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Immunology and Infection

अपोपाटोटिक कोशिकाओं के लिए फागोसिटायोसिस परख doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

हम यहां ड्रोसोफिला के फैल चुके भ्रूण कोशिकाओं का उपयोग करते हुए एक फागोसाइटिटिस परख का वर्णन करते हैं। यह हमें वीवो फागोसिस्टोस के स्तरों को आसानी से और सटीक रूप से मापने में सक्षम बनाता है और एपोपोटिक कोशिकाओं के फागोसिटासिस के लिए आवश्यक नए अणुओं की पहचान करता है।

Abstract

एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis के आधार पर आणविक तंत्र अधिक प्रतिरक्षा और भड़काऊ असभ्य बीमारियों में अपनी भूमिका के कारण अधिक विस्तार से स्पष्ट किया जाना चाहिए। हमने यहां फॉगोसिटोस की जांच करने के लिए एक प्रायोगिक विधि विकसित की है, जिसमें फल मक्खी ड्रोसोफिला का उपयोग मात्रात्मक है, जिसमें जीन नेटवर्क सिकुड़ना प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए स्तनधारियों से विकासशील रूप से संरक्षित है। ड्रॉसोफिला भ्रूण को पूरे जानवरों का उपयोग करने के लिए सफ़ाई और घूमने वाले फागोसाइट्स को सही तरीके से पहचानने और गिनने के लिए, फॉगोसाइट्स और एपोप्टोोटिक कोशिकाओं सहित फैले हुए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण को मिला दिया गया। फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के उपयोग से हमें विवो फागोसिटासिस के स्तरों को मापने में मदद मिलती है जैसे कि हम इन विट्रो फागोसिटोसिस परख का प्रदर्शन करते हैं जिसमें पूरे भ्रूण में सभी फागोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का निरीक्षण किया जा सकता है और फ़ैगोसिटासिस के स्तर को ठीक से निर्धारित किया जा सकता है। हमने पुष्टि की है कि यह पद्धति पिछले अध्ययनों की पुन: प्रजनन करती हैकि एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis के लिए आवश्यक जीन की पहचान। इस पद्धति से मृत कोशिकाओं की समाप्ति का विश्लेषण किया जा सकता है, और जब ड्रोसोफिला के शक्तिशाली आनुवंशिकी के साथ मिलकर, फागोसाइट्स द्वारा एपोपोटिक कोशिकाओं के प्रवासन, मान्यता, घुटन और गिरावट के जटिल फ़ैगोसिटिक प्रतिक्रियाओं को प्रकट किया जाएगा।

Introduction

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मेटाजोन जानवरों में, जैसे नेमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस , फल उड़ ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर , और चूहों और मनुष्यों, बड़ी संख्या में कोशिकाओं के विकास के दौरान एपोप्टोसिस से गुजरता है ताकि उनके शरीर और वयस्कता में होमियोस्टेसिस 1 , 2 बनाए रख सकें। अपोप्तोटिक कोशिकाओं क्योंकि वे immunogenic intracellular सामग्री को रिहा करता है, तो पूरी तरह से 3 हटाया नहीं द्वारा आसपास के ऊतकों में सूजन प्रेरित तेजी से हटा दिया जाना चाहिए। तेजी से हटाने की सुविधा के लिए, एपोपोटिक कोशिका तथाकथित खाने-मुझे सिग्नल पेश करते हैं जो फागोसाइट्स के सिकुड़न रिसेप्टर्स द्वारा पहचाने जाते हैं, और फागोसिटासिस 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा समाप्त हो जाते हैं। इस प्रकार, मेजबान होमियोस्टेसिस के रखरखाव में फागौसाइटोसिस एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इसलिए, मोलेक्यू को स्पष्ट करता है एपोपोटिक कोशिकाओं के फागोसिटायोसिस के अंतर्गत लार तंत्र महत्व का है।

Apoptotic कोशिकाओं के phagocytosis के लिए जिम्मेदार तंत्र नेमेटोड्स, मक्खियों, और चूहों 7 में प्रजातियों के बीच विकासशील रूप से संरक्षित किया जा रहा है। इन मॉडल जानवरों में एपोपोटिक कैंसर की समाप्ति का आकलन करने के लिए वर्तमान में कई फागोसाइटिटिस assays उपलब्ध हैं। सी। एलिगेंस में , 131 दैहिक कोशिकाएं विकास के दौरान क्रमादेशित कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं, और कोशिका के शव पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा फागौसाइट हैं, जो गैर-पेशेवर फागोसाइट्स 8 हैं । इस प्रकार, सी में शेष कोशिकाओं की संख्या की संख्या की गणना करना । एलिगेंस विवो में फ़ैगोसाइटोसिस के स्तर को इंगित करते हैं। नेमेटोड म्यूटेंट की खोज के लिए जो मृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि दर्शाते हैं, phagocytosis के लिए जरूरी कई जीनों को पहचान लिया गया है और आनुवंशिक रूप से 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12

प्राइमरी कल्चर फागोसाइट्स, आमतौर पर मैक्रोफेज के साथ पूर्व विवो फॅगोसिटासिस एसेज का अक्सर चूहों में उपयोग किया जाता है। अपोपटिक कोशिकाओं को सेल लाइनों जैसे ज़र्कट कोशिकाओं का उपयोग करके तैयार किया जाता है, और प्राथमिक फागोसाइट्स के साथ मिलाया जाता है। कई घंटों के लिए ऊष्मायन के बाद, फागोसाइटिस के स्तर की गणना करने के लिए फागोसाइट्स की कुल संख्या और फ़ैगोसाइट्स को शामिल किया जाता है। इस पद्धति का एक परिष्कृत संशोधन के रूप में, नागाटा के समूह ने एक पूर्व विवो फागोसिटोस परख विकसित किया है, जिसमें कोशिकाएं-प्रतिरोधी आईसीएडी (कस्पेस-सक्रिय डीएनस के अवरोध करनेवाला) को व्यक्त करते हैं, जिसमें एपोपोटिक कोशिकाएं एपोपोटिक डीएनए विखंडन से गुजरती हैं, लेकिन डीएनए अभी भी साफ हो जाता है कोशिकाएं फागॉसिटॉज हैं जब इन कोशिकाओं को एक फागोसाइटिटिस परख के एपोपोटिक लक्ष्य के रूप में उपयोग किया जाता है, तो केवल एपोपोटिक कोशिकाओं में घिरा हुआ डीएनए विखंडित होता है, और टीडीटी-मध्यस्थता वाले डीयूटीपी निक अंत लेबलिंग (ट्यूनेल) द्वारा दाग़ा जाता है। इसलिए, लेवीएपोपोटिक कैल्श की समाप्ति को फागौसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं 13 के मिश्रण में ट्यूनेल संकेतों की गणना के द्वारा मापा जाता है।

डी। मेलानोगस्टर में , हेमोसाइट्स नामित पेशेवर फागोसाइट्स, ड्रोसोफिला मैक्रोफेज, एपोप्टोोटिक कोशिकाओं 14 , 15 के फागोसिटायोसिस के लिए जिम्मेदार हैं। पूरी तरह से ड्रोसोफिला भ्रूण के साथ विवो फागोसिटायोसिस assays में , संस्कृति सेल लाइनों के साथ इन विट्रो फागोसिटाइसेस assays में उपलब्ध हैं। ड्रोसोफिला भ्रूण एपोपोटिक सेल की समाप्ति के स्तर की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है क्योंकि कई कोशिकाएं एपोपोटिकिस से गुज़रती हैं और भ्रूण के विकास के दौरान हेमोसाइट्स द्वारा phagocytosed हैं 14 , 15 , 16विवो फागोसिटोसिस परख का एक उदाहरण फ़्रैंक समूह द्वारा विकसित विधि है। उनके विधि में, हीमोसाइट्स डी हैंपेरोक्साइडिस के प्रतिरक्षण द्वारा, एक हीमोसाइट मार्कर, एपोपोटिक कोशिकाएं पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण में परमाणु डाई, 7-एमिनो एक्टिनोमायसीन डी का उपयोग करके दागिल हैं, और दोहरा सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को फागोसिटायसिस 17 के संकेत के रूप में गिना जाता है। भ्रूण पर फ़ैगोसिटायस परख का एक और उदाहरण ऊपर वर्णित नागता की पद्धति पर आधारित है; हालांकि, vivo phagocytosis में डीसीएडी के भ्रूण ( ड्रोसोफिला कस्पेस सक्रिय DNase) उत्परिवर्ती मक्खियों 18 , 1 9 का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। विवो फागोसाइटिटिस assays में यह सीटू में सीधे phagocytosis देखने के लिए उपयोगी होते हैं। हालांकि, कठिनाई फ़ैगोसिटॉसिंग कोशिकाओं की गिनती के चरण में किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को छोड़कर जुड़ी हुई हैं क्योंकि इसकी पूरी मोटाई के कारण पूरे भ्रूण में सभी फागोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का पालन करना कठिन है।

इस सीमा को पार करने के लिए, हम विकास करते हैंड्रोसोफिला भ्रूण में एक नई phagocytosis परख एड हमारे विधि में, आसानी से फामोसिटॉसिंग हेमोसाइट्स की गिनती करने के लिए, पूरे भ्रूण को फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं को तैयार करने के लिए तैयार किया गया है। Phagocytes एक phagocyte मार्कर के immunostaining द्वारा पता लगाया जाता है, और apoptotic कोशिकाओं इन छितरी हुई भ्रूण कोशिकाओं के साथ TUNEL द्वारा पता लगाया जाता है। फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के उपयोग से हमें विवो फागोसिटोसिस के स्तरों को मापने में मदद मिलती है जैसे कि हम में इन विट्रो फागोसिटोसिस परख का प्रदर्शन किया है जो कि वास्तव में फागोसिटासिस के स्तर को बढ़ाता है। मक्खियों के सभी जीनोटाइप इस परख में नियोजित किया जा सकता है यदि वे भ्रूण 20 के चरण 16 को विकसित करते हैं, तो विकासात्मक चरण जिस पर phagocytosis द्वारा apoptotic सेल निकासी सबसे प्रचुर मात्रा में है। इस पद्धति में phagocytosis के मात्रा का आकलन करने का लाभ होता है, और, इस प्रकार, विवो में एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis में शामिल नए अणुओं की पहचान में योगदान दे सकता है

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Protocol

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1. तैयारी

  1. ताजे अंगूर के रस की प्लेटों की तैयारी
    1. अगर पानी की 100 मिलीलीटर की मात्रा 4.4 ग्राम में जोड़ें, तो मिश्रण को माइक्रोवेव ओवन में गर्म करने के लिए गरम करें।
    2. ताजा अंगूर का रस, एसीटिक एसिड के 5 एमएल, और अगर एथनॉल के 5 एमएल एगर समाधान के 80 एमएल जोड़ें।
    3. प्रत्येक ग्लास स्लाइड पर विंदुक के साथ समाधान का लगभग 1.5 एमएल डालो, और इसे मजबूत करने की अनुमति दें
  2. 6 सेमी डिश एगरोस प्लेट्स की तैयारी
    1. 0.5 ग्राम agarose में 50 एमएल पानी जोड़ें, और agarose को भंग करने के लिए एक माइक्रोवेव ओवन में मिश्रण गर्मी।
    2. एक विंदुक के साथ एक 6 सेमी डिश पर लगभग 2.5 मिलीलीटर agarose समाधान डालो।

2. चरण 16 भ्रूण संग्रह

  1. वयस्क मक्खियों को इकट्ठा करें, और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 200 मादा और 200 नर जोड़ दें।
  2. 50 एमएल ट्यूब में खमीर पर ताजा अंगूर का रस लगा लीजिए, और स्पंज सीए के साथ बंद करेंपी।
  3. मक्खियों को 16 डिग्री सेल्सियस से 2 से 3 दिनों के लिए प्रकाश में सेते हैं। एक दिन में एक बार प्लेट को बदलें।
  4. 1 घंटे के लिए मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ले जाएं।
  5. खमीर के बिना नये प्लेट में पुराने प्लेट को बदलें। मक्खियों को 2 घंटे के लिए अंडे देना चाहिए
  6. प्लेट ले लीजिए और 26 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. पीबीएस के 1 एमएल में 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स-100 युक्त पेंट ब्रश के साथ प्लेट से भ्रूण लीजिए
  8. पीबीएस के 1 एमएल युक्त 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 युक्त भ्रूण को दो बार धोएं।
  9. Chorion को हटाने के लिए, 3 मिनट के लिए भ्रूण के लिए 1.2 एमएल सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान (2.2 - 3.4% सीएल) जोड़ें।
  10. भ्रूण को 4 बार पीबीएस युक्त 1 एमएल युक्त 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 युक्त रखें।
  11. 6 सेमी डिश एगरोज प्लेटों पर भ्रूण रखें। रॉबर्ट्स 20 द्वारा वर्णित माइक्रोस्कोप के तहत चरण 16 भ्रूण उठाएं माइक्रोप्रोपेट के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्रेफ माइक्रो टेस्ट ट्यूब में लगभग 50 भ्रूण लीजिए।

3. प्रीपाभ्रूण कोशिकाओं का राशन

  1. भ्रूण को पीबीएस के 150 μL के साथ दो बार धो लें।
  2. पीबीएस में 200 μL कोलेजनज़ (0.25% (डब्ल्यू / वी)) की उपस्थिति में 1.5 एमएल सूक्ष्म परीक्षण ट्यूब और गोली मिक्सर में भ्रूण को 30 बार होमोजीएज करें।
  3. 10 बार pipetting द्वारा भ्रूण कोशिकाओं को फैलाने, और एक 1.5 एमएल ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरित। 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 1 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  4. सेल निलंबन में 800 μL की पीबीएस जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1400 x ग्राम में अपकेंद्रित्र
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस में कोशिकाओं में 200 μL ट्रिप्सिन (0.25% (w / v)) जोड़ें। 50 बार pipetting द्वारा भ्रूण कोशिकाओं फैलाने
  6. 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के साथ सेल निलंबन को छानना।
  7. Trypsin गतिविधि को रोकने के लिए, छानने योग्य सेल निलंबन के लिए 40 μL गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,400 x ग्रा पर 800 μL पीबीएस और अपकेंद्रित्र जोड़ें
  8. सुपरनोटा निकालेंNT, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1400 x जी पर पीबीएस के 200 μL में उपजी निलंबित कोशिकाओं, और अपकेंद्रित्र।
  9. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और पीबीएस के 30 μL में प्रक्षेपित कोशिकाओं को निलंबित करें।
  10. एमिनोप्रोपील ट्राइथॉक्सीसेलीन-लेपित ग्लास स्लाइड्स पर तैयार सेल निलंबन को माउंट करें, और 10-15 मिनट तक इंतजार करें जब तक कांच के स्लाइड्स से कोशिकाएं संलग्न न हों।
  11. एक विंदुक के साथ ग्लास स्लाइड पर शेष समाधान निकालें। माउंट 60 - पीबीएस युक्त 70 μL युक्त 4% (वाय / वी) पीएफए ​​(पैराफॉर्मालाहाइड) 10 से 15 मिनट के लिए कोशिकाओं पर।
  12. निर्धारण समाधान को निकालें, और 1 से अधिक मिनट के लिए पीबीएस में ग्लास स्लाइड रखें।

4. हेमोसाइट्स के धुंधला

  1. एक विरोधी क्रोकमॉर्ट एंटीबॉडी के साथ immunostaining
    1. 10 मिनट के लिए मेथनॉल में कांच की स्लाइड्स को धीरे-धीरे भिगोएँ, पीबीएस में 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -10 10 मिनट के लिए, और फिर 10 मिनट के लिए पीबीएस में।
    2. पीबीएस कंटेनर में 20% ± 5% (वी / वी) पूरे सूअर सीरम माउंट करेंअवरुद्ध करने के लिए कोशिकाओं पर 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 एनजी। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड सेते
    3. कांच की स्लाइड्स से समाधान निकालें, और कोशिकाओं पर 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 वाले पीबीएस में 20 μL विरोधी-क्राकोमॉर्ट एंटीसरियम 19 , 21 (0.1% (वी / वी)) पर माउंट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात स्लाइड करें।
    4. पीबीएस में गिलास स्लाइड्स में भिगोएँ जिसमें 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -10 10 मिनट के लिए 5 गुना हो।
    5. 10 मिनट के लिए पीबीएस में गिलास स्लाइड करें
    6. पीबीएस में 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स-100 और 5% (वी / वी) युक्त कमरे में कोशिकाओं पर पूरे स्वाइन सीरम युक्त क्षारीय फॉस्फेट-लेबल एंटी-चूहा आईजीजी (20%) के 20 μL को माउंट करें 1 घंटे के लिए तापमान
    7. पीबीएस में गिलास स्लाइड्स में भिगोएँ जिसमें 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -10 10 मिनट के लिए 5 गुना हो।
    8. 100 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 9.5, 100 मिमी NaCl युक्त बफर में कांच स्लाइड भिगोएँ, और 10 मिनट के लिए 50 मिमी 2 MgCl।
    9. माउंट फॉस्फेट सब्सट्रेट समाधान जिसमें 0.23 मिलीग्राम / एमएल 5-ब्रोमो -4 है-चलोरो-3-इंडोलिल-फॉस्फेट (बीसीआईपी), 0.35 मिलीग्राम / एमएल नाइट्रो ब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी), 100 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 9.5, 100 एमएम नाओक्ल और 50 एमएम एमजीसीएल 2 कोशिकाओं पर।
    10. उचित धुंधला के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखें। जब मजबूत बैंगनी सिग्नल हेमोसाइट्स के ग्रैन्यूल में दिखाई देते हैं, तो सब्सट्रेट समाधान को हटा दें, और बफर में 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.5 और 1 एमएम ईडीटीए युक्त कांच की स्लाइड्स को भिगो दें। लगभग 5-10 मिनट के लिए धुंधला होने की सिफारिश की गई है।
  2. एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ immunostaining (हेमोसाइट्स के धुंधला के लिए एक अन्य विकल्प)
    1. 10 मिनट के लिए मेथनॉल में कांच की स्लाइड्स को सामान्यतः भिगो दें, पीबीएस में 0.2% (वी / वी) युक्त 10 मिनट के लिए ट्राइटन एक्स-100 और 10 मिनट के लिए पीबीएस।
    2. अवरुद्ध करने के लिए कोशिकाओं पर 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस में 5% (वी / वी) में 20 μL की पूरी सूअर सीरम माउंट करें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड सेते
    3. ग्लास स्लाइड पर समाधान निकालें, और माउस एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (1% (वी / वी)) / पीबीएस सी के 20 μL को माउंट करेंकोशिकाओं पर 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 से संबंधित कमरे के तापमान पर स्लाइड रातोंरात सेते हैं।
    4. पीबीएस में गिलास स्लाइड्स में भिगोएँ जिसमें 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -10 10 मिनट के लिए 5 गुना हो।
    5. 10 मिनट के लिए पीबीएस में गिलास स्लाइड करें
    6. पीबीएस में 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स-100 और 5% (वी / वी) कमरे में कोशिकाओं पर पूरी तरह से सूअर सीरम युक्त पीबीएस में क्षारीय फॉस्फेट-लेबल एन्टी-माउस आईजीजी (0.5% (वी / वी)) के 20 μL को माउंट करें 1 घंटे के लिए तापमान
    7. पीबीएस में गिलास स्लाइड्स में भिगोएँ जिसमें 0.2% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -10 10 मिनट के लिए 5 गुना हो।
    8. 10 मिनट के लिए 100 मिमी त्रि-एचसीएल, पीएच 9.5, 100 मिमी NaCl, और 50 मिमी एमजीसीएल 2 से मिलकर बफर में गिलास स्लाइड करें।
    9. फॉस्फेट सब्सट्रेट 0.23 मिलीग्राम / एमएल BCIP, 0.35 मिलीग्राम / एमएल एनबीटी, 100 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 9.5, 100 मिमी NaCl, और कोशिकाओं पर 50 मिमी 2 MgCl युक्त समाधान माउंट करें।
    10. उचित धुंधला के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखें। जब बैंगनी संकेत पूरे हेमोसाइट्स में दिखाई देते हैं, तो सब्सट्रेट समाधान को हटा दें और बफर में स्लाइड्स भिगो दें10 मिमी त्रि-एचसीएल, पीएच 8.5 और 1 एमएम ईडीटीए का। लगभग 10-15 मिनट के लिए धुंधला होने की सिफारिश की जाती है।

5. TUNEL द्वारा अपाप्टीटिक कोशिकाओं को दाग़े

  1. 5 मिनट के लिए पीबीएस में गिलास स्लाइड करें
  2. नई पीबीएस के साथ दोहराएं
  3. 10 मिनट के लिए कोशिकाओं पर माउंट संतुलन बफर (सामग्री तालिका देखें)
  4. कांच की स्लाइड्स से समाधान निकालें, और टीडीटी समाधान के 5 μL युक्त टर्मिनल डीओक्सिनक्लियोटिडिल ट्रांसनेशेज़ और 15 μL रिएक्शन बफर की कोशिकाओं पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 20 μL माउंट करें।
  5. कांच की स्लाइड्स से समाधान निकालें, और बफर में स्लाइड्स भिगोएं जिसमें 0.5 एमएल स्टॉप / वॉश बफर और 17 एमएल पानी शामिल हैं।
  6. 5 मिनट के लिए 3 बार पीबीएस में स्लाइड्स भिगोएँ
  7. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं पर 20 μL एंटी डिग्बोसिंजिन-पेरोक्साइड माउंट करें
  8. पीबीएस में कांच की स्लाइड्स 5 मिनट में 4 बार सोखें।
  9. पेरोक्साइड सब्सट्रेट समाधान में कांच की स्लाइड्स ले लीजिए जिसमें 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.5 कंटेनिन के 30 एमएलजीए 30 एस के लिए 3,3'-हीरोइनोबेंज़ाइडिन टेट्राहाइड्रिकोक्लाइड (डीएबी), और 0.002% (वी / वी) एच 22 के पूर्ण सूक्ष्म स्पॉटुला
  10. एपोपोटिक कोशिकाएं भूरे रंग के रंगीन हो जाने से चरण 5.9 दोहराएं। पेरॉक्सिडेस प्रतिक्रिया को रोकने के लिए कांच के स्लाइस पानी में भिगोएँ।
  11. अवलोकन के लिए पानी के साथ कोशिकाओं को संलग्न करें।

6. Apoptotic कोशिकाओं के Phagocytosis के स्तर को मापने

  1. फ़ैगोसाइटोसिस के स्तर का आकलन करने के लिए एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के तहत नमूने देखें। क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव कोशिकाओं या जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को हेमोसाइट्स, एपोपोटिक कैटल्स के रूप में ट्यूनियल पॉजिटिव सेल, और फागोजिटॉसिंग हेमोसाइट्स के रूप में दोहरे सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में गणना करें।
  2. फागोसिटिक इंडेक्स को क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव कोशिकाओं या जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या में डबल पॉज़िटिव सेल की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है। यह अनुशंसा की जाती है कि 300 से अधिक हेमोसाइट्स मनाया जाता है।

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Representative Results

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एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis की जांच करने के लिए, विकास चरण 16 के ड्रोसोफिला भ्रूण को एकत्र किया गया और वितरित कोशिकाओं के रूप में तैयार किया गया। हेमोसाइट्स, ड्रोसोफिला मैक्रोफेज, एक विशिष्ट एंटीबॉडी 19 , 21 , और एपोप्टोटीक कोशिकाओं का प्रयोग करते हुए हेमॉइसटे मार्कर "क्रोकमॉर्ट" 17 , 22 के लिए इम्युनोसायटोकैमिस्ट्री द्वारा दाग गया, और फैलाने वाले भ्रूणीय कोशिकाओं ( चित्रा 1 ए ) में ट्यूनल द्वारा एपोपोटिक कोशिकाएं दाग गईं। क्रोकमॉर्ट, एक ड्रोसोफिला सीडी 36-संबंधित रिसेप्टर, विशेष रूप से सभी भ्रूणीय हेमोसाइट्स 22 पर व्यक्त किया गया है, और ड्रोसोफिला भ्रूण 17 में एपोपोटिक कोशिकाओं की निकासी में शामिल होने के लिए आनुवंशिक रूप से दिखाया गया है। क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव कोशिकाओं में उनके कोशिकाओं के छोटे ग्रेन्युल में बैंगनी संकेत होते हैं। ट्यूनियल पॉजिटिव सेब अब दिखाती हैंपूरे कॉर्पस में रोना संकेत ट्यूनियल पॉजिटिव कोशिकाएं अन्य कोशिकाओं की तुलना में छोटी होती हैं, और कुछ क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव कोशिकाओं के अंदर हैं, जिन्हें मृत कोशिकाओं में फागोजिटेटिक माना जाता है। 2 और 10% क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव कोशिकाओं के बीच और 1-5% ट्यूनियल पॉजिटिव कोशिकाओं को सामान्यतः सभी भ्रूण कोशिकाओं में देखा जाता है।

ड्रोसोफिला में , एपोपोटिक कोशिकाओं के समापन के दो संकेत मार्ग हैं। संबंधित फाटकों, ड्रेपर और इंटीग्रिन α पीएस 3 β ν के लिए दो फागोसिटाटिस रिसेप्टर्स, स्वतंत्र रूप से मृत कोशिकाओं 19 , 21 , 23 , 24 , 25 को पहचानते हैं। ड्रैपर ट्रान्समैमब्रेन प्रोटीन है जिसमें बाहरी क्षेत्र में एटिपिकल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) -सैंडिक अनुक्रम जैसे होते हैं और दो फास्फोरेटलेट प्रस्तुतीकरण एनपीxवाई और वाईएसएसएनएल I मेंNtracellular भाग 26 इंटेग्रिन α पीएस 3 β ν भी एक ट्रांसमीटरब्रेनेन रिसेप्टर है जिसमें α और β सबुनेट्स 25 के एक हेटरोडिमर होते हैं। चित्रा 1 बी जंगली प्रकार या drpr या Itgbn एकल उत्परिवर्ती भ्रूण में कुल hemocytes के लिए phagocytosing hemocytes के अनुपात को दर्शाता है। सभी क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव कोशिकाओं (कुल हेमोसाइट्स) और क्रोकैमर्ट- और ट्यूनेल-डबल पॉजिटिव सेल (फागोस्काइटॉसिंग हेमोसाइट्स) की गणना करके, हमने फागोसिटिक इंडेक्स की गणना हेमोसाइट्स की कुल संख्या में हेमोसाइट्स की संख्या के रूप में की है। फागोसिटिक इंडेक्स जंगली प्रकार की तुलना में ड्रपर या इटबैगन उत्परिवर्ती क्षेत्र में कम था, जबकि हेमोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाएं समान थीं ( चित्रा 1 सी- डी ), यह दर्शाती है कि इन दो जीन को एपोपोटिक सेल सिकुड़ना के लिए आवश्यक है, जैसा कि पहले आरeported।

जब एक विरोधी क्रोकमॉर्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं होती है या बदलते क्रोकमर्ट अभिव्यक्ति के साथ उत्परिवर्ती लाइनों की जांच की जाती है, तो हमें हेमोसाइट्स का पता लगाने के लिए दूसरा विकल्प चुनना होगा। हेमोसाइट -विशिष्ट प्रमोटर ( एसआरपीएचएमओ-जीएएल 4 ) द्वारा नियंत्रित एक GAL4 चालक के साथ भ्रूण, और जीएएफपी जीन जीएसएल 4-बाध्यकारी साइट ( यूएएस- ईजीएफपी ) सहित एक अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम (यूएएस) द्वारा नियंत्रित है, इसमें जीएफपी-लेबल हेमोसाइट्स 27 , जो हमें एंटी-जीएफपी का उपयोग करने वाले हेमोसाइट्स का पता लगाने में सक्षम बनाता है। चित्रा 2 ए एक विरोधी जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग कर immunostaining के साथ हीमोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का पता लगाने के बाद प्राप्त की एक छवि, और SRPHemo-GAL4UAS-EGFP के साथ भ्रूण कोशिकाओं में TUNEL दिखाता है । जबकि एक विरोधी क्रोकमॉर्ट एंटीबॉडी कोशिकाओं में छोटे ग्रैन्यूल्स को दागते हैं, एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी पूरे हेमोसाइट्स दागता है। चित्रा 1 ए , 2 - 6% जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाओं और 1-5% ट्यूनेल पॉजिटिव के समान सभी भ्रूण कोशिकाओं में कोशिकाओं को मनाया जाता है कुछ ट्यूनियल-पॉजिटिव कोशिकाओं को जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं में पता लगाया जाता है, जिन्हें मृत कोशिकाओं में फागोजिटेटिक माना जाता है। आरएनएआई-मध्यस्थता वाली पछाड़ना आसानी से एसआरपीएचएमओ-जीएएल 4यूएएस-ईजीएफपी के साथ उम्मीदवार जीनों के यूएएस-डीएसआरएनए के साथ मक्खियों को पार करके फागौसाइटोसिस में उनकी भागीदारी के लिए किसी जीन का आकलन करने के लिए लागू किया जाता है। डीआरपी या इटबबर्न के आरएनएआई-मध्यस्थता वाली पछाड़ना ने फागोसिटिक इंडेक्स ( चित्रा 2 बी ) को कम कर दिया, जबकि भ्रूण कोशिकाओं में हेमोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं की संख्या तुलनीय थी ( चित्रा 2 सी -2 डी ), फिर यह दर्शाता है कि ये फागोसिटोसिस रिसेप्टर्स फागोसिटायोसिस में शामिल हैं। एपोपोटिक कोशिकाएं समान phagocytic इंडेक्स दोनों हेमोसाइट डिटेक्शन विधियों से प्राप्त किए जाते हैं, यह सुझाव देते हैं कि दोनों संगत हैं।

जी "/>
चित्रा 1 : एंटी-क्रोकमॉर्ट एंटीबॉडी और ट्यूनल द्वारा भ्रूण कोशिकाओं का धुंधला होना ( ) एक विरोधी क्रोकमर्ट एंटीबॉडी और ट्यूनल के साथ immunostaining द्वारा डब्ल्यू 1118 तनाव से फैल भ्रूण कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों सकारात्मक या नकारात्मक रूप से दाग वाले कोशिकाओं (शीर्ष 4 पैनल) और एक कम-शक्ति क्षेत्र (निचला पैनल) के प्रतिनिधि के बड़े विचार दिखाए गए हैं। स्केल बार, 5 माइक्रोन (शीर्ष); 50 माइक्रोन (नीचे) ( बी ) ड्रोपर या इटबगियन उत्परिवर्तक में क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव हेमोसाइट्स को ट्यूनल सिग्नल के साथ क्रोकमॉर्ट-पॉजिटिव हेमोसाइट्स का अनुपात का विश्लेषण किया गया था, फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के साथ। ( सी ) क्र्रोकेमर्ट-पॉजिटिव हेमोसाइट्स का ड्रपर या इटबॉन उत्परिवर्तक के सभी कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण किया गया था फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के साथ। ( डी ) ड्रिप में सभी कोशिकाओं के लिए ट्यूनेल -पॉजिटिव एपोपोटिक कोशिकाओं का अनुपातफैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के साथ इग्बन उत्परिवर्ती का विश्लेषण किया गया था। जीनोटाइप; डब्ल्यू 1118 (जंगली-प्रकार नियंत्रण), डीआरपी Δ5 ( डीआरपी उत्परिवर्ती), और इग्बैन 2 ( इंटीविनिन β ν उत्परिवर्ती)। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि थे और विद्यार्थी के टी -टेस्ट द्वारा इसका विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक प्रयोग में लगभग 300 क्रोकमॉर्ट पॉजिटिव हीमोसाइट्स मनाए गए थे, और मूल्य तीन सूक्ष्म क्षेत्रों के मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। *; पी <0.05, एनएस; अंतर महत्वपूर्ण नहीं है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: चींटी द्वारा भ्रूण कोशिकाओं का धुंधला हो जानाआई-जीएफपी और ट्यूनल ( ) विरोधी जीएफपी एंटीबॉडी और ट्यूनेल के साथ immunostaining द्वारा srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + तनाव से फैलता भ्रूण कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों सकारात्मक या नकारात्मक रूप से दाग वाले कोशिकाओं (शीर्ष 4 पैनल) और एक कम-शक्ति क्षेत्र (निचला पैनल) के प्रतिनिधि के बड़े विचार दिखाए गए हैं। स्केल सलाखों = 5 सुक्ष्ममापी (ऊपर); 50 माइक्रोन (नीचे) ( बी ) आरएनएआई-मध्यस्थता में दस्तक के सभी जीएफपी पॉजिटिव हेमोसाइट्स को ट्यूनल सिग्नल के साथ जीएफपी-पॉजिटिव हेमोसाइट्स का अनुपात ड्रिप या आईटीजीबीएन के मक्खियों का फैलाव हुआ भ्रूण कोशिकाओं के साथ विश्लेषण किया गया था। ( सी ) जीआरपी - पॉजिटिव हेमोसाइट्स का आरएनएआई-मध्यस्थता में दस्तक के सभी कोशिकाओं के अनुपात में ड्रपर या इटबबैंड के मक्खियों का विश्लेषण किया गया था, फैल चुके भ्रूण कोशिकाओं के साथ। ( डी ) आरएनएआई-मध्यस्थता वाली दस्तक के सभी कोशिकाओं के लिए ट्यूनियल -पॉजिटिव एपोपोटिक कोशिकाओं का अनुपात ड्रपर या इटबबैंड की मक्खियों का विश्लेषण किया गया था फैलता भ्रूण कोशिकाओं के साथ। जीनोटाइप; आरएनएआई -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 यूएएस-ईजीएफपी / + , आरएनएआई ड्रपर: वाईडब्ल्यू / डब्ल्यू; SrpHemo-GAL4 यूएएस-ईजीएफपी / +; यूएएस-डीआरपीआर-आईआर / +, आरएनएआई ईटीजीबीएन : वाईड / डब्ल्यू; SrpHemo-GAL4 यूएएस-ईजीएफपी / +; यूएएस-आईटीजीबीएन-आईआर / + डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि थे और विद्यार्थी के टी -टेस्ट द्वारा इसका विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक प्रयोग में लगभग 300 जीएफपी पॉजिटिव हेमोसाइट्स मनाए गए थे, और मूल्य तीन सूक्ष्म क्षेत्रों के मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। *; पी <0.05, एनएस; अंतर महत्वपूर्ण नहीं है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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हम यहाँ ड्रोसोफिला भ्रूण का उपयोग कर एक फागोसिटास परख का वर्णन करते हैं। Phagocytosis को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए फैलाने वाले भ्रूणीय कोशिकाओं का उपयोग करके, हेमोसाइट्स, ड्रोसोफिला पेशेवर फागोसाइट्स, हेमोसाइट मार्कर क्रोकमॉर्ट या एसआरपीएचएमएमओ- संचालित जीएफपी के लिए immunostained हैं, और इस प्रोटोकॉल में एपोपोटिक कोशिकाओं का पता चला है। फागोसिटायोसिस का स्तर हेमोसाइट्स की कुल संख्या और फागोसाइटेटिंग हेमोसाइट्स की गणना करके एक फागोसाइटैटिक इंडेक्स के रूप में व्यक्त किया गया है। फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के उपयोग से हम पूरे भ्रूण में सभी फागोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का निरीक्षण कर सकते हैं और फ़ैगोसाइटोसिस के स्तर को ठीक से निर्धारित कर सकते हैं। इसके अलावा, हमारी पद्धति ने रंजक के साथ हीमोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का पता लगाया है जो एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखे जा सकते हैं, प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी नहीं। इससे फॅगोसिटास के स्तर के मूल्यांकन की सुविधा होती है क्योंकि किसी भी फिल्टर को बदलने के बिना ही हेमोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं को एक साथ रखना संभव है।

Ve_content "> निम्नलिखित बिंदु भ्रूण कोशिकाओं को धुंधला बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। भ्रूण कोशिकाओं के निर्धारण चरण में, दो सप्ताह के भीतर तैयार ताजा पीएफए ​​का इस्तेमाल करने की आवश्यकता होती है। क्रोकमॉर्ट के प्रतिरक्षण में, विरोधी क्रोकमॉर्ट के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन करने की आवश्यकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूनेल धुंधला हो जाना, अत्यधिक धुंधला होने से बचने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे सावधानीपूर्वक जांच करके डीएबी के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन की आवश्यकता होती है। ट्यूनल ने 3'-ओएच का पता लगाकर विखंडित डीएनए को देखा, जो एपोपोटिक कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में है। सामान्य कोशिकाओं में 3'-ओ.एच. 3'-टर्मिनल डीएनए में होता है, लेकिन एपोपोटिक कोशिकाओं की तुलना में निचले स्तर पर होता है। इसलिए, लंबे समय तक DAB के साथ कोशिकाओं का ऊष्मायन न केवल एपोपोटिक कोशिकाओं पर दाग होगा, बल्कि सामान्य कोशिकाओं । डीएबी धुंधला होने के दौरान हर 15 या 30 सेल्सियस के अवलोकन के लिए इस को रोकने के लिए अनुशंसित है।

इस प्रोटोकॉल में, हालांकि phagocytosis के स्तर की मात्रा का ठहराव तेज और सटीक है, कुछ जानकारी सु हैच के रूप में हेमोसाइट्स के सिकुड़ना या वितरण की साइट खो जाती है। हमने पहले दिखाया है कि पूरे भ्रूण का उपयोग करके इस परख और एक सीटू फागोसिटायस परख का उपयोग फागोगायटक इंडेक्स 21 के संदर्भ में समान परिणाम सामने आया है। इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि कुछ मामलों में प्राप्त परिणामों का सही ढंग से व्याख्या करने के लिए समानांतर में स्वस्थानी phagocytosis assay कर रहे हैं।

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में ड्रोसोफिला के पास एक और पेशेवर फागोसिट, ग्लियाल कोशिका है। यद्यपि हम इस प्रोटोकॉल में भ्रूणों में ग्लोरी कोशिकाओं द्वारा एपोपोटिक न्यूट्रॉन के फागोसाइटिटोसिस का आकलन करने के लिए नहीं बताते हैं, उसी प्रोटोकॉल को एक्सगुमेंटमेंट के स्तर को मापने के लिए लागू किया जाता है जैसा कि कुरीशी एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था , ईएमबीओ.जे 21 इसी तरह, इस परख से पता चलता है कि ड्रोसोफिला भ्रूण में ट्यूनियल पॉज़िटिव कोशिकाओं को गैर-पेशेवर फागोसाइट्स द्वारा फागोजिटेस होने की संभावना है। उन अज्ञात पीएच द्वारा फागोसिटोसिसअज्ञात घूमने वाले रिसेप्टर्स के साथ एगोसाइट्स परिणाम ( चित्रा 1 डी ) को समझा सकते हैं कि भ्रूण कोशिकाओं में एपोपोटिक कोशिकाओं की कुल संख्या एक phagocytosis जीन उत्परिवर्ती में वृद्धि नहीं हुई है।

निष्कर्ष में, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पेशेवर फागोसाइट्स द्वारा एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis के लिए आवश्यक जीन की खोज का नेतृत्व किया गया है। 24 , 25 , 28 Phagocytosis 7 अंतर्निहित, ड्रोसोफिला भ्रूण है कि जटिल phagocytosis प्रतिक्रियाओं मृत कोशिकाओं की phagocytic निकासी, जो भड़काऊ विकारों और स्तनधारियों 29 में स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों से संबंधित है में सार्थक जानकारी प्रदान कर सकता है शामिल में जीन कार्यों खुलासा आणविक तंत्र की विकासवादी संरक्षण के आधार पर।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

उनकी सलाह के लिए हम कज़ नागासा और अकीको शिरात्सुची के आभारी हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

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References

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अपोपाटोटिक कोशिकाओं के लिए फागोसिटायोसिस परख<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण
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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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