Summary
منصة ملاقط مغناطيسية جزيء واحد للتعامل مع كوادروبليكسيس ز هو عنها، مما يسمح لدراسة الاستقرار G4 وتنظيم البروتينات المختلفة.
Abstract
بنية الحمض النووي المتعارف عليه عدم الثانوية ز-قوادروبليكسيس (G4) تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، مثل تكرار الحمض النووي، والنسخ، وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، واستطالة telomere. خلال هذه العمليات، وربط مختلف البروتينات وحل هياكل G4 أداء وظيفتها. وظيفة G4 غالباً ما يعتمد على استقرار هيكلها مطوية، من المهم أن التحقيق في كيفية تنظيم G4 ملزم البروتينات استقرار G4. ويعرض هذا العمل وسيلة التعامل مع جزيئات G4 واحد استخدام الملقط المغناطيسي، الذي يتيح للدراسات المتعلقة بتنظيم G4 ملزم البروتينات في جزيء G4 واحد في الوقت الحقيقي. بشكل عام، هذا الأسلوب مناسبة لنطاق واسع من التطبيقات في الدراسات لتفاعلات البروتينات/يغاندس والأنظمة المتعلقة بمختلف الهياكل الثانوية الحمض النووي الريبي أو.
Introduction
الذين تقطعت بهم السبل-أربعة هياكل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي G4 أدواراً حاسمة في العديد من العمليات البيولوجية المهمة1. تشارك العديد من البروتينات في ملزمة G4 والتنظيم، بما في ذلك telomere ملزم البروتينات (تيلوميراسي، POT1، تيببس TRF2، الجيش الوطني الرواندي)1،2، عوامل النسخ (نوكليولين، PARP1)3من الحمض النووي الريبي معالجة البروتينات (hnRNP A1، hnRNP A2)4,5من هيليكاسيس (بلم، فانكج، وراو، تحذير، Dna2، Pif1)، وتكرار الحمض النووي المتعلقة بالبروتينات (بريمبوليميراسي Rif1، REV1،)6. يمكن تثبيت ملزمة البروتين أو زعزعة استقرار هياكل G4؛ وهكذا تنظم الوظائف البيولوجية اللاحقة. وكان يقاس استقرار G4 الحراري ذوبان باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو طرق دائرية تلوانيه (CD)7. غير أن هذه الشروط لا الفسيولوجية ذات الصلة، ومن الصعب أن تطبق على دراسة آثار ملزمة بروتينات7.
وقد مكن التطور السريع في تقنيات التلاعب جزيء واحد الدراسات قابلة للطي والتي تتكشف من بيوموليكولي، مثل الحمض النووي أو بروتين، على مستوى جزيء واحد مع القرار نانومتر في الوقت الحقيقي8. مجهر القوة الذرية (AFM)، وملاقط بصرية، وملاقط مغناطيسية هي أساليب التلاعب جزيء واحد الأكثر استخداماً. بالمقارنة مع فؤاد وملاقط بصرية9، تسمح ملاقط مغناطيسية قياسات مستقرة للديناميات التي تتكشف للطي لجزيء واحد على مر الأيام باستخدام10،تقنية لمكافحة انجراف11.
هنا، هو منبر تلاعب جزيء واحد استخدام الملقط المغناطيسي لدراسة تنظيم الاستقرار G4 ملزمة بروتينات عنها12،13. ويوجز هذا العمل النهج الأساسية، بما في ذلك عينة وتدفق إعداد القناة وإعداد ملاقط مغناطيسية، ومعايرة القوة. تسمح سيطرة القوة وبروتوكولات مكافحة الانجراف كما هو موضح في الخطوة 3 لمقاييس الزمن منذ فترة طويلة تحت مختلف عناصر القوة، مثل قوة ثابتة (قوة المشبك) وتحميل ثابت معدل (القوة-منحدر)، وقياس قوة القفز. يتيح البروتوكول معايرة القوة هو موضح في الخطوة 4 معايرة القوة < 1 ميكرومتر الحبال القصيرة على مدى قوة واسعة النطاق pN يصل إلى 100، مع خطأ نسبي في حدود 10%. مثال على التنظيم لاستقرار هيليكاز الحمض النووي الريبي المرتبطة بالاتحاد الأفريقي-الغنية بعنصر (راو) هيليكاز (الملقب DHX36، G4R1) التي تضطلع بأدوار أساسية في حل يستخدم G4 الحمض النووي الريبي لإظهار تطبيقات هذا البرنامج13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"إعداد G4 الحمض النووي" لتمتد جزيء واحد
- تحضير 5 '-ثيول المسمى و 5 '-البيوتين المسمى دسدنا مقابض باستخدام دنا بوليميريز في قالب الحمض النووي بالعاثية أمداً باستخدام 5 PCR '-ثيول و 5 '-البيوتين كبسولة تفجير 14 ( الشكل 1). كلا المقابض دسدنا يكون المحتوى العالي من GC (> 60 ٪) لمنع الحمض النووي ذوبان عندما تعقد الحمض النووي في القوات عالية أو أثناء إرهاق الحمض النووي الانتقال 15.
- "بكر تنقية" المنتجات باستخدام أدوات تنقية التجارية وهضم مع إنزيم التقييد بستكسي وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
- G4 اضطر تشكيل سدنى، والجناح سدنى ودسدنا مقابض باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s. تنقية المنتج الواصلة باستخراج هلام باستخدام مجموعة أدوات تنقية تجارية وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
2. إعداد قناة تدفق
تنظيف- ساترة والسطحية الروغان
- مكان أسفل كوفيرسليبس (#1.5، 22 ملم × 32 ملم) وأعلى كوفيرسليبس (#1.5، 20 ملم × 20 ملم) إلى تغطية الزجاج تلطيخ الجرار (كل جرة يمكن عقد 7 قطع من كوفيرسليبس، وحدة التخزين ~ 20 مل). شطف في كوفيرسليبس في الجرار مع الماء المقطر 2-5 مرات-
- إضافة ~ 20 مل من 5-40% الحل المنظفات في كل جرة، والمكان ثم في حمام تنظيف بالموجات فوق الصوتية للحد الأدنى 30 الشطف بماء مقطر ل > 10 مرات لإزالة مواد التنظيف-
- الجاف كوفيرسليبس في الجرار في الفرن (~ 150 درجة مئوية؛ تنبيه، الساخنة)، أو عن طريق الغاز 2 ن. تخزين كوفيرسليبس أعلى المجفف في خزانة جافة.
- استخدام البلازما (س 2 الغاز) لتنظيف كوفيرسليبس في جرة لمدة 10 دقائق. خلال 10 دقائق، إعداد 20 مل من 1% (3-أمينوبروبيل) تريثوكسيسيلاني (أبتيس) الحل في الميثانول (تنبيه، سامة/قابلة للاشتعال). استخدام غطاء الأبخرة كيميائية لحل أبتيس في الميثانول.
ملاحظة: تجنب الرطوبة عند تخزين حل أبتيس. أبتيس القديمة غالباً ما يسبب مشكلة في فونكتيوناليزينج السطحية من كوفيرسليبس- - فور البلازما التنظيف، إضافة كل من محلول أبتيس 1% إلى الجرار واحتضانها لصب حاء 1 النفايات إلى القمقم النفايات المحددة الميثانول أبتيس 1%. نفذ الخطوات المتصلة الميثانول في غطاء الدخان للمواد الكيميائية القابلة للاشتعال-
- شطف الجرار مرة واحدة مع الميثانول و > 10 مرات مع الماء المقطر، وجاف ثم بالفرن (~ 150 درجة مئوية؛ تنبيه، الساخنة). تخزين كوفيرسليبس المغلفة أبتيس السفلي في خزانة جافة أن لم يكن في الاستخدام لمدة تصل إلى أسبوعين.
ملاحظة: بعد كل خطوة الفرعية من 2.1.1 إلى 2.1.4، عملية التنظيف يمكن أن يكون مؤقتاً قبل الخطوة التالية-
- تجميع قناة تدفق
- إعداد اثنين " الفواصل "، أي، بارافيلم أو المزدوج الجانب الشريط (~ 4 ملم × 20 ملم) لكل قناة. وضع قطعتين من الفواصل على ساترة السفلي على طول الحافة الطويلة. ضع ساترة من أعلى على فاصل، تشكيل خلية تدفق بين (~ مساحة 10 × 20 مم، الشكل 2 أ ، ب).
- إذا تم استخدام بارافيلم كفاصل، مكان قناة تدفق على سخان (60-120 درجة مئوية؛ تنبيه، الساخنة) ل 5-10 s أثناء الضغط بلطف على جانبي ساترة الأعلى لعصا كوفيرسليبس اثنين معا بارافيلم. قناة التدفق الناتج بارتفاع ~ 100 ميكرومتر، ومما حجم القناة ~ 20 ميليلتر.
- ختم الحافة الطويلة للقناة مع غراء السيليكون لتجنب تسرب. استخدام غراء السيليكون لجعل بنية مثل المصارف صغيرة في كل حافة فتح قناة تدفق، هو بمثابة مدخل ومخرج للحل.
ملاحظة: دخول وخروج يمكن أن يكون أدلى أيضا بطرق أخرى، مثلاً، المنضمة حلقات بلاستيكية صغيرة باستخدام الشمع. - تخزين قنوات في خزانة جافة لمدة تصل إلى 4 أسابيع-
- الحمض النووي الحبل على السطح السفلي للقناة تدفق
- تمييع الخرز البوليسترين المغلفة الأمينية (القطر: 3 ميكرومتر) من 200 X في المقطر 1 X مخزنة الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS). دوامة الحل حبة وتدفق ثم إلى القنوات. الحل حبة في قنوات لاحتضان ~ 30 دقيقة إزالة أي الخرز مفصول بالغسيل مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني X 1.
- ضبط (الزيادة أو النقصان) فترة حضانة لتحقيق كثافة سطحية من 1-5 حبات كل منطقة 50 مم × 50 مم. تخزين القنوات التي أودعت مع الخرز مرجع لمدة 3 أيام-
- ديلوت سولفوسوكسينيميديل 4-(ن-ماليميدوميثيل) مسحوق الحلقي-1-كاربوكسيلات (سالفو-بين الموظفين) إلى 1 X برنامج تلفزيوني الحل (~ 0.5 ملغ/مل). دوامة الحل وتدفق ثم إلى القناة-
ملاحظة: إعداد جديدة بين الموظفين سولفو الحل قبل الاستخدام وإضافتها مباشرة إلى القناة لتجنب hydrolyzation من بين الموظفين. - إينكوباتي الحل بين الموظفين في القناة للحد الأدنى 30 إزالة الحل بين الموظفين بالغسيل بكمية كبيرة (1 مل، ~ 50 × حجم القناة) 1 X برنامج تلفزيوني الحل.
ملاحظة: يغسل بين الموظفين الزائدة بعناية. هذه الخطوة ضروري جداً لربط الحمض النووي على ساترة- - الربط الحمض النووي
- تمييع ثيول-البيوتين المسمى الحمض النووي في برنامج تلفزيوني X 1، مع تركيز الحمض النووي الناتج من ~ 0.3 نانومتر. "الماصة؛" بلطف مزيج الحل وتدفق الحل الحمض النووي في القناة المغلفة بالتنسيق، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية).
- برفق يغسل الحمض النووي مجاناً مع 200 ميليلتر من عرقلة الحل الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني X 1 مع 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.01% 2-ميركابتوثانول-
- كتلة سطح القناة التي تفرخ القناة في عرقلة الحل (10 ملغ/مل جيش صرب البوسنة، 0.01% 2-Mercaptoethanol) ل > 2 ح؛ بعد هذه الخطوة، القناة مستعدة لإجراء تجارب عليها. يمكن أن تظل القناة مستعدة عند 4 درجة مئوية ل ~ يوم 1-
ملاحظة: الخطوة عرقلة مهمة للحد من الربط غير محددة من الحمض النووي والخرز المغناطيسي كوفيرسليبس-
3. دسدنا ملاقط الإعداد وتحديد هوية واحدة المغناطيسي الحبل
ملاقط- الإعداد ملاقط مغناطيسية
- المغناطيسي ابدأ التحكم في البرنامج. هنا، ملاقط مغناطيسية تسيطر عليها برنامج LabVIEW في منزل-كتب-
- محاذاة مراكز المغناطيس قبل تركيب القناة. استخدام عدسة هدف X 4 لضبط العاشر-وص المحور المحور المغناطيس في محور المجهر الضوئي. استخدام
- مناور يجهز الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتحريك المغناطيس على طول z-الاتجاه ( الشكل 2A) وتعيين المسافة د = 0 (د: المسافة بين المغناطيس وساترة) عند إرفاقه بالمغناطيس ساترة على المجهر.
- برنامج حركة المغناطيس عن طريق مناور لتحقيق السيطرة على القوة، بما في ذلك قوة ثابتة (أي، ثابتة د) والوقت متفاوتة القوة F (t) (أي، متفاوتة الوقت (t د )). استخدام
- مشرق مصدر ضوء أدى (LED) للإضاءة المنتشرة في الظهر من حبة من خلال الهدف. جمع الصور حبة 100 هرتز بمعدل أخذ عينات بكاميرا جهاز اقتران (CCD).
- عينة الإعداد وتحديد الحبل دسدنا واحد
- تشكيل الحبل
- بلطف إضعاف تدفق في 200 X الخرز M-280، باراماجنيتيك في حل المقايسة (100 مم بوكل، 2 مم مجكل 2، 10 مم تريس-الأس الهيدروجيني 7.4 ) إلى قناة. احتضان لمدة 10 دقيقة للسماح الخرز لربط جزيئات الحامض النووي المسمى البيوتين معطلة على سطح المغلفة بالتنسيق من خلال نهاية ثيول المسمى. يغسل بلطف غير المربوطة الخرز استخدام 200 ميليلتر من حل رد فعل قياسي.
ملاحظة: تظهر الخرز M-280 السفلي غير محددة ملزمة للسطح مقارنة بغيرها الخرز المغناطيسي التجارية مثل M-270-
- بلطف إضعاف تدفق في 200 X الخرز M-280، باراماجنيتيك في حل المقايسة (100 مم بوكل، 2 مم مجكل 2، 10 مم تريس-الأس الهيدروجيني 7.4 ) إلى قناة. احتضان لمدة 10 دقيقة للسماح الخرز لربط جزيئات الحامض النووي المسمى البيوتين معطلة على سطح المغلفة بالتنسيق من خلال نهاية ثيول المسمى. يغسل بلطف غير المربوطة الخرز استخدام 200 ميليلتر من حل رد فعل قياسي.
- جبل القناة على خشبة المسرح المجهر. البحث عن الخرز على السطح السفلي باستخدام 100 × النفط الغمر الهدف. حدد
- حبة إشارة على السطح وحبه المربوطة تتحرك. بناء مكتبات الصور الأولية لكل مرجع حبة وحبه المربوطة على طائرات مختلفة يزيل التباؤر.
- معايرة صورة الخرز
- قبل التجارب، استخدم صمام بيزو موضوعية للحصول على صور لكل مرجع والخرز المربوطة في طائرات يزيل التباؤر مختلفة متباعدة من 20-50 نانومتر، التي يتم تخزينها كصورة حبة منفصلة اثنين فهرسة المكتبات وهي على التوالي مع المسافة يزيل التباؤر ( الشكل 2D).
- x، y، z تحديد الموقع
- خلال التجارب، تحديد وضع حبة في طائرة س-ص بواسطة centroid حبة. تحديد تغيير الارتفاع حبة المربوطة بمقارنة الصورة حبة الحالية مع تلك المخزنة في المكتبة. استخدام تحليل طيف الطاقة لتحويل فورييه ل الصور حبة 16 وظيفة الارتباط التلقائي.
- ملاحظات مكافحة الانجراف باستخدام مرجع حبة
- خلال التجارب، استخدم بيزو إلى " لوك " المسافة بين الهدف وصورة حبة مرجعية محددة مخزنة في المكتبة من خلال تردد منخفض التحكم في ردود الفعل، حيث يكون للصورة تمسك حبة علاقة أفضل مع صورة معينة مخزنة في المكتبة ( الشكل 2D).
- تحديد ما إذا كان الحبل جزيء دسدنا واحد بتطبيق ~ 65 pN قوة تحديد جزيء دسدنا واحد إذا كان الحبل يمر الحمض النووي مميزة إرهاق الانتقال 17 ، 18 ، 19-كرر هذه العملية حتى يتم العثور حبل دسدنا واحد. (يرجى الرجوع إلى القسم التالي لمعايرة القوة وارهاق انتقال الحمض النووي)-
- تشكيل الحبل
4. معايرة القوة المغناطيسية ملاقط
- مباشرة تحديد القوة (pN يصل إلى 100) لطويلة الحمض النووي (48,502 بي بي λ-جزيئات الحامض النووي) باستخدام تقلب حبة من خلال:
، حيث ك ب ثابت بولتزمان، T هي درجة الحرارة في مقياس كلفن، δ 2 y هو الفرق لتقلب حبة في الاتجاه العمودي على المجال المغناطيسي والقوة الاتجاه. في هذا الاتجاه، يمكن وصف الاقتراح بحبه كتقلب بندول بطول l + r 0, حيث l هو نهاية إلى نهاية المسافة على طول اتجاه القوة (ملحق) من الحمض النووي، و r 0 نصف قطر حبة 10 ( الشكل 3A). - تحديد منحنى المعايرة للقوة و كدالة للمغناطيس للمسافة حبة د و (د) لحبات مختلفة باستخدام λ طويلة-الحمض النووي. عادة، يتم استخدام المسافة بين المغناطيس وساترة كما يمكن تجاهل طول الحبل الحمض النووي. تناسب ومنحني د بواسطة الدالة تحلل أسي مزدوج:
، حيث المناسب معلمات α1, α2, γ1، γ2 تتحدد ملاقط مغناطيسية والمعلمة ج يتحدد بواسطة الخاصية غير متجانسة من الخرز المغناطيسية. بالتحول ج، ومنحني د التي تم الحصول عليها من حبات مختلفة يمكن أن تكون متراكبة 10 ( الشكل 3B). - تجارب المعايرة للمعلمة ج الخرز المغناطيسي الفردية للحمض النووي قصيرة.
- تحديد القوة على التقلب أساس يتطلب تسجيل موقف حبة بتردد أعلى من تردد الزاوية:
، حيث γ هو السحب معامل حبة. لقصيرة من الدنا في قوة عالية، فإنه يتطلب تسجيل التردد أسرع من 100 هرتز، ولذلك، القوة لا يمكن مباشرة قياسه استناداً إلى تقلب مع الكاميرا. بيد المعلمة ج يمكن تحديد وقياس القوة في مستوى منخفض القوة مجموعة (< 15 pN) استخدام تقلب وتركيب البيانات مع معايرة ومنحني د الحصول على المعلمة ج 20- - بدلاً من ذلك، بالنسبة للتجارب مع دسدنا، تحديد المعلمة ج باستخدام الحمض النووي إرهاق التحول في قوة ~ 65 pN ( الشكل 3) 21 ، 22 ، 23 عن طريق تسجيل موقف د الساعة التي دسدنا ملحق أظهرت قفزة (0.6 × الطول زيادة طول كفاف). وبعد تحديد المعلمة ج، حساب القوة الخرز المربوطة.
- تحديد القوة على التقلب أساس يتطلب تسجيل موقف حبة بتردد أعلى من تردد الزاوية:
- السيطرة على معدل التحميل ببرمجة حركة المغناطيس عن طريق الدالة العكسية و (د). المغناطيس ينبغي نهج عينة مزدوجة أضعافاً مضاعفة.
ملاحظة: الخطأ النسبي للقوة مصممة بطريقة استقراء ~ 10%، والسبب الرئيسي في عدم تجانس حبة دائرة نصف قطرها 20-
5. التلاعب G4 جزيء واحد في وجود وغياب البروتينات ملزمة
- تجارب القوة-منحدر
- بعد تحديد الحبل دسدنا، إجراء فحص قوة-زيادة بمعدل 0.2 pN/s متبوعاً بتحميل وفاة فرقة المسح عند-0.2 pN/s. بعد كل دورة تمتد، عقد جزيء الحمض النووي في pN 1 لمدة 30 ثانية للسماح سدنى ريفولد إلى G4.
- تجارب القوة-القفز
- دورة القوة بين pN 54 30 s التي يمكن أن تكون G4 مطوية تكشفت، والسندات الإذنية 1 ل 60s، التي يمكن أن ريفولد مطوية G4-15T.
- فلووينج البروتين الحل
- تدفق الحل البروتين عند الساعة ~ 20 قوة السندات الإذنية لتجنب إلحاق الخرز ساترة. هيليكاز مربع DEAH راو، الذي أظهر خصوصية عالية لهيكل G4، كان يستخدم 24. المؤتلف هيليكاز راو (دمرو) melanogaster المورفولوجية المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية وتنقيته كما هو موضح سابقا 25. ال G4 تفكيك نشاط دمرو كان جزيئي في تيتراموليكولار الحمض النووي G4 الركازة 13-
- تحليل القوة التي تتكشف المنزل باستخدام كتب Matlab البرنامج 14-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد تجربة تمتد جزيء G4 واحد يرد في الشكل 4. وكان المربوطة تسلسل تشكيل واحد-الذين تقطعت بهم السبل G4 موزعة بين اثنين من مقابض دسدنا بين ساترة وحبه باراماجنيتيك. للبحث عن حبة واحدة دسدنا المربوطة، أنجز مقايسة افرسترتش بزيادة القوة في معدلات التحميل المستمر. وكثيراً ما استخدمت ثلاثة أنواع من القياسات لدراسة قابلة للطي وتتكشف الجزيئات الحيوية: قياس القوة (ط) المستمر وقياس (ثانيا) القوة-المنحدر والقياس (ثالثا) قوة القفز. نتيجة لمعدلات تتكشف بطيئة للغاية لهذا الهيكل G4، التوازن التي تتكشف لطي مرحلة انتقالية يمكن أن تحدث فقط مرة على مر الأيام، حتى استخدمت القياسات منحنى القوة وقوة القفز لتميز بحركية تطور واستقرار G4 الهياكل.
منحنى قوة قياسات G4 تتكشف في وجود أو عدم وجود البروتين راو:
مسح يظهر الشكل 4B الحصول على منحنيات نموذجية القوة-ملحق بقوة-زيادة بمعدل 0.2 pN/s متبوعاً بتفحص قوة-وفاة في-0.2 تحميل pN/s. بعد كل دورة تمتد، عقدت جزيء الحمض النووي في pN 1 لمدة 30 ثانية للسماح سدنى ريفولد إلى G4. القفز التمديد في المسح زيادة القوة إلى مرحلة انتقالية تتكشف من G4. عند استخدام تسلسل تشكيل غير G4، لا يمكن ملاحظة القفزة المفاجئة التمديد. يمكن الحصول على توزيع القوة التي تتكشف عن طريق تسجيل القوى في حدث تتكشف فيه. تتكشف قوة توزيع G4-15T الحصول على 0.2 pN/s أظهر ذروة واحدة في ~ 52 pN. ومع ذلك، حضور 10 نانومتر راو، G4-15T ظلت مطوية أثناء الفحص زيادة القوة ليصل إلى 60 pN، التي تشير إلى استقرار G4 ملزمة راو. حضور 10 نانومتر رهاو و 1 مم ATP، وتوزيع القوة التي تتكشف نقلت إلى قوة أقل، ويدل زعزعة استقرار ATP-تعتمد على G4 رهاو.
قوة القفز قياسات G4 تتكشف في وجود أو عدم وجود البروتين راو:
يبين الشكل 5 تتبع ممثل من ذروة حبة خلال أربع دورات للقوة--القفز (الشكل 5، اللوحة اليمنى)؛ القوة المطبقة على الجزيء تم تدوير بين pN 54 30 s التي يمكن أن تكون G4 مطوية تكشفت، والسندات الإذنية 1 60 s التي يمكن أن ريفولد G4-15T مطوية. وكان متوسط عمر 15T G4 مطوية في 54 pN ~ 6.4 s، المقدر باحتواء الرسم البياني مدى الحياة مع دالة تحلل أسي13. بعد تتدفق في حل من شمال البحر الأبيض المتوسط 10 راو هيليكاز دون ATP، ظل تمديد الحمض النووي المربوطة على مستوى مطوية طوال الوقت pN 54، مما يشير إلى أن راو تستقر بقوة هيكل G4-15T ضد تتكشف الميكانيكية في عقد s 30 عدم وجود ATP. بعد تتدفق في 10 نانومتر راو و 1 مم ATP، تمديد الجزيء نفس الحق بعد القفز من 1 pN إلى 54 pN كان على مستوى ssDNA تكشفت، مما يشير إلى أن راو يزعزع استقرار هيكل G4 حضور ATP.
الشكل 1: إعداد G4 الحمض النووي لتجارب تمتد جزيء واحد.
المقابض دسدنا أعدها PCR باستخدام كبسولة تفجير 5 '-ثيول و 5'-البيوتين. تم تنقية منتجات PCR وهضمها مع إنزيم التقييد بستكسي وتم تنقيته باستخراج هلام. G4 ssDNA تشكيل، هما الجناح سدنى ومقبض دسدنا كانت متصلة باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى. وكان تنقية المنتج الواصلة باستخراج هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الرسومات جهاز ملاقط مغناطيسية الأساسية.
(أ) رسم توضيحي لقناة تدفق مع زوج من المغناطيس يوضع أعلى وهدف مجهرية وضعت أدناه. (ب) رسم قناة تدفق المجمعة حيث تمثل المستطيلات الملونة الزرقاء كوفيرسليبس العلوي والسفلي، وتمثل خطوط بيضاوية رمادية دخول وخروج قناة تدفق. (ج) رسم توضيحي لتوليد القوة ومعايرة الإعداد ملاقط مغناطيسية. (د) أمثلة عن صور لكل مرجع حبة وحبه تتحرك في مختلف المواقع المخزنة في مكتبات الصور حبة التركيز دي. علامة حمراء ترمز إلى التركيز دي الصورة حبة المرجعية التي تم الحصول عليها في عينها الطائرة المستخدمة لتأمين المستوى البؤري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: قوة معايرة ملاقط مغناطيسية.
(أ) معايرة القوة استخدام تقلبات حبة على طول اتجاه y خالية من التناوب. المحور السيني على طول نفس اتجاه المجال المغناطيسي. القوة على طول محور ع ويتم التحكم بضبط المسافة، د، بين زوج مغناطيس دائم وساترة. (ب) معايرة باستخدام 48,502 طويلة bp-الحمض النووي. يمكن وصف الخاصية حبة المغناطيسي غير متجانسة بها معلمة واحدة--جيم وقد تم تعديل هذا الرقم من10. (ج) معايرة المعلمة ج من حبة المغناطيسي يعلق على كيلو بايت 2-الحمض النووي استخدام ب S إرهاق الانتقال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: جزيء واحد التلاعب G4.
(أ) رسم توضيحي لقياس تطور الأحداث وتمتد واحد G4 الهيكل. (ب) مثالاً نموذجياً للقوة--زيادة (سماوي) والقوة-انخفاض منحنى G4 المربوطة. وقد تم تعديل هذا الرقم من12. (ج) منحنى القوة-ملحق G4 في غياب (رمادي) أو وجود البروتين راو (الوردي). (د) تتكشف قوة توزيع G4 في الغياب (الرمادي) (ن = 140) أو وجود (أحمر) راو و ATP (n = 117). وقد تم تعديل هذا الرقم من13. الرجاء انقر فوقهنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قياسات القوة-قفزة تتكشف G4.
تتبع الوقت الممثل (A) لتغيير الارتفاع حبة خلال قوة القفز دورات بين 1 السندات الإذنية والسندات الإذنية 54 قياس دون دمرو، مع 10 نانومتر دمرو ولكن دون ATP، ومع كل 10 نانومتر دمرو و 1 مم ATP، كما هو مبين في لوحة الرقم. (ب) تتبع الوقت الممثل لتغيير ملحق جزيء G4 (بيانات الرمادية) بعد أن قفز إلى 54 pN في عدة دورات قوة القفز مأخوذة من البيانات في (A). ملحقات تناظر مطوية (F) وتكشفت (U) G4 يشار إليها أيضا؛ G4 تطور الأحداث المشار إليها بواسطة الأسهم. وقد تم تعديل هذا الرقم من13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما هو موضح أعلاه، منبرا لدراسة استقرار الحمض النووي G4 الميكانيكية وتفاعلات البروتين باستخدام G4 يقال ملاقط مغناطيسية جزيء واحد. المصاحبة للمنهاج، هي وضع بروتوكولات ذات كفاءة عالية للعثور على حبل G4 الحمض النووي، وقياس الديناميات التي تتكشف للطي واستقرار الهيكل G4 مع القرار الخاص نانومتر. تأمين المستوى البؤري يتيح مراقبة مكافحة الانجراف مستقرة جداً، هو أمر مهم للكشف عن انتقال هيكل صغير مثل G4 (الخطوة حجم ~ 7 نانومتر) والتفاعل مع البروتينات في المخزن المؤقت لتبادل التجارب. قد استخدمت مؤخرا هذا المنهاج للدراسات المتعلقة بديناميات قابلة للطي والتي تتكشف تيلوميريك G414 والمروج ج-حركة G412، فضلا عن دراسات G4 ملزمة البروتين راو هيليكاز13.
خطأ تجربة نموذجية هو الربط غير محددة من الحمض النووي والخرز على ساترة أو ربط العديد من السلطات الوطنية المعينة الخرز المغناطيسي. للحد من الربط غير محددة، أولاً، تخزين المواد الكيميائية مثل أبتيس وبين الموظفين بحاجة إلى فحص روتيني. ثانيا، من المهم تحديد نوع مناسب من حبة المغناطيسية وكتلة الربط غير محددة. استخدام المخزن المؤقت 10 ملغ/مل جيش صرب البوسنة أو الصغيرة اليغو الحمض النووي، مثل بولي تي، كتلة سطح الماء من الخرز يمكن أن تقلل الربط غير محددة. وأخيراً، حبل الحمض النووي واحد يمكن بسهولة تمييز من الحبال الحمض النووي متعددة بسمات الحمض النووي افرسترتش الانتقال17،،من1819.
حاليا، وتحديد الموقف من المنهاج يستند حبة التصوير التحليل، التي لديها من قرار مكانية محدودة ~ 2 نانومتر. وباﻹضافة إلى ذلك، فقد بمعدل أخذ عينات محدودة ~ 100 هرتز، أساسا بسبب معدل اقتناء محدودة من كاميرات CCD نموذجية وتحليل الارتباط الصور. يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية (TIRF) الإضاءة. وتنتج طبقة رقيقة من ضوء زائل أن يضمحل أضعافاً مضاعفة مع الارتفاع من على سطح الأرض، التي يمكن استخدامها لتحديد تغيير ملحق جزيئات قصيرة بنسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية، مع تجنب الحصول على الصور حبة وتحليل26 . قيد آخر هو أنها تشكل تحديا لتصور مباشرة جزيء المربوطة أو يجند ملزمة للجزيء المربوطة باستخدام التصوير بالأسفار في التصميم تمتد العمودية، التي يمكن التغلب عليها من خلال تمتد الجزيئات في استخدام المستوى البؤري 27من ملاقط مغناطيسية عرضية. وأخيراً، لا يسمح التصميم الحالي للقناة رد فعل تبادل الحلول السريعة بسبب اضطراب التدفق للجزيء. وعلاوة على ذلك، ربما حتى كسر قوة سحب كبيرة التي تم إنشاؤها في تدفق عالية السرعة الحبال. يمكن التغلب على هذا القيد بالتلاعب بالحبال داخل ميكروويلس على السطح السفلي ل القناة28.
G4 حاليا تعتبر مركبات استقرار الأهداف العلاجية المحتملة للأمراض، بما في ذلك السرطان، الفيروس ذات الصلة بالأمراض، ونيوروديجينيريشن من الأمراض29،،من3031. يمكن تطبيق البروتوكول إلى طائفة واسعة من G4 ملزم البروتينات2 ويغاندس صغيرة32. بالإضافة إلى التطبيقات في دراسات G4، يمكن استخدام هذا المنهاج، فضلا عن البروتوكولات، من حيث المبدأ، لدراسات أخرى هياكل الثانوي الأحماض النووية، بما في ذلك الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي دبابيس الشعر، ثلاثي، وعزر i33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون عموم منغ لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. ويدعم هذا العمل "سنغافورة وزارة للتعليم الأكاديمي البحث صندوق الطبقة" 3 (MOE2012-T3-1-001) إلى ج. ي؛ المؤسسة الوطنية للبحوث عن طريق معهد ميتشانوبيولوجي سنغافورة إلى ج. ي؛ المؤسسة الوطنية للبحوث، مكتب رئيس الوزراء، سنغافورة، ضمن "برنامجها إينفيستيجاتورشيب جبهة الخلاص الوطني" (جبهة الخلاص الوطني رقم إينفيستيجاتورشيب جائزة جبهة الخلاص الوطني-NRFI2016-03 إلى ج. ي؛ صندوق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2017KFYXJJ153) إلى ص حاء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
