Summary
En enda-molekyl magnetisk pincett plattform att manipulera G-quadruplexes rapporteras, vilket möjliggör studier av G4 stabilitet och reglering av olika proteiner.
Abstract
Icke-kanoniska nukleinsyra sekundärt strukturera G-quadruplexes (G4) är involverade i olika cellulära processer, såsom DNA-replikation, transkription, RNA bearbetning och telomer förlängning. Under dessa processer, olika proteiner binder och löser G4 strukturer för att utföra sin funktion. Eftersom funktionen av G4 beror ofta på stabiliteten i dess vikta struktur, är det viktigt att undersöka hur G4 bindande proteiner reglerar stabiliteten i G4. Detta arbete presenterar en metod för att manipulera enda G4 molekyler använder magnetisk pincett, vilket möjliggör studier av regleringen av G4-bindande proteiner på en enda G4 molekyl i realtid. I allmänhet, är denna metod lämplig för ett brett tillämpningsområde applikationer i studier för proteiner/ligander interaktioner och bestämmelser om olika DNA eller RNA sekundära strukturer.
Introduction
Fyra-strängat DNA eller RNA G4 strukturer spelar viktiga roller i många viktiga biologiska processer1. Många proteiner är involverade i G4 bindande och förordning, inklusive telomer-bindande proteiner (telomeras, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transkriptionsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA processing proteiner (hnRNP A1, hnRNP A2)4, Helikas (BLM, FANCJ, RHAU, VARN, Dna2, Pif1)5och DNA-replikation relaterade proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Proteinbindning kan stabilisera eller destabilisera G4 strukturer. således reglerar de efterföljande biologiska funktionerna. Stabiliteten i G4 mättes genom termisk smältande använder ultraviolett (UV) eller cirkulärdichroism (CD) metoder7. Sådana villkor är dock inte fysiologiskt relevanta och är svåra att tillämpa att studera effekter av bindande proteiner7.
Den snabba utvecklingen i singel-molekyl manipulation teknik har möjliggjort studier av vikning och unfoldingen av en biomolecule, såsom en DNA eller ett protein, på en singel-molekyl nivå med nanometer upplösning i realtid8. Atomic force microscopy (AFM), optisk pincett och magnetisk pincett är de vanligaste metoderna som singel-molekyl manipulation. Jämfört med AFM och optisk pincett9, tillåter magnetisk pincett stabil mätningar av vikning-utspelas dynamiken i en enda molekyl över dagar med hjälp av en anti drift teknik10,11.
Här är en singel-molekyl manipulation plattform använder magnetisk pincett för att studera regleringen av G4 stabilitet genom bindande proteiner rapporterade12,13. Detta arbete beskriver de grundläggande metoder, inklusive prov och flöde kanal förberedelse, inställningen av magnetisk pincett och kraft kalibreringen. Kontrollen kraft och anti drift protokoll som beskrivs i steg 3 kan för lång tid mätningar enligt olika kraft kontroller, till exempel konstant kraft (kraft clamp) och konstant lastning Betygsätt (kraft-ramp) och kraft-hoppa mätning. Kraft kalibrering protokollet beskrivs i steg 4 gör kraft kalibrering av < 1 µm kort tjuder över en bred kraft sträcker sig upp till 100 pN, med ett relativt fel inom 10%. Ett exempel på reglering av stabiliteten i de RNA Helicase associerade med AU-rika element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) som spelar viktiga roller att lösa RNA G4 används för att demonstrera tillämpningar av denna plattform13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av G4 DNA för singel-molekyl sträckning
- Förbered 5 '-thiol märkt och 5 '-biotin märkt dsDNA handtag med PCR med DDNA polymeras på en lambda phage DNA mall med 5 '-thiol och 5 '-biotin primers 14 ( figur 1). Båda dsDNA handtagen har högt GC innehåll (> 60%) för att förhindra DNA smälta när DNA hålls vid höga krafter eller under DNA översträckning övergång 15.
- Rena PCR-produkter med en kommersiell rening kit och smälta med BstXI restriktionsenzym enligt tillverkaren ' s protokollet.
- Ligera G4 bildar ssDNA och flanken ssDNA och dsDNA handtag med T4 DNA-ligase enligt tillverkaren ' s-protokollet. Rena ligated produkten av gel extraktion med en kommersiell rening enligt tillverkaren ' s protokollet.
2. Beredning av flöde kanal
- täckglas rengöring och ytan funktionalisering
- plats nedre coverslips (nr 1.5, 22 mm × 32 mm) och övre coverslips (nr 1.5, 20 x 20 mm) i lock glas färgning burkar (varje burk rymmer 7 bitar av coverslips, volymen är ~ 20 mL). Skölj coverslips i burkar med destillerat vatten 2 - 5 gånger.
- Lägg till ~ 20 mL 5-40% rengöringslösning i varje burk, och placera i en Ultraljuds rengöring bad för 30 min. Skölj med destillerat vatten för > 10 gånger att ta bort rengöringsmedlet.
- Torka coverslips i burkarna i ugnen (~ 150 ° C; Försiktighet, het), eller genom N 2 gas. Lagra de torkade topp coverslips i ett torrt skåp.
- Användning plasma (O 2 gas) att rengöra coverslips i burken i 10 min. Under 10 min, bereda 20 mL 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) lösning i metanol (försiktighet, giftiga, brandfarliga). Använda kemiska spiskåpa för att upplösa APTES i metanol.
Obs: Undvik fuktighet vid lagring av APTES lösning. Gamla APTES orsakar ofta problem i surface funktionaliserar av coverslips. - Omedelbart efter plasma rengöring, tillsätt all 1% APTES lösning i burkarna och inkubera för 1 h. Häll avfallet till avfallsflaskan specifika för 1% APTES metanol. Utför steg metanol-relaterade i dragskåp för brandfarliga kemikalier.
- Skölj burkar en gång med metanol och > 10 gånger med destillerat vatten, och sedan torka av ugnen (~ 150 ° C; Försiktighet, het). Lagra den APTES-belagd botten coverslips i ett torrt skåp om i användning i upp till två veckor.
Obs: Efter varje sub steg från 2.1.1 2.1.4, reningsprocessen kan pausas innan nästa steg.
- Montera kanalen flöde
- förbereda två " distanser ", dvs, parafilm eller dubbelsidig tejp (~ 4 mm × 20 mm) för varje kanal. Placera två bitar av distanser på ett botten täckglas längs långsidan. Placera en översta täckglaset på distansen, bildar en flöde cell i mellan (~ 10 mm × 20 mm område, figur 2A , B).
- Om parafilm används som ett distanselement, placera kanalen flöde på en värmare (60-120 ° C; Försiktighet, het) för 5-10 s samtidigt som du försiktigt trycker på sidorna av det översta täckglaset hålla de två coverslips ihop av parafilm. Den resulterande flöde kanalen har en höjd på ~ 100 µm, och därmed volymen av kanalen är ~ 20 µL.
- Tätning långsidan av kanalen med silikon lim för att undvika läckage. Använda silikon lim för att göra en liten diskbänk-liknande struktur på varje öppen kant av flöde kanal, som fungerar som en post och en exit lösning.
Obs: In- och utpassering kan också göras av andra sätt, t.ex., med vidhängande små plastringar använder vax. - Lagra kanaler i ett torrt skåp för upp till 4 veckor.
- Tjuder DNA på bottenytan av kanalen flöde
- späd amino-belagd polystyren pärlor (diameter: 3 µm) av 200 X i destillerat 1 X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert. Vortex pärla lösningen och sedan flöde i kanaler. Inkubera pärla lösningen i kanaler för ~ 30 min. avlägsna eventuella misslyckades pärlor genom att tvätta med 200 µL 1 X PBS-bufferten.
- Justera (öka/minska) inkubationstiden att uppnå en surface densitet av 1-5 pärlor per 50 x 50 mm område. Lagra de kanalerna som deponeras med referens pärlor för upp till 3 dagar.
- Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-bildas (Sulfo-SMCC) pulver till 1 X PBS lösning (~ 0,5 mg/mL). Vortex lösningen och sedan flöde in i kanal.
Obs: Förbereda färska Sulfo-SMCC lösning före användning och Lägg omedelbart till kanalen för att undvika hydrolyzation av SMCC. - Inkubera SMCC lösningen i kanalen för 30 min. avlägsna SMCC lösningen genom att tvätta med en stor mängd (1 mL, ~ 50 X kanal volym) 1 X PBS lösning.
Obs: Tvätta den överskjutande SMCC noggrant. Detta steg är mycket viktigt för bindning av DNA på täckglaset. - DNA tjudra
- späd den thiol-biotin märkt DNA in 1 X PBS, med en resulterande DNA-koncentration av ~ 0,3 nM. Pipettera försiktigt för att blanda lösningen, flödar DNA lösningen in kanalen SMCC-belagda och inkubera i 30 min i rumstemperatur (~ 23 ° C).
- Försiktigt tvätta bort gratis DNA med 200 µL blockerande lösning som innehåller 1 X PBS med 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) och 0,01% 2-merkaptoetanol.
- Blockera kanal ytan genom inkubation vid kanalen i blockering lösning (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-merkaptoetanol) för > 2 h; efter detta steg, kanalen är redo för experiment. Den förberedda kanalen kan förvaras vid 4 ° C för ~ 1 dag.
Obs: Det blockerande steget är viktigt för att minska icke-specifik bindning av DNA och magnetiska pärlor till coverslips.
3. Magnetisk pincett Setup och identifiering av enda dsDNA tjuder
- magnetisk pincett setup
- Start den magnetiska pincetter styra programmet. Här, de magnetiska pincetter kontrollerades av ett i-inhysa-skriven LabVIEW program.
- Justera magnet centers före montering av kanalen. Använd en 4 X-objektiv för att justera de x - och y - axeln av magneterna i den optiska axeln på mikroskopet.
- Använda en datorstyrd motordriven manipulator flytta magneterna längs z-riktning ( figur 2A) och ange avståndet d = 0 (d: avståndet mellan magneter och täckglas) när magneterna ansluter till ett täckglas på mikroskopet.
- Programmera förflyttning av magneterna genom manipulatorn att uppnå kontroll av kraften, inklusive konstant kraft (dvs., konstant d) och tid varierande kraft F (t) (dvs tiden varierande d(t )).
- Använda ljusa en lysdiod (LED) ljuskälla för bakåtspritt belysning av pärlan igenom målet. Samla pärla bilderna vid en samplingsfrekvens på 100 Hz genom en avgift – tillsammans enhet (CCD) kamera. < / lJag >
- prov setup och identifiera enstaka dsDNA tjuder
- tjuder bildandet
- försiktigt flöde i 200 X utspädd M-280, paramagnetiska pärlor i analyslösningen (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) i en kanal. Inkubera i 10 min så att pärlorna att binda till biotin-märkt DNA molekyler orörlig på SMCC-belagda ytan genom thiol-märkt slutet. Försiktigt tvätta bort un-uppbundna pärlor med 200 µL standard reaktion lösning.
Observera: M-280 pärlor Visa lägre icke-specifik bindning till ytan jämfört med andra kommersiella magnetiska pärlor såsom M-270.
- försiktigt flöde i 200 X utspädd M-280, paramagnetiska pärlor i analyslösningen (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) i en kanal. Inkubera i 10 min så att pärlorna att binda till biotin-märkt DNA molekyler orörlig på SMCC-belagda ytan genom thiol-märkt slutet. Försiktigt tvätta bort un-uppbundna pärlor med 200 µL standard reaktion lösning.
- Montera kanalen på Mikroskop scenen. Sök efter pärlorna på bottenytan med 100 X oljeimmersionsobjektivet.
- Välj en referens pärla på ytan och en glidande uppbundna pärla. Bygga de inledande bildbibliotek både referens pärla och uppbundna pärla på olika defocus planes.
- Kalibrering av pärlmotivet
- innan experiment, använda ett objektivt piezo ställdon för att få bilder av både referens- och uppbundna pärlor på olika defocus planes fördelade av 20-50 nm, som lagras som två separata pärla bild bibliotek och är respektive indexeras med defocus avståndet ( figur 2D).
- x, y, z placerabeslutsamheten
- under experiment, bestämma positionen för pärlan i x-y-planet genom den pärla centroiden. Bestämma höjden ändringen av den uppbundna pärlan genom att jämföra den aktuella pärla-bilden med de som är lagrade i biblioteket. Använda auto-korrelation funktionen analys av power spektrumet av fouriertransformen av pärla bilder 16.
- Anti drift feedback via referens pärla
- under experiment, använda piezo till " lås " avståndet mellan målet och en specifik pärla av referensavbildning som lagras i biblioteket genom en låg frekvens feedback kontroll, så att bilden som fastnat pärla har bästa korrelationen med en viss bild som lagras i biblioteket ( figur 2D).
- Avgöra om tjuder är en enda dsDNA molekyl genom att tillämpa ~ 65 pN kraft fastställa en enda dsDNA molekyl om tjuder genomgår karakteristiska DNA översträckning övergången 17 , 18 , 19. Upprepa processen tills enda dsDNA tjuder hittas. (Se nästa avsnitt för kraft kalibrering och DNA översträckning övergången).
- tjuder bildandet
4. Magnetisk pincett tvinga kalibrering
- direkt avgöra kraften (upp till 100 pN) för lång DNA (48,502 bp λ-DNA) molekyler med pärla fluktuationer genom:
, där k B är Boltzmanns konstant, T är temperaturen i Kelvin skalan, δ 2 y är variansen för bead fluktuationen i riktning vinkelrätt mot magnetfältet och kraft riktning. I denna riktning, kan rörelse i pärla beskrivas som en pendel fluktuation med en längd av l + r 0, där l är end-to-end avståndet längs styrkariktningen (förlängning) av DNA, och r 0 är radien av den pärla 10 ( figur 3A). - Fastställ kalibreringskurvan för kraft F som funktion av magneter för att pärla avståndet d och F (d) för olika pärlor med lång λ-DNA. Avståndet mellan magneten och täckglaset används vanligtvis som DNA tjuder längden kan ignoreras. Passar F-d kurva av funktionen dubbel-exponentiell förfalla:
, där montering parametrar α1-, α2-, γ1, γ2 bestäms av den magnetisk pincett och parametern C bestäms av egenskapen heterogena av magnetiska pärlor. Genom att skifta C, F-d-kurva som erhålls från olika pärlor kan vara överlappande 10 ( figur 3B). - Kalibrering av parametern C för enskilda magnetiska pärlor för korta DNA experiment.
- Att bestämma styrkan baserat på fluktuationer kräver inspelning pärla position på en frekvens som är högre än hörnet frekvensen:
, där γ är dra koefficient på kornet. För korta DNA på hög kraft, det kräver inspelning frekvens snabbare än 100 Hz, därför kraft kan inte direkt mätas utifrån fluktuation med kameran. Men parametern C kan bestämmas genom att mäta kraften på en låg tvinga utbud (< 15 pN) använder fluktuation och passande data med en kalibrerad F-d-kurva för att få parametern C 20. - Alternativt, för experiment med dsDNA, bestämma parametern C med hjälp av DNA översträckning övergången vid en kraft av ~ 65 pN ( figur 3 c) 21 , 22 , 23 av inspelning av d ståndpunkt vid vilken dsDNA visade förlängning hoppa (0,6 X längd ökning av kontur längd). Efter bedömningen av parametern C, Beräkna kraft för tjudrad pärlorna.
- Att bestämma styrkan baserat på fluktuationer kräver inspelning pärla position på en frekvens som är högre än hörnet frekvensen:
- Styra fisktätheten genom programmering förflyttning av magneterna genom omvändningfunktionen av F (d). Magneten bör närma provet dubbel exponentiellt.
Obs: Relativa felet i kraft bestäms av sådan extrapolering metod är ~ 10%, och orsakas främst av den pärla radie heterogenitet 20.
5. Singel-molekyl Manipulation av G4 i närvaro och frånvaro av bindande proteiner
- kraft-ramp experiment
- efter att identifiera dsDNA tjuder, genomsökning av kraft-ökning med en lastning hastighet på 0,2 pN/s följt av en kraft-bortgång scan-0,2 pN/s. Efter varje stretching cykel, hålla DNA-molekylen på 1 pN för 30 s till tillåta ssDNA till refold till G4.
- Kraft-hoppa experiment
- cykel kraft mellan 54 pN för 30 s som en hopvikt G4 kunde vara Övik, och 1 pN för 60-talet, enligt vilken en vikta G4-15T kunde refold.
- Flowing protein lösning
- Flow protein lösningen när på ~ 20 pN kraft att undvika fastsättning av pärlorna på täckglas. Den DEAH-box RHAU helicase, som visade hög specificitet till G4 struktur, var används 24. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase var uttryckt i Escherichia coli och renas enligt den tidigare 25. G4 avslappnande aktivitet av DmRHAU var analyseras på en tetramolecular G4 DNA substrat 13.
- Analysera den utspelas kraft använder en egen skriven Matlab programmet 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inställningen för experiment för stretching en enda G4-molekyl visas i figur 4. Ett enkelsträngat G4 bildar sekvens spännas mellan två dsDNA handtag var uppbundna mellan ett täckglas och en paramagnetiska pärla. För att hitta en enda dsDNA uppbundna pärla, utfördes ett overstretching test genom att öka kraften på konstant lastning priser. Tre typer av mätningar användes ofta för att studera den fällbara unfoldingen av biomolekyler: (i) konstant kraft mätning, (ii) kraft-ramp mätning och (iii) kraft-hoppa mätning. På grund av de extremt långsam utspelas priserna av denna G4 struktur, equilibriumen vikning-utspelas övergång kunde endast ske för tiden under dagarna, så kraft-ramp och kraft-hoppa mätningar användes för att karaktärisera den utspelas kinetik och stabilitet av G4 strukturer.
Kraft-ramp mått för G4 utspelas i närvaro eller frånvaro av RHAU Protein:
Figur 4B visar typiska kraft-extension kurvor erhålls genom en kraft-ökning skanna med en lastning hastighet på 0,2 pN/s följt av en kraft-bortgång scan-0,2 pN/s. Efter varje stretching cykel, DNA-molekylen hölls på 1 pN för 30 s att tillåta ssDNA till refold till G4. Förlängning hoppet i kraft-ökning scan anges en pågående övergången av G4. När du använder en icke-G4 bildar sekvens, kan inte plötslig förlängning hoppet observeras. Vecklar force distribution kan erhållas genom inspelning krafterna som utspelas inträffade. Unfoldingen tvinga fördelningen av G4-15T erhålls vid 0,2 pN/s visade en enskild topp på ~ 52 pN. Dock i närvaro av 10 nM RHAU, G4-15T förblev vikta under kraft-öka genomsökningen för upp till 60 pN, indikerande G4 stabilisering av RHAU bindande. I närvaro av 10 nM RHAU och 1 mM ATP skiftades utspelas force distribution till en lägre styrka, vägledande av en ATP-beroende destabilisering av G4 av RHAU.
Kraft-hoppa mätningar av G4 utspelas i närvaro eller frånvaro av RHAU Protein:
Figur 5 visar ett representativt spår av pärla höjden under fyra kraft-hoppa cykler (figur 5, vänstra panelen). den kraft som anbringas på molekylen var cyklade mellan 54 pN för 30 s som en hopvikt G4 kunde vara Övik, och 1 pN för 60 s som en hopvikt G4-15T kunde refold. Den genomsnittliga livslängden för vikta G4-15T på 54 pN var ~ 6,4 s, beräknad genom att montera livstid histogrammet med en exponentiell förruttnelse funktion13. Efter flödar i en lösning av 10 nM RHAU helicase utan ATP, förlängning av uppbundna DNA förblev på en hopvikt nivå under hela den 30 s hålltid på 54 pN, vilket indikerar att RHAU starkt stabiliserar strukturen G4-15T mot mekaniska utspelas i den avsaknad av ATP. Efter flödar i 10 nM RHAU och 1 mM ATP, var förlängning av samma molekyl direkt efter hoppa från 1 pN till 54 pN i nivå med Övik ssDNA, vilket indikerar att RHAU destabiliserar G4 strukturen i närvaro av ATP.
Figur 1: Förberedelse av G4 DNA för singel-molekyl stretching experiment.
DsDNA handtagen utarbetades av PCR använder 5'-thiol och 5'-biotin primers. PCR-produkter var renat och smält med enzymet BstXI begränsning och var renas genom gel extraktion. G4 bildar ssDNA, två flank ssDNA och dsDNA handtag var sammanskrivna använder T4 DNA-ligase. Ligated produkten renades genom gel extraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Skisser av grundläggande magnetisk pincett apparater.
(A) skiss av en flöde kanal med ett par magneter som placeras ovanför och ett mikroskopi mål placeras nedanför. (B) skiss av ett samlat flöde kanal där blå färgade rektanglarna som representerar den övre och nedre coverslips, och grå elliptiska linjer in- och utpassering av flöde kanal. (C) skiss över styrkebidrag och kalibrering av den magnetiska pincetter setup. (D) exempel på bilder av både referens pärla och rörliga pärla på olika avinstallation fokus positioner lagras i pärla bildbibliotek. Den röda skylten betecknar pärla referensbilden erhålls vid en viss delning fokus planet används för fokalplan låsa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tvinga Kalibrering Magnetisk pincett.
(A) kalibrering av kraft använder växlingarna av pärla längs en rotation-fri y-riktning. X-axeln är längs samma riktning som det magnetiska fältet. Kraft är längs z-axeln och kontrolleras genom att justera avståndet, d, mellan paret permanentmagnet och täckglaset. (B) kalibrering av med hjälp av en lång 48,502 bp-DNA. Heterogena magnetiska pärla boendet kan beskrivas av ett singel-parameter C. Denna siffra har ändrats från10. (C) kalibrering av parametern C av en magnetisk pärla fäst på en 2 kb-DNA med B till S översträckning övergången. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Singel-molekyl manipulation av en G4.
(A) skiss av en stretching enda G4 struktur och mäta händelserna utspelas. (B) typiskt exempel på kraft-ökning (cyan) och kraft-minskning kurva av en tjudrad G4. Denna siffra har ändrats från12. (C) kraft-extension kurvan av G4 i frånvaron (grå) eller närvaron (rosa) RHAU protein. (D) Unfolding tvinga fördelningen av G4 saknas (grå) (n = 140) eller närvaro (röd) RHAU och ATP (n = 117). Denna siffra har ändrats från13. Vänligen klicka påhär för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Kraft-hoppa mätningar av G4 utspelas.
(A) representativt tillfälle spår av pärla höjd förändringen under kraft hoppa cykler mellan 1 pN och 54 pN mätt utan DmRHAU, med 10 nM DmRHAU men utan ATP, och med både 10 nM DmRHAU och 1 mM ATP, som anges i panelen figur. (B) representativt tillfälle trace filändelsen förändring av en G4 molekyl (grå data) efter hoppning till 54 pN i flera kraft-hoppa cykler tas från data i (A). De tillägg som motsvarar viks (F) och Övik (U) G4 indikeras också; G4 utspelas händelser indikeras förtroendesökvägarna av pilar. Denna siffra har ändrats från13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrivits ovan, en plattform för att studera den mekaniska stabiliteten av G4 DNA och samspelet mellan protein till G4 med är singel-molekyl magnetisk pincett rapporterade. Medföljande plattformen, utvecklas högeffektiva protokoll att hitta G4 DNA tjuder, och mätning av vikning-utspelas dynamik och stabilitet G4 struktur med nanometer särskild resolution. Fokalplan låsa möjliggör mycket stabila anti drift kontroll, vilket är viktigt för att upptäcka en liten struktur övergång till exempel G4 (steg storlek ~ 7 nm) och interaktionen med proteiner i buffert exchange experiment. Denna plattform har nyligen anställts till studier av vikning och utspelas dynamiken i telomeric G414 och c-Myc arrangören G412, liksom studier av G4 bindande protein RHAU helicase13.
En typisk experiment fel är icke-specifik bindning av DNA och pärlor på täckglaset eller flera DNAs binda till magnetiska pärlor. För att minska icke-specifik bindning, behöver först, lagring av kemikalier såsom APTES och SMCC kontrolleras rutinmässigt. Andra, det är viktigt att välja en lämplig typ av magnetisk pärla och blockera icke-specifik bindning. Med 10 mg/mL BSA buffert eller små DNA oligo, såsom poly T, kan för att blockera den hydrofoba ytan av pärlor avsevärt minska icke-specifik bindning. Slutligen kan en enda DNA-tjuder lätt skiljas från flera DNA tjuder karakteristiskt DNA overstretching övergången17,18,19.
För närvarande position bestämning av plattformen är baserad på den pärlan imaging analys, som har en begränsad rumslig upplösning på ~ 2 nm. Det har dessutom en begränsad samplingsfrekvens för ~ 100 Hz, främst på grund av begränsad förvärv av typiska CCD-kameror och korrelation analyser av bilder. Dessa begränsningar kan övervinnas med hjälp av totalreflexion mikroskopi (Frida) belysning. Den producerar ett tunt lager av flyktig ljus som exponentiellt sönderfaller med höjden från ytan, vilket kan användas för att avgöra förlängning ändringen av korta molekyler i en hög signal-brus-förhållande, samtidigt som man undviker pärla bild förvärv och analys26 . En annan begränsning är att det är utmanande att direkt visualisera den uppbundna molekyl eller ligand bunden till uppbundna molekylen med hjälp av fluorescens imaging i vertikal stretching design, som kan övervinnas genom stretching molekyler i fokalplanet med tvärgående magnetisk pincett27. Slutligen, den nuvarande utformningen av kanalen reaktion inte tillåter snabb lösning utbyte på grund av den flöde störning till molekylen. Dessutom kan en stor drar kraft genereras vid hög hastighet flöde även bryta tjudra. Denna begränsning kan övervinnas genom att manipulera tjuder inuti mikrobrunnarna placeras på bottenyta kanal28.
G4 stabiliserande föreningar betraktas för närvarande som potentiella terapeutiska mål för sjukdomar, inklusive cancer, virus relaterade sjukdomar och neurodegeneration sjukdomar29,30,31. Protokollet kan tillämpas på ett brett utbud av G4 bindande proteiner2 och små ligander32. Förutom program i G4 studier, kan denna plattform samt protokoll, i princip användas för studier av andra nukleinsyror sekundära konstruktioner, inklusive DNA och RNA hårnålar, triplex och jag-motif33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Meng Pan för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete stöds av Singapore ministeriet för Utbildning akademisk forskning fonden Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) till J.Y.; den National Research Foundation genom den Mekanobiologi Institute Singapore till J.Y.; National Research Foundation, premiärministerns kontor, Singapore, under dess NRF Investigatorship programmet (NRF Investigatorship Award No. NRF-NRFI2016-03 – J.Y.; den grundläggande forskningsfonden för Central universiteten (2017KFYXJJ153) till H. Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
