Summary
여기, 우리 조기 폐 암 발견에 대 한 순환 예측에 관한 서명 분류자 테스트를 수행 하는 시험 검사는 BioMILD에 채택 하는 상세한 프로토콜 제시.
Abstract
최소 침 습 테스트, 액체 생 검 등의 전 임상 단계에서 조기 폐 암 발견에 대 한 개발은이 치명적인 질병의 결과 개선 하기 위해 중요 합니다. MicroRNAs (miRNAs)는 조직의 특정, 작은, 비 코딩 RNAs 생물학 신호의 extracellular 메신저 역할을 할 수 있는 유전자 발현 조절 종양 및 그 주변 microenvironment 사이 잡담에서 파생 된. 그들은 따라서 폐암의 조기 발견을 위한 이상적인 후보자를 대표할 수 있었다. 이 작품에서는, 재판 심사 폐암에 등록 자원 봉사자의 플라즈마 샘플의 사용자 지정 만든된 미세 카드 및 양적 실시간 PCR를 사용 하 여 순환 미르 테스트의 예비 유효성 검사에 대 한 방법론 워크플로 제안 합니다. 또한, 기술적인 문제와 일반적인 혈 관련 miRNAs의 릴리스 분석에 영향을 미칠 수 있습니다, 이후 표준 운영 절차에 포함 된 품질 관리 단계도 제공 됩니다. 프로토콜과 재현할 수는 신뢰할 수 있는 양적 결과; 그러나, 큰 임상 시리즈를 사용 하면 사전 분석 및 분석 기능 수 신중 하 게 평가 한다.
Introduction
폐 암은 가장 흔히 진단 암 모든 암 진단1의 약 25%, 전세계. 지난 2 년간, 주로 감소 담배 사용으로 인해 폐암 사망 율에 있는 꾸준한 감소에도 불구 하 고 폐암 남성과 여성 모두에서 암 사망의 주요 원인이 남아 있습니다. 2017 년, 약 25%와 미국 및 유럽, 각각1,2에서 전체 암 사망자의 20%에 대 한 계정에 예언 된다.
때문에 증상 초기 질병에서 일반적으로 발생 하지 않습니다, 폐 암의 대부분 늦은 단계에서 진단 됩니다. 치료 적 개입 및 치료3의 가난한 효능에 대 한 제한 된 가능성을이 끈다. 따라서, 많은 과학적인 노력 조기 폐 암 발견에 대 한 효과적인 테스트 식별 겨냥 된다.
시험 검사의 다양 한 저 선 량 컴퓨터 단층 촬영 (LDCT) 초기 단계 폐암 암4검출을 위한 방사선에 비해 더 나은 도구는 계산 하는 반면 가슴 방사선 폐 암 검 진에 값은 보여 줍니다. 또한, thatscreening LDCT의 사용으로 감소 폐 암 사망률 현재와 전 무거운 흡연 자5중 최대 20%까지 표시 되었습니다. 이러한 데이터는 여러 전문 단체4,6지침에 정의 된 대로 높은 위험 인구에 폐 암 검사의 사용을 지원.
메모, LDCT 심사에 대 한 중요 한 관심사 중의 허위-긍정적인 결과 및 과다 진단의 높은 비율이 이다. 그렇게 되 고, 과학계는 보고 이러한 문제를 극복 하 고 LDCT 검사의 특이성을 증가 하는 전략에 대 한. 비-침략 적 보완 마커의 개발 여기 유용할 수 있었다. 날짜 하려면, 광범위 한 조사를 받고, miRNAs, 셀 무료 DNA, 유전자 메 틸 화, 작은 단백질 등 바이오 마커 후보 목록이 있다7.
혈액 기반 바이오 마커, miRNAs, 순환 및 면역 반응 생체를 포함 하 여는 고급 유효성 검사 단계8를 도달 하는 그. 면역 반응 생체 두 세포와 표면 종양 항 원에 대 한 면역 반응 폐 암 환자9에 내장은 지식을 기반으로 합니다. 예를 들어, Ajona 외. C4d, 진단 및 폐암 암10의 예 후에 고아 한 보충 통로의 저하 제품의 역할을 평가. 그렇지 않으면, 상용 자가 혈 청 테스트 7 종양 관련 항 원 비 작은 세포 폐 암 환자에서 검증 되었고 감의 36%와 91%의 특이성11을 검사 합니다. 면역 반응 생체 흥미로운, 하지만 추가 유효성 검사 연구는 잠재적인 임상 응용 프로그램에 필요한.
miRNAs는 내 생 적인 작은 비 코딩 RNAs 보존된 메커니즘 및 동물 및 식물 왕국 전 큰 기능적 중요성. 단백질 번역을 규제 하는 miRNAs의 역할: 그들은 대상 유전자12의 큰 세트의 식을 억 누르다. 그것은 잘 문서화 되었습니다 변경 ofmiRNAs' 식 가장 인간의 암12,,1314의 병 인에 기여. 또한, 종양 및 stromal 세포 릴리스 miRNAs, microvesicles에 또는 플라스마와 혈 청15,16,17 소변 등의 체액으로 RNA 의무적인 단백질에 협회를 통해 그들의 설립에 의해 안정 , 그리고 타 액18. 호스트 응답 및 종양의 microenvironment19의 동적 상호작용 miRNAs 순환 따라서 반영 수 있습니다. 함께 찍은이 관측 만들었습니다 순환 miRNAs 인간 암의 검출에 대 한 생체의 유망한 클래스를.
다른 방법을 사용 하 여 검출 될 수 있다 순환 miRNAs: microarray 플랫폼20, 양적 반전 전사 PCR (RT-정량)21, 그리고 다음 세대 시퀀싱 (NGS)14,22. 앞서 언급 한 기술에 기반한 다양 한 식 프로필 연구 지난 몇 년 동안에서 개발 되었습니다. Microarray 높은 처리 기술, 하나의 단일 분석 결과 miRNAs의 수천까지 분석할 수입니다. 그러나, 그것은 낮은 동적 범위와 실시간 정량 또는 NGS에 비해 특이성 있다. 또한, microarray 비 양적 방법, 따라서 더 실험적인 확인이 필요. 계열 기반 방법을 알 수 없는 miRNAs의 식별 수 있으며 검색 단계에 특히 적합. 다른 한편으로, NGS 방법 아직도 비싸다 및 특별 한 장비 및 전문가 bioinformaticians, 따라서 큰 유효성 검사 동료 및 임상 설정23그들의 사용을 제한 할 거. 순간, 실시간 정량 Pcr 순환 진단/임상 컨텍스트24에서 미르 검색 위한 가장 채택한 플랫폼입니다. 다른 실시간 정량 Pcr 기술 miRNAs 분석에 사용할 수 있지만 TaqMan PCR 뒤 줄기 루프 RT는 가장 널리 사용 되25. 이 기술은 매우 민감하고 정확 하다 (단일 뉴클레오티드 차별)는 높은 동적 범위; 그러나, 그것은 알려진된 miRNAs만의 검색 수 있습니다.
예측에 관한 품질 관리 외. 광범위 하 게 miRNAs26세 상술 한 기술 따라 프로 파일링에 대 한 몇 가지 상용 플랫폼의 특성을 조사 하는 Mestdagh에 의해 (miRQC 연구) 연구. 분석 함으로써 조직 및 혈 청 샘플에서 196 miRNAs, 재현성, 정밀도, 특이성, 및 차동 식의 용어 색인 다른 플랫폼의 성능을 평가 했다. 결과 NGS를 기반으로 하는 플랫폼 및 microarray 기술 했다 높은 재현성 및 특이성, 하지만 실시간 정량 플랫폼 더 정확 하 고, 민감한, 특히 몸 같은 낮은 입력된 RNA 샘플에 대 한 높은 탐지 율을 했다 나타났습니다. 체액입니다. 따라서 실시간 정량 일상적인 임상 진단에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 가장 적합 한 방법이 될 것으로 보인다.
2011 년, Sozzi 그 외 여러분 첫 번째 LDCT screeningtrial (INT IEO 재판)27 에 등록 된 자원 봉사자와 24 miRNAs 순환 간의 상호 비율에 의해 구성 된 4 개의 miRNA 서명에서 수집 된 플라즈마 샘플의 miRNA 프로 파일 분석 생성 되었다. 이러한 서명 했다 어떤을 가진 환자에서 질병 자유로운 개인을 차별 할 수 또는 치명적인 폐암 LDCT 질병 탐지28전에 시간 또는 최대 2 년. 더 종이에서 처음 설명 같은 그룹으로 3 단계의 위험에 환자를 충 하기 위해서는 4 개의 miRNA 서명은 결합 하 여 얻은 미르 서명 분류자 (MSC),:, 중간, 높고 낮은. 그것의 임상 유틸리티 가벼운 심사 재판, 비교 관찰 팔29연례 또는 격 년제 LDCT 팔 무작위 연구에서 1000 명 이상의 개인의 대형 회고전 세트에서 확인 했다. 실제로, MSC 및 LDCT 조합 감소에 의해 LDCT 거짓 양성 율 약 5 번 하 고 3 개의 MSC 위험 그룹은전반적인 생존 연관 된.
"피코 IRCCS Istituto Nazionale 데이 Tumori"에서 2013 년에 나중에, (밀라노, 그것) 예비 심사 시험 (BioMILD) 기반으로 MSC 테스트 시작 된 플라즈마 LDCT 구현. BioMILD 평가판에 등록 자원 봉사자 LDCT 및 혈액 철수를 즉시 미르 사용자 정의 만든된 미세 카드를 사용 하 여 프로 파일링에 대 한 플라즈마를 별도의 처리를 받 다. LDCT 및 msc와 결과의 조합은 특정 알고리즘24심사 정의 합니다.
현재 작업에서 BioMILD 시험에 사용 되는 전체 방법론 프로토콜 설명, RNA 추출, 플라즈마 절연, 혈액 샘플 컬렉션에서 시작 하 고 실시간 정량 미세 카드를 만든 사용자 지정 사용 하 여 프로 파일링 24 miRNAs 식. 높은 일관성과 재현성을 감안할 때, 이러한 절차 사용할 수 있습니다 또한 다른 질병에서 액체 biopsies 미르 기반 개발에 대 한.
Protocol
프로토콜의 우리의 기관 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 플라즈마 샘플 컬렉션
스프레이 코팅 K 2 EDTA와 실내 온도에 상점 Vacutainer 튜브에- 수집 10 mL의 전 혈 샘플.
참고:은 용 혈을 최소화 하려면 2 h 이내 플라즈마를 구분 합니다. 열 충격을 방지 하 고 불특정 미르 릴리스 이어질 세포 세포를 낮은 온도 (즉, 4 ° C)에서 전체 혈액을 저장 하지 마십시오. - 내에서 1 h, 분리 1,258 g와 4 ° C 10 분에 대 한 x에서 첫 번째 원심 분리 단계 플라즈마
- 신중 하 게 림프 반지와 접촉을 피하고 15 mL 튜브에 플라즈마 표면에 뜨는 전송.
- 분리기 플라즈마 1,258 x g와 4 ° C 10 분에 대 한 두 번째 시간
- 1.5 mL cryovials, 튜브의 기지에서 플라즈마 분수 수집 피하에 플라즈마의 aliquot 1 mL.
- 저장에 모든 aliquots −는 용 혈의 평가 대 한 하나를 제외 하 고 80 ° C. 분자 분석 5 주 이내에 수행 되어야 합니다.
2. Spectrophotometric 측정 하 여 혈의 평가
- 즉시 후 플라즈마 분리 단계, 분 광 광도 학, 대 한 베트에서 1시 10분에 1 X PBS (예를 들어, 100 µ L 1 X 900 µ L에서 플라즈마의 플라즈마 샘플의 희석 PBS)와 그것을 균질 혼합
참고: 플라즈마 샘플 동결 해야 합니다 하지 spectrophotometric 측정으로는 동결-해빙의 샘플 (그리고 특히 lipemic 샘플에), 수 형성 flocculates spectrophotometric 분석을 방해 하기 전에. - 375에서 흡 광도 읽고 nm, 414 nm, 541, 및 576 750에 nm 기준 정정 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 정착 및 경로 길이 10 m m.의 수행 1 x PBS의 1 mL를 사용 하 여 빈 측정.
- 414에서 흡 광도 사이의 비율 nm와 375 nm; 경우 1.4, 보다 높은 hemolyzed 샘플을 고려 하 고 혈액 철수를 반복 (표 1에 QC1).
3. 플라즈마 총 RNA 추출
균질 솔루션의 mL 당 1-Thioglycerol의- 준비 1-Thioglycerol/균질 (세상에) 솔루션 20 µ L. 1-Thioglycerol 점성 이기 때문에, 정확한 측정을 위한 플라스틱 신중 하 게. 세상에 솔루션 얼음에 또는 2-10 ° C에서 그것을 사용 하기 전에 진정
참고: 작업 솔루션은 2-10 ° C에 안정 1 개월. - 일시 동결 건조 된 DNase nuclease 무료의 275 µ L을 추가 하 여 유리병에 물 어 부드럽게 혼합 (소용돌이 하지 않습니다). 시각 보조 추가 5 µ L 파란색의 나 재구성된 DNase를 염색과 nuclease 무료 튜브에 단일 사용 aliquots에 솔루션을 분배. 저장 재구성된 DNase I-30 ° C ~-10 ° c.
- 냉장된 세상에 솔루션의 200 µ L 추가 플라즈마의 200 µ L에서 시작,.
- 소용돌이 15-30 s 완전 한 균질 화 되도록. 거품 발생 하자 얼음에 정착 하는 샘플
- 세포의 용 해 버퍼 및 무 균된 샘플을 20 소용돌이 가수분해 k 25 µ L의 추가 200 µ L s.
- 품은 thermomixer에서 15 분 샘플 preheated 37 ° c.
- 악기의 갑판 트레이에 각 샘플에 대 한 카트리지를 로드 하 고 적절 한 위치에는 plugger 놓습니다.
- 악기 카트리지에서 적절 한 위치에는 lysate 전송.
- DNase의 추가 5 µ L 나 카트리지에서 적절 한 위치에 솔루션.
- 추가 60 µ L 각 차입 튜브의 기지로 nuclease 무료 물.
- 선택은 " RSC 미르 조직 " 메서드 실행 자동된 정화를 시작 하 고. 총 RNA 샘플에 저장 될 수 있다 − 80 ° c.
4. Taq 기반 실시간
- 관심의 miRNAs와 Taq RT 뇌관 풀을 사용 하 여 RNA Taq 예측에 관한 반전 전사 키트 cDNA를 변환할.
- 사용자 지정 Taq RT 뇌관 풀의 6 µ L를 사용 하 여 키트의 지침에 따라 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 얼음에 RT 반응 혼합의 준비 12 µ L.
- 추가 3 µ l의 총 15 µ L의 최종 볼륨에 대 한 RNA와 5 분을 위한 얼음에서 품 어
- 로드 열 cycler 다음과 같이 구성에 RT 반응: 30 분, 30 분, 5 분, 그리고 4에 보류에 대 한 85 ° C에 대 한 42 ° C에서 16 ° C ° c.
참고:는 cDNA 수 저장소-15-20 ° c에 적어도 1 주일.
5. 사전 증폭
- Taq 마스터 믹스 2 x, 3.75 µ L 사용자 정의 Taq 수영장, 및 6.25 µ L nuclease 무료 물, 25 µ L의 전체 볼륨에 대 한 12.5 µ L와 각 실시간 제품의 믹스 2.5 µ L.
- 수행 다음 열 프로 파일에 따라 열 cycler를 사용 하 여 사전 증폭 반응: 95 ° C 10 분, 2 분, 2 분, 15에 대 한 95 ° C의 12 주기 위한 72 ° C에 55 ° C s, 그리고 4 분 동안 60 ° C 다음 개최 10 분 동안 99.9 ° C에서 4 ° c.
- 0.1 X TE, pH 8.0의 175 µ L을 추가 하 여 제품을 희석.
참고: 희석된 제품 적어도 1 주일에 대 한-15-20 ° C에가 게 될 수 있습니다.
6. 사용자 정의 Taq 배열 예측에 관한 카드에 실시간 정량 Pcr 반응
- 사용 384-잘 microfluidicCustom Taq 배열 예측에 관한 카드는 24 특정 miRNAs (중복에서 발견)에 8 샘플의 플라즈마 레벨을 동시에 측정 하. MiRBase ID (v21) 24 miRNAs는:-미르-101-3 p는-미르-106a-5 p, 미르-126-3 p, 있다-미르-133a-3 p, 미르-140-3 p, 있다-미르-140-5 p,-미르-142-3 p, 있다-미르-145-5 p, 있다-미르-148b-3 p, 있다-미르-15b-5 p, 있다-미르-16-5 p, 있다-미르-17-5 p 미르-197-3 p, 있다-미르-19b-3 p, 있다-미르-21-5 p,-미르-221-3 p,-미르-28-3 p, 있다-미르-30b-5 p, 있다-미르-30 c-5 p는 미르 320a, 있다-미르-451a, 있다-미르-486-5 p, 있다-미르-660-5 p, 그리고는 미르-92a-3.
- Taq 범용 마스터 믹스 X 2의 56.25 µ L와 0.5 mL 튜브에 물 nuclease 무료 55.69 µ L 희석된 PreAmp 샘플의 혼합 1.13 µ L.
- 사용자 정의 Taq 배열 예측에 관한 카드에 최대 8 PCR 반응 혼합 로드.
- 2 분에 대 한 311 x g에서 원심 분리기
- 배열 카드 마감재와 함께 사용자 지정 카드를 봉인.
- 는 실시간 반응 따라 자전거 매개 변수를 수정 하는 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 실행: 10 분, 30 대 97 ° C의 40 주기 94.5 ° C s, 그리고 60 ° C 59.7 s.
7. 데이터 추정과 비율 세대
- 배경 신호 및 모든 분석 및 샘플 0.15의 고정된 임계값을 제거 하는 자동 기준선을 설정 하는 원시 Ct 값
- 사용 소프트웨어. 가난한 증폭 곡선 및 가난한 수동 기준 신호 또는 반점 제거 하십시오.
- 수출에 원시 Ct 값 ".xls " 형식 값을 사용 하는 Ct 의미 두 중복의 추가 분석을 위해.
- 상관 miRNAs ' 임상 연구 샘플에 역사적인 측정 식 레벨 (표 2)입니다. 각 사용자 지정 만든된 미세 카드에 샘플의 적어도 50%는 피어슨 경우 ' s 상관 관계 < 97.5, 반복 카드 (표 1에 QC2).
- 계산에서 − ΔCts 모든 miRNAs, 미르 비율의 log2 값에 해당 사이.
8. 서명 관련된 miRNA에 의해 용 혈의 평가
- 생성 짧은 저장 플라즈마 샘플에 대 한 각 컷-오프 (log2 값) 다음 미르 비율을 사용 하 여 혈 관련 미르 서명 (1-5 주에 − 80 ° C): 미르-126/451 < − 0.07, 15b/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5 p < − 0.33, 15b/486-5 p < − 3.86, 221/486-5 p < − 3.17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15b/92a < − 1.8, 221/92a < − 1.04, 30b/92a < 0.87, 126/16 < − 2.85, 15b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30b/16 < − 3.68.
- Hemolyzed 샘플 비율 (8 중에 16)의 50% 이상에서 각각 마감을 초과로 분류 (표 1에 QC3).
9. 정의 위험 수준: 높음, 중간, 및 낮은
그림 3에서 보고는 MSC를 구성 하는 miRNA 비율의- 4 정의 서명: 적극적인 질병 (RAD)의 존재의 위험 (RD), 질병의 위험 질병 (PD), 및 적극적인 질병 (패드)의 존재.
- 각 서명에 대 한 짧은 저장 플라즈마 샘플에 대 한 해당 컷오프 값을 초과 하는 비율을 정의 (1-5 주에 − 80 ° C). 긍정적인 간주 하는 데 필요한 초과 비율의 수는 9 개의 27 RD와 PD, 그리고 RAD와 패드 ( 그림 3 A) 28 중 14.
- 특성 각 샘플을 각각 MSC 위험 수준 다음과 같습니다: 만약 위험 낮은 RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ 패드 neg, 중간 위험 경우 RD pos ∪ PD pos ∩ RAD neg ∩ 패드 neg; 또는 높은 위험 경우 방사선 pos ∪ 패드 pos ( 그림 3 B).
Representative Results
BioMILD 평가판은 무거운 흡연 자 개인의 큰 일대에 첫 줄 스크린 테스트로 결합된 LDCT MSC 접근의 효율성을 테스트 목적으로 폐암의 조기 발견에 대 한 예비 연구. 위험의 클래스 24 플라즈마 순환 miRNAs 간의 비율을 평가 하는 miRNA 테스트에 근거 하 여 각 자원에 기인 된다. 크게 보고30,,3132, 혈 혈액 세포에 의해 miRNAs의 일반적인 릴리스 때문 잘못 된 결과 얻을 수 있기 때문에, 미르, 순환의 분석에 대 한 중요 한 문제입니다. 제안 된 방법론 워크플로에서 미리 분석 품질 관리 단계 ( 표 1에 QC1) 식별 하 hemolyzed, 그리고 따라서 비-analyzable, 플라즈마 샘플 설명 했다. 그림 1 hemolyzed (그림 1A)와 각각 A414/A375 값 (그림 1B) 플라즈마 샘플 비 hemolyzed의 spectrophotometric 분석을 보고합니다. 임상 맥락에서 분자 테스트의 결과이 QC1 수 자원 관리를 위한 중요 한 했다 혈액 샘플링을 반복 하 고, 대부분의 경우에서 복원 샘플.
분자 처리 후 실시간 정량 성능 정확 하 게 어떤 기술적인 문제를 식별 하기 위해 평가 되어야 한다. 그림 2 A 낮은 성능 때문에 가난한 수동 기준 신호 실시간 정량 Pcr을 보여줍니다. 이 경우에 새로운 미세 카드 사전 증폭 제품을 다시 로드 하는 것이 좋습니다. 실시간 정량 Pcr 그림 2B, 잘, 수행할 때 카드 미르 식 값 비교 역사적인 측정 되도록 처음 게시물 분석 품질 관리 단계로 진행 (QC2 표1에서). QC2 단계가 실패 하면 기술적인 문제가 발생 했을 수 반전 녹음 방송 또는 사전 증폭 반응에 그리고 반전 녹음 방송에서 시작 하는 전체 분자 처리를 반복 하는 것이 편리.
품질 관리의 마지막 단계 ( 표 1에 QC3) 평가 또한 분자 수준에서 용 혈. (미르-16, 미르-451, 미르-486-5 p, 그리고 미르 92a) 4 적혈구 관련 miRNAs의 식 수준을 비교 했다 4 비 혈 관련된 miRNAs (미르-126, 미르-15b, 미르-221, 및 미르-30b)의 그들에 의해 구성 혈 관련 미르 서명 생성에 16 (4x4) 미르 비율. 긍정적인 샘플 hemolyzed, 부정적인 샘플 프로토콜 섹션 9 및 그림 3에 설명 된 대로 최종 MSC 위험 수준 분류를 진행 하는 동안으로 분류 됩니다.
그림 1: 신선한 혈장 샘플의 spectrophotometric 분석. (A) 2 hemolyzed의 spectrophotometric 프로필 고 (B) 2 hemolyzed 비 플라즈마 샘플, 파장 A414 및 A375 사이의 흡 광도 비율을 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 미세에서 실시간 정량 성능 카드 분석. 증폭 및 multicomponent (A)을 비교 가난 하 고 (B) 좋은 품질 미세 카드 플롯 합니다. 모든 24 miRNAs와 단일 exemplifying 미르는 각 패널에 보고 됩니다. Multicomponent 작이 실시간 정량 Pcr 반응에서 발생 하는 수동 기준 신호를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 위험 계층에 대 한 MSC 알고리즘. 자원 봉사자 6 플라즈마 샘플을 고려 하는 대표적인 결과 재판 심사 BioMILD에 등록. (A) 위험 질병 (RD), 위험 적극적인 질병 (RAD), 질병 (PD), 적극적인 질병 (패드), 그리고 플라즈마 샘플에 대 한-80 ° C에 저장 된 해당 컷오프 값 (log2)의 존재의 존재의의 미르-비율 ' 서명 최소 1 주 및 5 주까지. (B) 조합 높은 (H)에서 analyzable 샘플 충 4 서명을의 (I), 중간 및 낮은 (L) MSC 위험 수준. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
함정 및 방법론 워크플로의 도전
BioMILD은 진단 도구로 순환 miRNAs 분석 첫 번째 예비 연구, 임계값 및 컷-오프 데이터 분석에 활용 회고전 시리즈에서 생성 했다. 플라즈마 샘플의 다른 저장 간격의 문제를 극복 하기 위해 매개 변수는 MSC 성능 증가를 가능 하 게 세련 된 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, miRNAs 분석을 시작 하기 전에 전체 프로세스의 여러 측면을 포함 기준, 샘플 수집 및 처리, 같은 신중 하 게 평가 될 필요가 그리고 데이터 분석을 위한 생물 정보학 알고리즘 채택. 다음 섹션에서는 현재 종이, 단일 단계 각의 주요 문제를 해결 하 고 다음 그들을 극복 하는 전략을 제안에 설명 된 작업의 가장 중요 한 포인트에 집중할 것 이다.
연구 인구
등록 BioMILD 재판 심사 기준은: 50-75 년 오래 된, 무거운 현재 또는 전 (10 년 미만) 흡연 자 이상 30 팩 년 및 5 년 이내 암의 이전 역사 없이. 이 인구에서 예상된 폐 암 정도와 연간 발생률 했다 약 1%와 0.7%, 각각. MSC 테스트 제안 된 프로토콜에서 설명 된 대로 적용, 분석 인구는 유사한 특성을 유지 해야 합니다. 특히, 위에서 설명한 QC2 단계 유사한 인구에서 얻은 주어진된 기록 데이터와 비교를 포함 한다. 97.5 아래 상관 관계 기술적인 문제를 나타내는 수 있는 동안, 다른 한편으로, 대부분 개인 폐암의 위험을 반영 하는 변경 된 순환 미르 레벨은 실제로 임계값 아래. 즉, 여기에서 보고 된 매개 변수와 함께 QC2 단계 발전 폐암의 고 위험에 인구에 적용 하면 그것은 허용 샘플 제외 될 수 있습니다. 새로운, 적절 한 참조 매개 변수 다음 정의 되어야 합니다 각 인구의 예상 결과 분석에 대 한 특정.
혈액 및 혈
생물 학적 샘플 컬렉션 샘플 품질 및 특성, 손상 하 고 따라서 분석의 최종 결과 수정할 수 있기 때문에 중요 한 사전 분석 단계입니다. 혈액 샘플에 관한 신선한 혈액을 수집 하 고 표본을 최대한 신속 하 게 처리 하는 것이 중요입니다. 샘플 4 ° C에 저장도 중지 및 재개 구절 RNA 강 직의 세포 세포의 용 해 (용 혈)를 유도 하는 수 있습니다 이후 혈액 철수 후 냉동 될 해야 합니다. 혈 프로세스를 최소화 하기 위해 혈액 컬렉션31 에서 2 h 이내 플라즈마를 분리 하기 위하여 건의 된다.
용 혈 주로 적혈구 (Rbc)의 붕괴 및 주변 환경에 자신의 콘텐츠의 필연적인 출시 예정 이다. 이 순환 miRNAs Rbc 세포내 콘텐츠 릴리스는 극적으로 혈액, 잠재적으로 플라즈마 기반 분석30의 정확도 영향을 미치는 예측에 관한 프로 파일 변경 때문에 테스트에 대 한 문제가 될 수 있습니다.
또한 플라즈마 샘플에서 용 혈의 최소 수준을 식별할 수 생체로 miRNAs 순환에 기반한 연구 위해 결정적 이다. 용 혈 수 처음 부과 육안 검사 하 여 이후 플라즈마의 색상 범위는 노란색에서 빨간색 높은 hemolyzed 샘플에 대 한 두 개의 원심 분리 단계 후. 그러나, 단순한 육안 검사 분자 바이오 마커 연구의 맥락에서 충분히 중요 하지 않을 수 있습니다.
Hemolyzed 플라즈마 샘플을 식별 하는 간단한 사전 분석 방법은 파장 (λ)에 spectrophotometric 측정 = 414 방해의 다른 소스에 대 한 적절 한 조정 후 주요 oxyhemoglobin 피크 흡 광도의 nm. 그 이유로, 우리는 375에서 흡 광도 값에 414 nm 피크 정규화 nm, lipidic 콘텐츠33의 지표. 또는, 또는 더 나은, 조합, lipemia-independenthemolysis (HS) 점수 사용된34일 수 있다. Spectrophotometrically 기반 이렇게 무료 헤모글로빈의 6.1 mg/dL 이상 식별할 수 있습니다. 그렇지 않으면, hemolyzed 표본은 적혈구 전용 miRNAs의 검색을 통해 확인할 수 있습니다. 이후도 매우 낮은 비율의 용 혈 적혈구 관련 미르 레벨32에 상당한 증가 이끌어 낼 수 있습니다, Fortunato 외. 효율적으로 할 수 있는 16 miRNAs 비율에 따라 특정 혈 관련 서명 확인 플라즈마 샘플33용 혈을 분류 합니다. 모든 언급 한 분석 실험 흡 광도 비율 414/375부터 조합에서 사용 될 수 있습니다 및/또는 혈 관련 miRNAs 측정 품질 관리로 사후 분석 단계에서 사용할 수 있습니다 반면 HS 추가 비용 절약 사전 분석 단계에서 채택 단계입니다.
절연 및 RNA 순도 miRNAs 순환
추출 RNA 절차 이후 분석의 성공에 대 한 매우 영향력 있는 단계입니다. 플라즈마, 같은 낮은 입력된 샘플에서 시작 추출 miRNAs의 정확한 정량화를 위해 최대한 효율적 수 있어야 합니다. 플라즈마는 nucleases, 그리고 실시간 정량의 다운스트림 효소 반응을 방해할 수 및 순환 miRNAs 검출에 영향을 미칠 수 있는 다른 구성 요소를 포함 하 여 많은 단백질의 높은 농도 의해 특징입니다. 여러 추출 방법 연구의 이러한 종류에서 사용 되었습니다 하지만 일반적으로, RNA 농축 실리 카 기반 이어서 유기 추출 플라즈마 억제제 더 나은 다음 TRIzol 혼자35의 제거할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 지난 몇 년 동안, 수동 추출 자동된 추출에 의해 대체 되었습니다. 오염, 높은 재현성 및 경제 시간 사용의 사소한 위험 수동 격리 프로토콜에 비해 자동화 시스템의 주요 장점이 있습니다. 또한, 자동된 추출 방법 혈액 샘플 및 수동 프로토콜36에 비해 높은 효율에서 가장 높은 miRNA 금액을 굴복.
정규화 문제
플라즈마 미르 레벨의 정규화는 여전히 논쟁의 문제입니다. 사실, 샘플 품질 또는 수량에 차이가 존재 또는 질병, 따라서 선도 모호한 데이터 해석 하 고 잘못 된 결론의 위험으로 인 한 miRNAs 식 레벨에서 진정한 변화의 식별 방해할 수 있습니다. 지금까지 합의의 부족은 다양 한 표준화 전략37에 결과 있다.
플라스마 견본에서 추출 총 RNA는 일반적으로 형광 기반 분 광 광도 법, 자외선 분 광 광도 법 등 표준 정량화 방법의 임계값 아래 따라서 RNA 대량 표준화38을 제외. 따라서, eluted RNA의 고정 된 금액 보다는 오히려 고정된 볼륨 RT 반응39에 대 한 입력으로 선택 되어야 한다.
MiRNA 분석용 조직 샘플에서 사용 하는 성적 증명서를 내부 관리, RNU48 및 RNU6, 같은 적합 하지 않습니다 extracellular 미르 측정, 표준화로 그들은 둘 다 항상 순환, RNase 중재 저하40, 때문에 감지 되지 않습니다. 그리고 또한 질병 특정 방식으로37에 폐지. 어떤 순환 miRNAs 참조 컨트롤 효과적으로 사용 될 수 있는 경우에 명확 하지 않다. 예를 들어 미르-16은 자주 청소, 하지만 d에 대 한 제안ifferent 연구 암 환자28,37의 플라즈마 샘플에 폐지 됩니다 나타났습니다. 또한, 미르-16 레벨은 혈30높은 영향을.
높은 처리량 분석에 대 한 몇몇 miRNAs 측정 하 고 평균 식 값에 정규화는 일반적으로 인정 된41, miRNAs의 제한 된 수 분석 해야 할 때,이 정규화 방법을 적용할 수 없습니다. 정규화 문제를 우회 하기 위하여 Boeri 외. 이전 24 miRNAs28중 상호 비율에 따라 알고리즘을 설립. 이러한 접근 방식은, 진단 도구 개발에 대 한 매우 유용한 임에도 불구 하 고는 쉽게 miRNAs 종양 개발에 역할을가지고 가능 하 게 하 고 따라서 작동 교정기로 miRNAs 식별 변경 효과적으로 구별 허용 하지 않습니다. 비 앙 키 외. 폐 암 조기 발견을 위한 혈 청 미르 테스트를 개발 하는의 그룹에 의해 채택 된 또 다른 효과적인 전략, 6 "가사 혈 청-miRNAs" 적은 샘플 들을 다양 한 그룹의 기 평균에 정상화 기반 및 환자42의 클래스입니다.
미르-기반 액체 생 검 및 잠재적인 응용 프로그램의 기능
MSC 플라즈마 기반 분자 비-침략 적 테스트 무거운 흡연 자에서 폐암의 조기 진단을 위한 공부입니다. MSC 테스트 높은 감성 (SE, 87%)와 부정적인 예측 값 (NPV, 99%) 폐 암 탐지 LDCT, 여 전에 중간 또는 높은 위험 과목을 확인할 수 있습니다. 특히, MSC LDCT 혼자2919.7%에서 3.7%, 거짓 양성 결과 줄임으로써 LDCT 심사를 구현 수 있습니다. MSC 시험 때만 폐 암 환자, 좋은 전조 성능을가지고 또한 표시 하거나 다른 임상 병리학 매개 변수43,44와 함께 모니터링 도구로 사용 될 수 있는. 잠재적으로, MSC 테스트 폐 암 진단 알고리즘, 따라서 심사 비용 감소의 더 일관성을 사용 수 있습니다.
MSC, 외 조기 폐 암 발견에 대 한 다른 비-침략 적 테스트 보고 되었습니다. 비 앙 키 외. 순환 미르 테스트 34-미르 서명45에 따라 다음 13 미르 서명42감소를 제안 했다. 가져온 혈 청 샘플 fordiscovery 및 유효성 검사에서 지속적인 관찰의 흡연 과목 (우주) LDCT 재판, 심사는 유럽 기관의 종양학 (IEO, 밀라노, 이탈리아)에서 수행. 미르-테스트 위험이 높은 자원 봉사자 폐 암 탐지에 대 한 78% 정확도를 보였다. 13 혈 청 miRNAs와 MSC를 구성 하는 24만 5 miRNAs (92a 미르, 미르-30b, 미르-30 c, 미르-148a, 및 미르-140-5 p) 겹친 했다. 이 다른 유형의 샘플 (플라즈마 대 혈 청)을 시작 하 고 데이터 동화 예정 될 수 있습니다. 사실, 미르-검정, 혈 청, 내부 관리로 서 행동 저자 선택한 6 miRNAs는 3이 있었다 MSC 미르 비율 (미르-15b, 미르-19b와 미르-197) 또한 포함. 그럼에도 불구 하 고, 플라스마에 있는 MSC와 혈 청 샘플 더 미르 테스트 깊이 폐암의 검출에 대 한 미르 기반 액체 생을 사용 하 여를 확인합니다.
폐 암 바이오 마커의 식별에 대 한 프로 파일링 MiRNAs가 래 샘플46또한 수행 하고있다. 가 래를 쉽게 수집할 수 있습니다 고 미르 식 수준에 매우 안정적인 것으로 나타납니다. 그러나, 폐 암 심사 자원 봉사자 50-55 년 보다 오래 하 고 COPD, 따라서가 래를 어렵게 만드는 등 공동 morbidities와 무거운 흡연 자. 실제로, 다른 체액 중 플라즈마로 miRNAs의 잠재적인 역할을 조사 하는 가장 좋은 대안 중 하나입니다 (에 국한 되지 않는) 폐 암 바이오 마커.
전반적으로, 현재의 종이에 설명 된 절차 (암, 신 경계 및 심혈 관 질환 또는 당뇨병)에서 조사 하는 병 리의 종류에서와의 목적에 제한 없이 다양 한 질병의 맥락에서 관련 될 수 있습니다. 임상 (진단, 예 지, 또는 치료에도 반응에 대 한 바이오 마커)를 사용 합니다.
Disclosures
가브리엘라 Sozzi, Mattia Boeri와 우고 Pastorino Gensignia 생명 과학에 미르 서명이이 문서 공개에 관한 허가 3 특허 출원의 공동 발명가. 모든 나머지 작가 작품 제출에 관하여 관심 없음 충돌 선언 합니다.
Acknowledgments
저자 감사 파 올라 Suatoni, 엘레나 Bertocchi, 캐롤라이나 Ninni, Annamaria Calanca, 및 처리에 대 한 키 아 라 Banfi 시련 그리고 관리 지원, 자원 봉사자 Claudio Jacomelli와 클라우디오 Citterio 데이터 관리를 위한. 일 암 연구를 위한 이탈리아 협회에 의해 지원 되었다 [탐정 보조금 GS, 및 12162 최대, 14318 No. 15928 (특별 프로그램 "암 위험 평가 및 조기 진단에 대 한 혁신적인 도구", 5 x 1000)]; 이탈리아의 보건 [부여 번호 RF-2010]; 국립 암 연구소 (미국)에서 UO1 CA166905를 부여 합니다. MB는 피코 Pezcoller 친교에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Lonza | BE-17-516 | |
| 20xTE Buffer, pH 8.0 | Molecular probe | T11493 | Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of 0,1X in Nuclease-free water |
| Nuclease-free water | |||
| Maxwell RSC miRNA Tissue Kit | Promega | AS1460 | The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet. |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4366596 | |
| Custom TaqMan RT Primer Pool | Thermo Fisher | 4459649 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix 2X | Thermo Fisher | 4391128 | |
| Custom TaqMan PreAmp pool | Thermo Fisher | 4459657 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x | Thermo Fisher | 4440048 | |
| Custom TaqMan Array MicroRNA Cards | Thermo Fisher | 4449137 | Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples |
| Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367286-364815 | |
| Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube. | Becton Dickinson | 366643 | Lavender BD Hemogard closure |
| Cuvette PS semi-micro | VWR/PBI | 643-0326 | Light path 10 mm |
| NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Cryogenic vials 1.5 ml | Sigma-Aldrich | Z359033 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection | |
| Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge | Thermo Fisher | D-37520 | |
| Vortex Mixer | Velp Scientifica | F202A0173 | |
| ThermoMixer T- shaker | Euroclone | A00564 | Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA extraction |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | |
| GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler | Thermo Fisher | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| ViiA 7 RUO software | Thermo Fisher | ||
| Arrey Card Staker/Sealer | Thermo Fisher | 4331770 |
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