Summary
En enkelt-molekyle magnetiske pincet platform til at manipulere G-quadruplexes er rapporteret, som giver mulighed for undersøgelse af G4 stabilitet og regulering af forskellige proteiner.
Abstract
Ikke-kanoniske nukleinsyre sekundærstruktur G-quadruplexes (G4) er involveret i forskellige cellulære processer, såsom DNA-replikation, transskription, RNA forarbejdning og telomere brudforlængelse. Under disse processer, forskellige proteiner binde og løse G4 strukturer til at udføre deres funktion. Funktionen af G4 ofte afhænger af stabiliteten i sine foldede struktur, er det vigtigt at undersøge, hvordan G4-bindende proteiner regulere stabilitet af G4. Dette arbejde præsenterer en metode til at manipulere enkelt G4 molekyler ved hjælp af magnetiske pincet, som giver studier af reguleringen af G4-bindende proteiner på en enkelt G4 molekyle i realtid. I almindelighed, er denne metode velegnet til et bredt anvendelsesområde applikationer i undersøgelser for proteiner/ligander interaktioner og forordninger om forskellige DNA eller RNA sekundære strukturer.
Introduction
Fire-strenget DNA eller RNA G4 strukturer spiller en kritisk rolle i mange vigtige biologiske processer1. Mange proteiner er involveret i G4 bindende og regulering, herunder Telomer-bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transskriptionsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA forarbejdning proteiner (hnRNP A1, hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5og DNA-replikation relaterede proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein binding kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; dermed regulerer de efterfølgende biologiske funktioner. Stabiliteten af G4 blev målt ved termisk smelter ved hjælp af ultraviolet (UV) eller cirkulær dichroism (CD) metoder7. Sådanne forhold er imidlertid ikke fysiologisk relevante og er vanskelige at anvende til at studere virkningerne af bindende proteiner7.
Den hurtige udvikling i enkelt-molekyle manipulation teknologier har aktiveret undersøgelser af folde og udfoldelsen af et biomolekyle, såsom en DNA eller et protein, på en enkelt-molekyle niveau med nanometer opløsning i realtid8. Atomic force mikroskopi (AFM), Optisk pincet og magnetiske pincet er de mest almindeligt anvendte metoder til enkelt-molekyle manipulation. I forhold til AFM og optiske pincet9, tillade magnetiske pincet stabile målinger af folde udfoldning dynamikken i et enkelt molekyle over dage ved hjælp af en anti-drift teknik10,11.
Her, er en enkelt-molekyle manipulation platform ved hjælp af magnetiske pincet til at undersøge regulering af G4 stabilitet af bindende proteiner rapporteret12,13. Dette arbejde skitserer de grundlæggende metoder, herunder prøve og flow-kanal forberedelse, opsætning af magnetiske pincet og kraft kalibrering. Kontrolelementet kraft og protokollerne anti-drift som beskrevet i trin 3 giver mulighed for lang tidsmålinger under forskellige kraft kontrolelementer, som konstant kraft (force klemme) og konstant lastning Vurder (kraft-rampe) og force-jump måling. Kraft kalibrering protokollen beskrevet i trin 4 giver kraft kalibrering af < 1 µm kort bindsler over en bred kraft rækkevidde op til 100 pN, med en relativ fejl inden for 10%. Et eksempel på lovgivning om stabilitet af RNA-Helicase forbundet med AU-rige element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1), spiller væsentlige roller i løsningen af RNA G4 bruges til at demonstrere applikationer på denne platform13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af G4 DNA for enkelt-molekyle strækning
- Forbered 5 '-thiol mærket og 5 '-biotin mærket dsDNA håndtag ved PCR ved hjælp af DDNA polymerase på en lambda phage DNA skabelon ved hjælp af 5 '-thiol og 5 '-biotin primere 14 ( figur 1). Begge dsDNA håndtag har højt indhold af GC (> 60%) for at forhindre DNA smelter når DNA holdes på høje styrker eller under DNA overstretching overgang 15.
- Rense PCR produkter ved hjælp af en kommerciel rensning kit og fordøje med BstXI begrænsning enzym ifølge producenten ' s protokol.
- Ligate G4 danner ssDNA og flanke ssDNA og dsDNA håndtag ved hjælp af T4 DNA ligase ifølge producenten ' s protokol. Rense den sammenskrevne produkt af gel udvinding ved hjælp af en kommerciel rensning kit ifølge producenten ' s protokol.
2. Forberedelse af Flow kanal
- Coverslip rengøring og overflade functionalization
- sted i bunden coverslips (#1.5, 22 mm × 32 mm) og top coverslips (#1.5, 20 mm x 20 mm) i dækslet glas farvning krukker (hver krukke kan rumme 7 stykker af coverslips, diskenheden er ~ 20 mL). Skyl coverslips i krukker med destilleret vand 2 - 5 gange.
- Tilføj ~ 20 mL 5-40% rengøringsmiddel til hver krukke, og derefter sted i et ultralydsbad i 30 min. rengøring skylles med destilleret vand til > 10 gange for at fjerne vaskemidlet.
- Tør coverslips i krukker i ovn (~ 150 ° C; Forsigtighed, hot), eller af N 2 gas. Gemme den tørrede top coverslips i en tør kabinet.
- Brug plasma (O 2 gas) til at rense coverslips i krukke i 10 min. I løbet af 10 min, forberede 20 mL af 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) opløsning i methanol (forsigtighed, giftig/brandfarlig). Bruge en kemisk stinkskab for at opløse APTES i methanol.
Bemærk: Undgå fugt når lagring APTES løsning. Gamle APTES ofte forårsager problemet i overfladen functionalizing af coverslips. - Umiddelbart efter plasma rengøring, tilføje alle 1% APTES løsning i krukker og inkuberes for 1 h. Hæld affald i affald flasken specifikke for 1% APTES methanol. Udfør methanol-relaterede trin i stinkskab for brandfarlige kemikalier.
- Skylles krukker med methanol og > 10 gange med destilleret vand og derefter tørre af ovnen (~ 150 ° C; Forsigtighed, varm). Gemme APTES-belagt bunden coverslips i en tør fryser, hvis ikke i brug i op til to uger.
Bemærk: Efter hver sub skridt fra 2.1.1 til 2.1.4, renseprocessen kan være standset før det næste skridt.
- Saml flow-kanal
- forberede to " afstandsstykker ", dvs., parafilm eller dobbelt-side bånd (~ 4 mm × 20 mm) for hver kanal. Læg de to stykker af afstandsstykker på en bunden coverslip langs den lange kant. Placer en top coverslip på spacer, danner en flow-celle i mellem (~ 10 mm × 20 mm område, figur 2A , B).
- Hvis parafilm bruges som en spacer, placere flow-kanal på en vandvarmer (60-120 ° C; Forsigtighed, hot) for 5-10 s mens forsigtigt at trykke på siderne af den øverste coverslip til at holde de to coverslips sammen med parafilm. Den resulterende strøm kanal har en højde på ~ 100 µm, og dermed omfanget af kanalen er ~ 20 µL.
- Forsegle den lange kant af kanalen med silikone lim til at undgå udsivning. Bruge silikone lim til at gøre en lille vask-lignende struktur på hver åbne kant af flow-kanal, der fungerer som en indgang og en udgang opløsning.
Bemærk: Ind- og udrejse kan også laves af andre måder, fx ved vedhængende små plastik ringe ved hjælp af voks. - Gemme kanaler i en tør kabinet i op til 4 uger.
- Tether DNA bunden overfladen af flow-kanal
- fortyndes de amino-belagt polystyren perler (diameter: 3 µm) af 200 X i destilleret 1 X phosphat bufferet saltvand (PBS) buffer. Vortex perle løsning og derefter strøm til kanaler. Inkuber perle løsning i kanaler for ~ 30 min. Fjern eventuelle galt perler ved at vaske med 200 µL 1 X PBS buffer.
- Juster (stigning/fald) inkubationstiden at opnå en overflade tæthed af 1-5 perler pr. 50 mm x 50 mm område. Gemme de kanaler, der er deponeret hos reference perler i op til 3 dage.
- Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (Sulfo-Investeringsfondene) pulver til 1 X PBS løsning (~ 0,5 mg/mL). Vortex løsningen og derefter flow ind i kanalen.
Bemærk: Forberede frisk Sulfo-Investeringsfondene løsning før brug og straks tilføje det til kanal for at undgå hydrolyzation af Investeringsfondene. - Incubate Investeringsfondene løsning i den engelske kanal i 30 min. Fjern Investeringsfondene løsning ved at vaske med en stor mængde (1 mL, ~ 50 X kanal lydstyrken) 1 X PBS løsning.
Bemærk: Vask det overskydende Investeringsfondene omhyggeligt. Dette trin er meget afgørende for binding af DNA på coverslip. - DNA tethering
- fortyndes thiol-biotin mærket DNA i 1 X PBS, med en deraf følgende DNA koncentration af ~ 0,3 nM. Forsigtigt afpipetteres for at blande løsningen, flow DNA løsning til Investeringsfondene-belagt kanalen og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur (~ 23 ° C).
- Forsigtigt vaske væk gratis DNA med 200 µL blokerende løsning, der indeholder 1 X PBS med 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) og 0,01% 2-Mercaptoethanol.
- Blokere kanal overflade ved at inkubere kanal i blokerende løsning (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-Mercaptoethanol) for > 2 h; efter dette trin, kanalen er klar til eksperimenter. Rede Kanalen kan opbevares ved 4 ° C for ~ 1 dag.
Bemærk: Den blokerende trin er vigtigt for at reducere ikke-specifik binding af DNA og magnetiske perler til coverslips.
3. Magnetiske pincet Setup og identifikation af enkelt dsDNA Tether
- magnetiske pincet setup
- Start den magnetiske pincet styre programmet. Her, de magnetiske pincet var kontrolleret af en in-House skrevet LabVIEW program.
- Juster magnet Centre før montering kanalen. Bruge en 4 X mål linse til at justere x - og y - aksen af magneter på den optiske akse på mikroskopet.
- Bruge en computer-styrede motoriseret manipulator til at flytte magneter langs z-retning ( figur 2A) og indstille afstanden d = 0 (d: afstand mellem magneter og coverslip) når magneterne tillægger en coverslip på mikroskopet.
- Program bevægelse af magneter gennem manipulator til at opnå kontrol over den kraft, herunder konstant kraft (dvs., konstant d) og tid varierende kraft F (t) (dvs. tid varierende d(t )).
- Bruge lyse en lysdiode (LED) lyskilde for back-spredt belysning af perle gennem målet. Indsamle perle billeder på en samplingfrekvens på 100 Hz ved en afgift - sammen enhed (CCD) kamera. < / lJeg >
- prøve setup og identificere enkelt dsDNA tether
- Tether dannelsen
- forsigtigt flow i 200 X fortyndet M-280, Paramagnetiske perler i assay løsning (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) i en kanal. Der inkuberes i 10 min. at lade perlerne til at binde til biotin-mærket DNA molekyler immobiliseret på Investeringsfondene-belagt overflade gennem thiol-mærket slutningen. Forsigtigt vaske væk un-tøjret perler bruger 200 µL af standard reaktion løsning.
Bemærk: M-280 perler vise lavere ikke-specifik binding til overfladen i forhold til andre kommercielle magnetiske perler såsom M-270.
- forsigtigt flow i 200 X fortyndet M-280, Paramagnetiske perler i assay løsning (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) i en kanal. Der inkuberes i 10 min. at lade perlerne til at binde til biotin-mærket DNA molekyler immobiliseret på Investeringsfondene-belagt overflade gennem thiol-mærket slutningen. Forsigtigt vaske væk un-tøjret perler bruger 200 µL af standard reaktion løsning.
- Mount kanal på mikroskop-scenen. Søg efter perler på bunden overfladen ved hjælp af 100 X oliebestandighedsobjektet.
- Vælg en reference perle på overfladen og en bevægende tøjret perle. Bygge indledende billede biblioteker af både reference perle og tøjret perle på forskellige defocus planes.
- Kalibrering af perler billede
- før eksperimenter, bruge en objektiv piezo aktuator til at få billeder af både reference og tøjret perler på forskellige defocus fly fordelt med 20-50 nm, som er gemt som to separate perle billede biblioteker og er henholdsvis indekseret med defocus afstand ( figur 2D).
- x, y, z stilling bestemmelse
- under forsoeg, fastlægge placeringen af perle i x-y plane af perle barycentrum. Bestemme højden ændringen af tøjret perle ved at sammenligne den aktuelle perle billede med dem gemt i biblioteket. Bruge auto-korrelationen funktion analyse af magt spektret af Fouriertransformation af perle billeder 16.
- Anti-drift feedback ved hjælp af reference perle
- under eksperimenter, bruge piezo til " lås " afstanden mellem mål og en specifik reference perle billedet er gemt i biblioteket via en lav frekvens feedback kontrol, således at stak perle billedet har den bedste korrelation med et bestemt billede gemt i biblioteket ( figur 2D).
- Afgøre, om tether er en enkelt dsDNA molekyle ved at anvende ~ 65 pN kraft bestemme en enkelt dsDNA molekyle hvis tether gennemgår den karakteristiske DNA overstretching overgang 17 , 18 , 19. Gentag processen indtil der findes en enkelt dsDNA tøjr. (Der henvises til næste afsnit for kraft kalibrering og DNA overstretching overgang).
- Tether dannelsen
4. Magnetiske pincet tvinge kalibrering
- direkte bestemme kraften (op til 100 pN) for lange DNA (48,502 bp λ-DNA) molekyler ved hjælp af perle udsving gennem:
, hvor k B er Boltzmann konstant, T er temperaturen i Kelvin skala, δ 2 y er variansen af perle udsving i retningen vinkelret på det magnetiske felt og force retning. I denne retning, kan bevægelse af perlen betegnes som et pendul udsving med en længde på l + r 0, hvor l er den ende til afstand langs kraft ledelse (udvidelse) af DNA, og r 0 er radius af perle 10 ( figur 3A). - Bestem kalibreringskurven for kraft F som en funktion af magneter til perle afstand d og F (d) for forskellige perler ved hjælp af de lange λ-DNA. Normalt, anvendes afstanden mellem magnet og coverslip som DNA tether længde kan ignoreres. Fit F-d kurve af funktionen dobbelt-eksponentiel henfald:
, hvor montering parametre en1, en2, γ1, γ2 bestemmes af den magnetiske pincet og parameteren C bestemmes af egenskaben heterogene af de magnetiske perler. Ved at flytte C, F-d kurve fremstillet af forskellige perler kan være overlappede 10 ( figur 3B). - Kalibrering af parameteren C for individuelle magnetiske perler for korte DNA eksperimenter.
- Bestemmelse af den kraft, der er baseret på udsving kræver optagelse perle position på en frekvens højere end hjørne frekvens:
, hvor γ er træk koefficient af perle. For korte DNA på høj kraft, det kræver optagelse frekvens hurtigere end 100 Hz, derfor, kraften kan ikke direkte måles baseret på udsving med kameraet. Imidlertid parameteren C kan bestemmes ved at måle kraften en lav tvinge vifte (< 15 pN) ved hjælp af udsving og montering data med en kalibreret F-d kurve at opnå parameter C 20. - Alternativt for eksperimenter med dsDNA, bestemme parameteren C ved hjælp af DNA overstretching overgangen på en kraft på ~ 65 pN ( figur 3 c) 21 , 22 , 23 ved at optage d position på hvilke dsDNA viste udvidelse hoppe (0,6 X længde stigning af contour længde). Efter bestemmelse af parameteren C, beregne kraften for tøjret perlerne.
- Bestemmelse af den kraft, der er baseret på udsving kræver optagelse perle position på en frekvens højere end hjørne frekvens:
- Styre belastningsgraden af programmering bevægelse af magneter gennem den inverse funktionen af F (d). Magneten bør nærmer prøven dobbelt eksponentielt.
Bemærk: Den relative fejl af kraft bestemmes af sådan en ekstrapolation metode er ~ 10%, og er hovedsageligt forårsaget af perle radius heterogenitet 20.
5. Enkelt-molekyle Manipulation af G4 i tilstedeværelse og fravær af bindende proteiner
- kraft-rampe eksperimenter
- efter at identificere dsDNA tether, udføre en kraft-stigning scanning på et belastningsgraden af 0,2 pN/s efterfulgt af en kraft-død scanning på-0.2 pN/s. Efter hver strækker cyklus, holde DNA-molekylet på 1 pN for 30 s til at tillade ssDNA at refold til G4.
- Kraft-jump eksperimenter
- cyklus i kraft mellem 54 pN for 30 s som en foldet G4 kunne være udfoldet og 1 pN til 60 ' erne, hvorefter en foldet G4-15T kunne refold.
- Strømmende protein løsning
- Flow protein løsning når på ~ 20 pN kraft til at undgå udlæg i perlerne til coverslip. Niels Henrik-box RHAU helicase, som viste høj specificitet G4 struktur, var brugte 24. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase blev udtrykt i Escherichia coli og renset som tidligere beskrevet 25. G4 tilbageføring aktivitet af DmRHAU blev analyseret på en tetramolecular G4 DNA substrat 13.
- Analysere den unfolding kraft ved hjælp af en in-house skrevet Matlab program 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opsætningen eksperiment for at strække en enkelt G4 molekyle er vist i figur 4. En enkelt-strenget G4 danner sekvens strakte sig mellem to dsDNA håndtag var bundet mellem et coverslip og en Paramagnetiske perle. For at finde en enkelt dsDNA tøjret perle, blev en overstretching analyse udført ved at øge kraft til konstant ladning priser. Tre typer af målinger blev ofte brugt til at studere folde og udfoldelsen af biomolekyler: (i) konstant kraft måling, (ii) kraft-rampe måling og (iii) kraft-jump måling. På grund af de ekstremt langsom udfoldelsen satser for denne G4 struktur, ligevægten folde udfoldning overgang kunne kun ske for tiden over dage, så kraft-rampe og kraft-jump målinger blev brugt til kendetegner udfoldelsen kinetik og stabilitet af G4 strukturer.
Kraft-rampe målinger af G4 udfolder sig i tilstedeværelse eller fravær af RHAU Protein:
Figur 4B viser typiske force-udvidelsen kurver fremstillet ved en kraft-stigning scanne på en belastningsgraden af 0,2 pN/s efterfulgt af en kraft-død scanning på-0.2 pN/s. Efter hver strækker cyklus, DNA-molekylet blev afholdt på 1 pN for 30 s til at tillade ssDNA at refold til G4. Udvidelse hoppe i kraft-stigning scan angivet en udfoldelsen overgang af G4. Når du bruger en ikke-G4 danner sekvens, ikke kan den pludselige udvidelse hoppe iagttages. Den udfolder sig force distribution kunne opnås ved at optage kræfter, som udspiller sig fandt sted. Udfoldelsen tvinge distribution af G4-15T fremstillet på 0,2 pN/s viste en enkelt peak på ~ 52 pN. Men, i nærværelse af 10 nM RHAU, G4-15T forblev foldede under force-stigning scanning for op til 60 pN, der angiver G4 stabilisering af RHAU bindende. 10 nM RHAU og 1 mM ATP, blev den udfolder sig force distribution flyttet til en lavere styrke, vejledende for en ATP-afhængig af destabilisering af G4 af RHAU.
Kraft-jump målinger af G4 udfolder sig i tilstedeværelse eller fravær af RHAU Protein:
Figur 5 viser et repræsentativt spor af perle højde under fire kraft-jump cykler (figur 5, venstre panel); den kraft, at molekylet var cyklet mellem 54 pN for 30 s som en foldet G4 kunne være udfoldet og 1 pN for 60 s, hvorunder en foldet G4-15T kunne refold. Den gennemsnitlige levetid for foldede G4-15T på 54 pN var ~ 6.4 s, anslået ved at montere levetid histogrammet med en eksponentiel henfald funktion13. Efter flyder i en opløsning af 10 nM RHAU helicase uden ATP, udvidelse af tøjret DNA forblev på et foldet niveau i hele den 30 s bedrift tid på 54 pN, der angiver, at RHAU kraftigt stabiliserer G4-15T struktur mod mekaniske udfolder sig i den fravær af ATP. Efter flyder i 10 nM RHAU og 1 mM ATP, var udvidelse af den samme molekyle lige efter hoppe fra 1 pN til 54 pN på niveau med udfoldet ssDNA, der angiver, at RHAU destabiliserer G4 struktur i overværelse af ATP.
Figur 1: Forberedelse af G4 DNA for enkelt-molekyle strækker eksperimenter.
DsDNA håndtag blev udarbejdet af PCR ved hjælp af 5'-thiol og 5'-biotin primere. PCR produkter blev renset og fordøjes med BstXI begrænsning enzym og blev renset ved gel ekstraktion. G4 danner ssDNA, to flanke ssDNA og dsDNA håndtag var forbundet ved hjælp af T4 DNA ligase. Den sammenskrevne produkt blev renset ved gel ekstraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skitser af grundlæggende magnetiske pincet apparater.
(A) skitse af en flow-kanal med et par magneter placeret ovenfor og en mikroskopi mål placeret nedenfor. (B) skitse af et samlet flow kanal hvor de blå farvede rektangler repræsenterer den øverste og nederste coverslips, og grå elliptisk linjer repræsenterer ind- og udrejse af flow-kanal. (C) skitse af styrkegenerering og kalibrering af opsætningen af magnetiske pincet. (D) eksempler på billeder af både reference perle og bevægende perle på forskellige nedtrapning fokus holdninger gemt i perle billede biblioteker. Det røde skilt betegner den perle-referenceafbildning, der er fremstillet på en bestemt nedtrapning fokus flyet bruges til brændplanet låsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tvinge kalibrering af magnetiske pincet.
(A) kalibrering af kraft ved hjælp af svingninger af perle langs en rotation-fri y-retning. X-aksen er langs samme retning som det magnetiske felt. Kraft er langs z-aksen og styres ved at justere afstanden, d, mellem permanent magnet par og coverslip. (B) kalibrering af ved hjælp af en lang 48,502 bp-DNA. Heterogene magnetisk bead ejendom kan beskrives ved en enkelt-parameter C. Dette tal er blevet ændret fra10. (C) kalibrering af parameteren C med en magnetisk bead fastgjort på en 2 kb-DNA ved hjælp af B til S overstretching overgang. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Enkelt-molekyle manipulation af en G4.
(A) skitse af en stretching enkelt G4 struktur og måle de unfolding begivenheder. (B) typiske eksempel på kraft-stigning (cyan) og force-fald kurven af en tøjret G4. Dette tal er blevet ændret fra12. (C) kraft-udvidelse kurve af G4 i fravær (grå) eller tilstedeværelse (pink) af RHAU protein. (D) Unfolding tvinge distribution af G4 i fravær (grå) (n = 140) eller tilstedeværelse (rød) RHAU og ATP (n = 117). Dette tal er blevet ændret fra13. Venligst klik påher for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Force-jump målinger af G4 udfoldning.
(A) repræsentative tid spor af perle højde ændring under force hoppe cyklusser mellem 1 pN og 54 pN målt uden DmRHAU, med 10 nM DmRHAU men uden ATP og med både 10 nM DmRHAU og 1 mM ATP, som angivet i panelet figur. (B) repræsentative tid spor af udvidelse ændres en G4 molekyle (grå data) efter at hoppe til 54 pN i flere kraft-jump cyklusser taget fra data i (A). Extensions svarende til foldet (F) og udfoldet (U) G4 er også angivet; G4 unfolding begivenheder er angivet med pile. Dette tal er blevet ændret fra13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrevet ovenfor, en platform for at studere den mekaniske stabilitet af G4 DNA og samspillet mellem protein til G4 ved hjælp af er enkelt-molekyle magnetiske pincet rapporteret. Ledsager platformen, er højeffektive protokoller for at finde G4 DNA tether og måling af folde udfoldning dynamik og stabilitet af G4 struktur med nanometer særlig beslutning udviklet. Brændplanet låsning muliggør yderst stabil anti-drift kontrol, hvilket er vigtigt for påvisning af en lille struktur overgang som G4 (trin størrelse ~ 7 nm) og interaktioner med proteiner i buffer exchange eksperimenter. Denne platform er for nylig blevet ansat til undersøgelser af folde og udfoldelsen dynamikken i telomeric G414 og c-Myc promotor G412, samt undersøgelser af G4 bindende protein RHAU helicase13.
En typisk eksperiment fejl er ikke-specifik binding af DNA og perler på coverslip eller flere DNAs binde til magnetiske perler. At reducere de ikke-specifik binding, først, opbevaring af kemikalier, såsom APTES og Investeringsfondene skal kontrolleres rutinemæssigt. For det andet er det vigtigt at vælge en passende type af magnetisk bead og blokere ikke-specifik binding. Ved hjælp af 10 mg/mL BSA buffer eller små DNA oligo, såsom poly T, kan for at blokere den hydrofobe overfladen af perlerne reducere ikke-specifik binding. Endelig, en enkelt DNA tether kan let skelnes fra flere DNA bindsler af karakteristiske DNA overstretching overgang17,18,19.
I øjeblikket, stilling bestemmelse af platformen er baseret på perlen imaging analyse, som har en begrænset rumlige opløsning af ~ 2 nm. Derudover har det en begrænset samplefrekvensen ~ 100 Hz, hovedsagelig på grund af begrænset erhvervelse sats af typiske CCD kameraer og korrelation analyse af billederne. Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af total interne reflection mikroskopi (JOHANNAS) belysning. Det producerer et tyndt lag af flygtige lys, der eksponentielt henfalder med højden fra overfladen, som kan bruges til at bestemme den forlængelse ændring af korte molekyler på en høj signal-støj-forhold, samtidig undgå perle billede erhvervelse og analyse26 . En anden begrænsning er, at det er udfordrende at direkte visualisere tøjret molekyle eller ligand bundet til tøjret molekyle ved hjælp af fluorescens imaging i lodret stretching design, som kan overvindes ved at strække molekyler i brændplanet ved hjælp af tværgående magnetiske pincet27. Endelig, den nuværende udformning af reaktion kanal ikke tillader hurtig løsning exchange på grund af den flow undertrykkelse af netbårne til molekylet. Desuden kan en stor kraft genereret på høj hastighed flow endda bryde bindsler. Denne begrænsning kan overvindes ved at manipulere bindsler inde microwells placeret på den nederste overflade af kanal28.
G4 stabiliserende forbindelser er i øjeblikket betragtes som potentielle terapeutiske mål for sygdomme, herunder kræft, virus relateret sygdomme, og neurodegeneration sygdomme29,30,31. Protokollen kan anvendes til en bred vifte af G4 bindende proteiner2 og små ligander32. Ud over ansøgninger i G4 undersøgelser, kan denne platform samt protokollerne, der i princippet bruges til undersøgelser af andre nukleinsyrer sekundære strukturer, herunder DNA og RNA Hårnåle, triplex, og jeg-motiv33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Meng Pan til korrekturlæsning af håndskriftet. Dette arbejde er støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse akademisk forskning fond Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; Grundforskningsfond gennem Mechanobiology Institut Singapore til J.Y.; Danmarks Grundforskningsfond, premierministerens kontor, Singapore, under sit NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; den grundlæggende forskningsfonden for Central universiteterne (2017KFYXJJ153) til H. Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
