Vi præsenterer her, detaljerede protokollen blev vedtaget i BioMILD screening retssag for at udføre den cirkulerende mikroRNA klassificeringen Signaturtest for tidlig lunge kræft opdagelse.
Udviklingen af en minimalt invasiv test, såsom flydende biopsi, for tidlig lunge kræft opdagelse i sin prækliniske fase er afgørende for at forbedre resultatet af denne dødelige sygdom. MicroRNA (miRNAs) er væv specifikke, små, ikke-kodende RNA’er regulering genekspression, der kan fungere som ekstracellulære budbringere af biologiske signaler stammer fra cross-talk mellem tumor og dens omgivende mikromiljø. De kunne således repræsenterer ideelle kandidater til tidlig påvisning af lungekræft. I dette arbejde foreslås en metodisk arbejdsproces for potentielle validering af en cirkulerende miRNA test ved hjælp af custom made mikrofluid kort og kvantitative Real-Time PCR i plasmaprøver af frivillige indskrevet i en lunge kræftscreening trial. Derudover siden udgivelsen af hæmolyse-relaterede miRNAs og mere generelle tekniske problemer kan påvirke analysen, præsenteres kvalitetskontrol foranstaltninger indgår i standardprocedurer også. Protokollen er reproducerbare og giver pålidelige kvantitative resultater; Når du bruger store klinisk serien, både præ analytisk og analytiske funktioner bør dog forsigtigt evalueres.
Lungekræft er mest almindeligt diagnosticeret kræft verden over, tegner sig for omkring 25% af alle kræft diagnoser1. Trods den støt reduktion i lungekræft dødelighed i de sidste 2 årtier, hovedsagelig på grund af reduceret tobaksrygning, er lungekræft den hyppigste årsag til kræftdødsfald hos både mænd og kvinder. I 2017 forventes det, at tage højde for ca. 25% og 20% af de samlede kræftdødsfald i USA og Europa, henholdsvis1,2.
Da symptomerne ikke normalt forekommer i tidlig sygdom, er hovedparten af lungekræft diagnosticeret på sene stadier. Dette fører til en begrænset mulighed for terapeutisk intervention og dårlig effekt af behandlinger3. Derfor, mange videnskabelige indsats tager sigte på at identificere en effektiv test for tidlig lunge kræft opdagelse.
En bred vifte af screening forsøg viser, at brystet radiografi har ingen værdi i lunge cancer screening, mens lav-dosis beregnet tomografi (LDCT) er et bedre værktøj i forhold til røntgen til påvisning af tidlige fase lung cancer4. Desuden har det vist thatscreening med brug af LDCT reduceret lung cancer dødelighed op til 20% blandt nuværende og tidligere storrygere5. Disse data støtter brugen af lunge cancer screening i en høj risiko befolkning som defineret i retningslinjerne for flere faglige sammenslutninger4,6.
Af note, blandt de største bekymringer om LDCT screening, er der den høje sats af falsk-positive resultater og over-diagnose. At så det videnskabelige samfund er på udkig efter en strategi for at overvinde disse problemer og øge LDCT screening testens specificitet. Udvikling af non-invasiv supplerende biomarkører kunne være nyttigt her. Til dato, er der en omfattende liste over kandidat biomarkører under undersøgelsen, såsom miRNAs, celle-gratis DNA, gen methylering, små proteiner og andre7.
Blod-baserede biomarkører, herunder immunrespons biomarkører og cirkulerende miRNAs, er dem, når de mere avancerede validering fase8. Immunrespons biomarkører er baseret på den viden, som immunrespons mod begge intracellulær og overflade tumor antigener er bygget i lunge cancer patienter9. For eksempel, Ajona et al. evalueret af C4d, et forringet produkt af den klassiske supplement pathway i diagnose og prognose af lunge kræft10rolle. Ellers, et kommercielt tilgængelige autoantistoffer serum test undersøger syv tumor-relaterede antigener er valideret i patienter med ikke-småcellet lungecancer og viste 36% af sensibilitet og 91% af specificitet11. Immunrespons biomarkører er interessant, men yderligere valideringsundersøgelser er nødvendige for en potentiel klinisk anvendelse.
miRNAs er endogene lille ikke-kodende RNA’er med bevarede mekanisme og store funktionelle betydning hele dyre- og plantearter kongeriger. MiRNAs opgave at regulere protein Oversættelse: de undertrykke udtryk for et stort sæt af mål gener12. Det har været veldokumenteret at ændringer ofmiRNAs’ udtryk bidrage til patogenesen af mest menneskelige kræft12,13,14. Derudover frigive både tumor og stromale celler miRNAs, stabiliseret med deres inkorporering i microvesicles eller gennem tilknytning til RNA-bindende proteiner, i kropsvæsker såsom plasma og serum15,16, urin17 , og spyt18. Cirkulerende miRNAs kan således afspejle host reaktionen og det dynamiske samspil mellem tumor og dens mikromiljø19. Tilsammen disse observationer har gjort cirkulerende miRNAs en lovende klasse af biomarkører for påvisning af menneskelige kræft.
Cirkulerende miRNAs kan påvises ved hjælp af forskellige metoder: microarray platforme20, kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR)21, og næste generation sequencing (NGS)14,22. Forskellige udtryk profil undersøgelser baseret på de ovennævnte teknologier er blevet udviklet i de seneste år. Microarray er en høj overførselshastighed teknologi, stand til at analysere op til tusinder af miRNAs i én enkelt assay. Men det har lavere dynamikområde og specificitet i forhold til RT-qPCR eller NGS. Derudover microarray er en ikke-kvantitativ metode, derfor yderligere eksperimentelle efterprøvelse er krævede. Sekvens-baserede metoder kan tillade identifikation af ukendt miRNAs og egner sig især i en discovery fase. På den anden side NGS metoder er stadig dyrt og nødvendiggør specialudstyr og ekspert bioinformaticians, hvilket begrænser deres anvendelse i stor validering kohorter og i klinisk indstillinger23. RT-qPCR er i øjeblikket den mest vedtagne platform for cirkulerende miRNA påvisning i en diagnostisk/klinisk sammenhæng24. Der findes forskellige RT-qPCR teknologier til miRNAs analyse, men stem-loop RT efterfulgt af TaqMan PCR er den mest udbredte25. Denne teknik er meget følsom og præcis (single nucleotide forskelsbehandling) og har en høj dynamisk rækkevidde; men det giver mulighed for påvisning af kendte miRNAs kun.
MikroRNA kvalitetskontrol undersøgelse (miRQC undersøgelse) af Mestdagh et al. grundigt undersøgt Karakteristik af nogle kommercielt tilgængelige platforme for miRNAs profilering baseret på de tre ovennævnte teknologier26. Ved at analysere 196 miRNAs i væv og serumprøver, blev udførelsen af de forskellige platforme vurderet med hensyn til reproducerbarhed, følsomhed, nøjagtighed, specificitet og konkordans differentierede udtryksformer. Resultaterne har vist at platforme baseret på NGS og microarray teknologi havde en højere reproducerbarhed og specificitet, men RT-qPCR platforme var mere præcise, følsomme, og havde en højere opklaringsprocent, især for lav input RNA prøver, som kroppen væsker. RT-qPCR synes således at være den mest hensigtsmæssige metode til en potentiel anvendelse i rutinemæssig klinisk diagnostik.
I 2011 analyseret Sozzi et al. miRNA profil af plasmaprøver indsamlet fra frivillige indskrevet i en første LDCT screeningtrial (INT-IEO trial)27 og fire miRNA signaturer komponeret af gensidige forhold mellem 24 cirkulerende miRNAs blev genereret. Disse underskrifter var købedygtig skelne sygdommen frie individer fra patienter med nogen eller dødelig lungekræft tiden eller op til 2 år før LDCT disease detection28. I en yderligere papir, samme gruppe beskrevet for første gang miRNA signatur klassificering (MSC), opnås ved at kombinere fire miRNA underskrifter for at stratificere patienterne i tre risikoniveauer: høj, mellemliggende og lav. Sin kliniske anvendelighed blev valideret i et stort retrospektivt sæt af mere end 1.000 personer indskrevet i MILD screening retssag, en randomiseret undersøgelse, der sammenligner etårig eller toårig LDCT våben med en observation arm29. Ja, kombinationen af MSC og LDCT reduceret LDCT falsk positive rate af ca 5 gange og de tre MSC risiko grupperforbundet med samlet overlevelse.
Senere i 2013 på den “Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori” (Milano, det) en prospektiv screening retssag (BioMILD) gennemføre LDCT med plasma baseret MSC test blev lanceret. Frivillige indskrevet i BioMILD retssag gennemgå LDCT og blod tilbagetrækning, der behandles straks for at adskille plasma for miRNA profilering ved hjælp af custom made mikrofluid kort. Kombinationen af LDCT og MSC resultaterne definerer specifikke screening algoritme24.
I den nuværende arbejde, det hele metodologiske protokol, der bruges i BioMILD retssagen er beskrevet, startende fra blod prøve samling, til plasma isolation, RNA udvinding, og 24 miRNAs udtryk profilering ved hjælp af brugerdefinerede lavet RT-qPCR mikrofluid kort. I betragtning af den høje konsistens og reproducerbarhed, kan disse procedurer også bruges til udvikling af miRNA-baseret flydende biopsier i andre sygdomme.
Faldgruber og udfordringer af de metodologiske arbejdsproces
Som BioMILD er den første fremadrettede undersøgelse analyserer cirkulerende miRNAs som et diagnostisk redskab, blev tærskler og cut-offs udnyttet for data-analyse genereret fra retrospektiv serie. For at løse spørgsmålet om forskellige storage interval af plasmaprøver, kan parametrene, der raffineres muligvis opnå en stigning på MSC ydeevne. Ikke desto mindre, før du starter miRNAs analyse, flere aspekter af den samlede proces skal vurderes omhyggeligt, såsom inklusionskriterierne, prøve indsamling og forarbejdning, og bioinformatik algoritme vedtaget til dataanalyse. De følgende afsnit vil fokusere på de mest kritiske punkter for den arbejdsgang, der er beskrevet i den nuværende papir, tage fat på de store spørgsmål for hvert enkelt trin og derefter foreslå strategier for at overvinde dem.
Studere befolkning
Tilmelding kriterier for BioMILD screening retssag er: 50-75 år gamle, tunge nuværende eller tidligere (mindre end 10 år) rygere med mindst 30 pack-år og ingen forudgående historie af kræft inden for 5 år. I denne befolkning var den anslåede lung cancer prævalens og incidens pr. år omkring 1% og 0,7%, henholdsvis. Anvende MSC test som beskrevet i den foreslåede protokol, bør befolkningens analyseret opretholde lignende karakteristika. Især indebærer QC2 trin ovenfor beskrevne sammenligning med den givne historiske data fra en lignende befolkning. Mens en korrelation nedenfor 97,5 kunne være vejledende for tekniske problemer, på den anden side er de fleste individer med ændrede cirkulerende miRNA niveauer afspejler risikoen for at få lungekræft faktisk under denne tærskel. Med andre ord, hvis QC2 skridt med de parametre, der er rapporteret her er anvendt en befolkning på højere risiko for at udvikle lungekræft, kan udelukke acceptable prøver. Nye, korrekt henvisning bør derefter være defineret parametre der er specifikke for hver befolkning analyseret ifølge forventede resultater.
Indsamling og hæmolyse
Udtagning af biologiske prøver er en afgørende pre analytiske trin, da det kan forringe prøve kvalitet og egenskaber, og dermed ændre de endelige resultater af analyser. Vedrørende blodprøver er det vigtigt at indsamle frisk blod og behandle modellen så hurtigt som muligt. Prøverne bør hverken være opbevares ved 4 ° C eller frosne efter blod tilbagetrækning, eftersom nedfrysning og optøning passager kan fremkalde celle lysis (hæmolyse) og RNA nedbrydning. For at minimere hæmolyse proces, er det foreslået for at adskille plasma inden for 2 h fra blod samling31 .
Hæmolyse er i vid udstrækning opdeling af røde blodlegemer (RBC) og deraf følgende frigivelse af deres indhold i det omgivende miljø. Dette kunne være et problem for cirkulerende miRNAs test fordi frigivelsen af røde blodlegemer intracellulære indhold dramatisk ændrer mikroRNA profil i blod, potentielt påvirker nøjagtigheden af plasma-baseret analyse30.
At kunne identificere også minimal niveauer af hæmolyse i plasmaprøver er afgørende for undersøgelser baseret på cirkulerende miRNAs som biomarkører. Hæmolyse kan i første omgang blive vurderet ved besigtigelse, siden efter de to centrifugering trin farven på plasma kan variere fra gul til rød for meget hemolyzed prøver. Simpel besigtigelse kan dog ikke være følsomme nok i forbindelse med molekylær biomarkør forskning.
En enkel, pre analytisk metode til at identificere hemolyzed plasmaprøver er spektrofotometrisk måling på bølgelængde (λ) = 414 nm vigtigste oxyhæmoglobin peak absorbans, efter passende justering for nogen anden kilde af interferens. Derfor, vi normaliseret 414 nm peak til værdien absorbans på 375 nm, betegnende for den lipidic indhold33. Alternativt, eller bedre, i kombination, en lipemia-independenthemolysis score (HS) kan være brugt34. Denne spektrofotometrisk baseret procedure kan identificere mindst 6,1 mg/dL gratis hæmoglobin. Ellers kan hemolyzed prøver identificeres gennem påvisning af erytrocyt-specifikke miRNAs. Da selv en meget lille procentdel af hæmolyse kan fremkalde en betydelig stigning i erytrocyt-specifikke miRNA niveauer32, identificeret Fortunato et al. et bestemt hæmolyse-relaterede signatur baseret på 16 miRNAs-nøgletal, der effektivt kan klassificere hæmolyse i plasma prøver33. Alle de nævnte assays kan anvendes i kombination siden absorbans forholdet 414/375 og/eller HS er vedtaget i en pre analytiske fase spare yderligere omkostninger, mens måling hæmolyse-relaterede miRNAs kan bruges i en post analytiske fase som en kvalitetskontrol skridt.
Cirkulerende miRNAs Isolation og RNA renhed
Udvinding RNA procedure er en meget indflydelsesrige skridt til succes for de efterfølgende analyser. Start fra en lav input prøve, såsom plasma, skal udtræk være så effektiv som muligt for at sikre en nøjagtig kvantificering af miRNAs. Plasma er kendetegnet ved høje koncentrationer af mange proteiner, herunder nukleaser og andre komponenter, som kan forstyrre downstream enzymatiske reaktioner af RT-qPCR og kunne påvirke cirkulerende miRNAs påvisning. Flere udvindingsmetoder har været anvendt i disse typer af undersøgelser, men i almindelighed, økologisk ekstraktion efterfulgt af silica-baserede RNA berigelse tillader fjernelse af plasma hæmmere bedre så TRIzol alene35. Ikke desto mindre, i de sidste par år, manuelle udvinding er blevet erstattet af automatiske ekstraktion. Den mindre risiko for kontaminering, højere reproducerbarhed og økonomiske tid brug er de vigtigste fordele ved automatiserede systemer i forhold til manuel isolering protokoller. Desuden viste automatiseret udvindingsmetoder de højeste miRNA beløb fra blodprøver og den højeste effektivitet i forhold til manuel protokoller36.
Normalisering spørgsmål
Normalisering af miRNA plasmaniveauer er stadig et kontroversielt emne. Faktisk, forskelle i stikprøven kvalitet eller mængde kan interferere med identifikationen af ægte ændringer i miRNAs udtryk niveauer skyldes tilstedeværelsen eller risikoen for sygdomme, og dermed fører til tvetydige data fortolkninger og vildledende konklusioner. Hidtil har har manglen konsensus resulteret i forskellige normalisering strategier37.
Total RNA ekstraheret fra plasmaprøver er normalt under tærsklen på standard kvantificering metoder såsom UV spektrofotometri eller fluorescens-baserede spektrofotometri, således udelukker RNA masse standardisering38. Derfor bør et fast volumen i stedet for et fast beløb på elueret RNA vælges som input for RT reaktion39.
Husholdning udskrifter anvendt til miRNA analyse i vævsprøver, er som RNU48 og RNU6, ikke egnet til normalisering ekstracellulære miRNA målinger, som de begge ikke er altid kan spores i omløb, på grund af RNase-medieret nedbrydning40, og er også dereguleret i en sygdoms-specifikke måde37. Det er uklart, om nogen cirkulerende miRNAs kunne reelt kan bruges som reference kontrolelementer. For eksempel, er miR-16 ofte foreslået for husholdning, men dndre undersøgelser har vist, at det er liberaliseret i plasmaprøver af kræft patienter28,37. Derudover er miR-16 niveauer stærkt ramt af hæmolyse30.
Mens for høj overførselshastighed assays måling flere miRNAs og normalisering af betyder udtrykket værdien er generelt accepterede41, når et begrænset antal miRNAs skal analyseres, kan ikke denne normalisering fremgangsmåde anvendes. For at omgå problemet normalisering, etableret Boeri et al. tidligere en algoritme baseret på gensidige nøgletal blandt 24 miRNAs28. En sådan fremgangsmåde, selvom det er meget nyttigt for udviklingen af den diagnostiske værktøj, tillader ikke let skelne effektivt ændret miRNAs der muligvis har en rolle i tumor udvikling, og dermed identificere miRNAs som fungerende kalibratorer. En anden effektiv strategi, vedtaget af gruppen af Bianchi et al. , udviklet en serum miR-Test til lung cancer tidlig påvisning, var baseret på normalisering på den geometriske middelværdi af en gruppe af 6 “husholdning serum-miRNAs” varierende mindre blandt prøver og klasser af patienter42.
Funktioner af miRNA-baseret flydende biopsi og potentielle anvendelse
Plasma-baserede MSC er en molekylær non-invasiv test undersøgt for tidlig diagnosticering af lungekræft i storrygere. MSC test kan identificere mellemliggende eller højrisiko emner før lunge kræft opdagelse af LDCT, med høj følsomhed (sø, 87%) og negative prædiktive værdi (NPV, 99%). Specifikt, kunne MSC gennemføre LDCT screening ved at reducere falsk-positive resultater til 3,7%, fra 19,7% til LDCT alene29. MSC test har også vist sig for at have en god prognostiske ydeevne, når de overvejer kun lunge kræftpatienter, og kunne bruges som et overvågningsværktøj, alene eller i kombination med andre parametre for klinisk patologisk43,44. Potentielt, kan MSC test give større sammenhæng i lunge kræft diagnostiske algoritmer, dermed faldende screening omkostningseffektivitet.
Udover MSC, er andre ikke-invasiv test til tidlig lunge kræft opdagelse blevet rapporteret. Bianchi mfl. foreslået en cirkulerende miR-Test baseret på en 34-miRNA signatur45, så reducerede det til en 13 miRNA signatur42. Serum prøver fordiscovery og validering blev indhentet fra kontinuerlig Observation af rygning fag (KOSMOS) LDCT screening forsøg, udført på den Europæiske Institut for onkologi (IEO, Milano, Italien). MiR-Test viste 78% nøjagtighed for lunge kræft opdagelse i højrisiko frivillige. Mellem de 13 serum-miRNAs og 24 komponere MSC, kun 5 miRNAs overlappende (miR-92a, miR-30b, miR – 30c, miR-148a og miR-140-5 p). Dette kunne skyldes, at de forskellige slags start prøver (serum vs plasma) og data udarbejdelse. I virkeligheden, for miR-Test var de forfatterne valgte 6 miRNAs opfører sig som husholdning i serum, hvoraf 3 også blandt MSC miRNA nøgletal (miR-15b, miR-19b og miR-197). Ikke desto mindre, MSC i plasma og miR-Test i serumprøver mere dybt validere anvendelsen af miRNA-baseret flydende biopsi til påvisning af lungekræft.
MiRNAs profilering for identifikation af lunge kræft biomarkører har været udføres også på sputum prøver46. Spyt kan samles nemt og miRNA udtryk niveauer synes at være ekstremt stabil i det. Men, lunge cancer screening frivillige er ældre end 50-55 år og er storrygere med co-morbiditeter som KOL, hvorved sputum vanskeligt at opnå. Faktisk, blandt de forskellige kropsvæsker, plasma er et af de bedste alternativer til at undersøge den potentielle rolle af miRNAs som (men ikke begrænset til) lung cancer biomarkører.
Samlet set kan fremgangsmà ¥ den i det foreliggende papir være relevante i forbindelse med forskellige sygdomme, med ingen begrænsning i typen af patologi undersøgt (fra kræft til nervesystemet og hjerte-kar-sygdomme eller diabetes) og formålet med klinisk brug (en biomarkør for diagnose, prognose eller endda svar til behandling).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, og Chiara Banfi for håndtering frivillige i forsøgene og for administrativ bistand; og Claudio Jacomelli og Claudio Citterio for data management. Arbejdet var støttet af den italienske sammenslutning for kræftforskning [investigators Grants No. 15928 at op, 14318 GS, og 12162 (særligt Program “Innovative værktøjer til vurdering af kræft og tidlig diagnose”, 5 x 1000)]; det italienske sundhedsministerium [Grant nr. RF-2010]; Grant UO1 CA166905 fra National Cancer Institute (USA). MB blev støttet af en Fondazione Pezcoller Fellowship.
1x PBS | Lonza | BE-17-516 | |
20xTE Buffer, pH 8.0 | Molecular probe | T11493 | Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of 0,1X in Nuclease-free water |
Nuclease-free water | |||
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit | Promega | AS1460 | The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4366596 | |
Custom TaqMan RT Primer Pool | Thermo Fisher | 4459649 | |
TaqMan PreAmp Master Mix 2X | Thermo Fisher | 4391128 | |
Custom TaqMan PreAmp pool | Thermo Fisher | 4459657 | |
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x | Thermo Fisher | 4440048 | |
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards | Thermo Fisher | 4449137 | Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples |
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367286-364815 | |
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube. | Becton Dickinson | 366643 | Lavender BD Hemogard closure |
Cuvette PS semi-micro | VWR/PBI | 643-0326 | Light path 10 mm |
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
Cryogenic vials 1.5 ml | Sigma-Aldrich | Z359033 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection | |
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge | Thermo Fisher | D-37520 | |
Vortex Mixer | Velp Scientifica | F202A0173 | |
ThermoMixer T- shaker | Euroclone | A00564 | Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA extraction |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | |
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler | Thermo Fisher | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
ViiA 7 RUO software | Thermo Fisher | ||
Arrey Card Staker/Sealer | Thermo Fisher | 4331770 |