment proposé pour l’entretien ménager, mais detits ont démontré qu’il est déréglementé dans des échantillons de plasma de cancer patients28,37. En outre, miR-16 niveaux sont fortement touchés par une hémolyse30.

Pour des dosages de haut débit mesure plusieurs miARN et normaliser la valeur de l’expression moyenne est généralement acceptées41, lorsqu’un nombre limité de miARN doit être analysée, cette approche de normalisation ne peut être appliquée. Afin de contourner la question de la normalisation, Boeri et coll. a déjà établi un algorithme basé sur les rapports réciproques entre 24 miARN28. Une telle approche, bien qu’il soit très utile pour le développement de l’outil de diagnostic, ne permet pas facilement distinguer effectivement modifié miARN qui peut-être avoir un rôle dans le développement de tumeurs et ainsi identifier les miARN comme calibrateurs fonctionne. Une autre stratégie efficace, adoptée par le groupe de Bianchi et coll. qui a développé un sérum miR-Test pour la détection précoce du cancer du poumon, s’inspire de normalisation sur la moyenne géométrique d’un groupe de 6 « ménage sérum-miARN » variant de moins entre les échantillons et classes de patients42.

Caractéristiques de miRNA liquides biopsie et demande potentielle
MSC à base de plasma est un test non invasif moléculaire étudie pour le diagnostic précoce du cancer du poumon chez les gros fumeurs. Le test MSC peut désigner des sujets intermédiaires ou à haut risque avant la détection du cancer du poumon par TPMD, haute sensibilité (sud-est, 87 %) et la valeur prédictive négative (VPN, 99 %). Plus précisément, MSC pourrait implémenter dépistage TPMD en réduisant les résultats faussement positifs à 3,7 %, de 19,7 % pour TPMD seul29. Le test MSC a également montré pour avoir une bonne performance pronostique lors de l’examen seul poumon cancéreux et pourrait être utilisé comme un outil de suivi seul ou en combinaison avec d’autres paramètres pathologiques cliniques43,44. Potentiellement, l’essai de maîtrise pourrait permettre une plus grande cohérence des algorithmes diagnostiques du cancer de poumon, diminuant ainsi le coût-efficacité du dépistage.

En plus de MSC, autres tests non-invasifs pour une détection précoce de cancer du poumon ont été signalés. Bianchi et al. proposé un circulation miR-Test basé sur une signature de 34-miRNA45, réduit à une signature de 13 miRNA42. Fordiscovery échantillons de sérum et de validation ont été obtenues de la continu Observation de fumer sujets (COSMOS) TPMD screening trial, jouée à l’Institution européenne d’oncologie (IEO, Milan, Italie). Le miR-Test montre la précision de 78 % pour la détection du cancer du poumon chez des volontaires à haut risque. Entre le sérum-13 miARN et le 24, composer le SMC, seulement 5 miARN se chevauchaient (miR-92 a, miR-30 b, miR - 30C, miR-148 a et p miR-140-5). Cela pourrait être dû aux différents types de démarrage des échantillons (sérum ou plasma) et à l’élaboration de données. En fait, pour l’essai de miR, les auteurs sélectionnés miARN de 6 se comportant comme l’entretien ménager dans le sérum, dont 3 figuraient également parmi les ratios de miRNA MSC (miR-15 b, miR-19 b et miR-197). Néanmoins, le SMC dans le plasma et le miR-Test dans le sérum plus profondément valident l’utilisation des biopsie liquide miRNA-basé pour la détection du cancer du poumon.

MiARN profilage pour l’identification de biomarqueurs du cancer du poumon a été réalisée également sur des échantillons de crachat46. Expectorations peuvent être facilement retirées et les niveaux d’expression de miRNA semblent être extrêmement stable dedans. Cependant, les bénévoles de dépistage pour le cancer du poumon ont plus de 50-55 ans et sont de gros fumeurs présentant des co-morbidités telles que la BPCO, rendant ainsi difficile d’obtenir des expectorations. En effet, parmi les différents liquides corporels, plasma est l’une des meilleures alternatives pour enquêter sur le rôle potentiel des miARN comme (mais sans s’y limiter) biomarqueurs du cancer du poumon.

Dans l’ensemble, la procédure décrite dans le présent document peut être pertinente dans le cadre de diverses maladies, sans aucune restriction dans le type de la pathologie étudiée (d’un cancer, au système nerveux et troubles cardiovasculaires ou de diabète) et dans le but de utilisation clinique (un biomarqueur pour diagnostic, pronostic ou même la réponse au traitement).

Disclosures

Gabriella Sozzi, Mattia Boeri et Ugo Pastorino sont co-inventeurs de trois demandes de brevets une licence de Sciences de la vie Gensignia, concernant la signature de miRNA mentionnée dans cet article. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts en ce qui concerne le travail soumis.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Caroline Ninni, Annamaria Calanca, et Chiara Banfi pour la gestion des bénévoles dans les essais et pour l’assistance administrative ; et Claudio Jacomelli et Claudio Citterio pour gestion des données. Le travail a été soutenu par l’Association italienne pour la recherche sur le Cancer [subventions chercheurs n° 15928 up, 14318 à GS et 12162 (programme spécial « Outils innovants pour l’évaluation des risques de Cancer et de diagnostic précoce », 5 x 1000)] ; le ministère italien de la santé [Grant No. RF-2010] ; Subvention UO1 CA166905 par le National Cancer Institute (USA). MB a été soutenu par une bourse de Pezcoller Fondazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770

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Micro-ARN après biopsie liquide : L’expérience de la miRNA Plasma Signature classificateur (SMC) pour le dépistage du Cancer du poumon
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Mensah, M., Borzi, C., Verri, C.,… More

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).

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