Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Анализ фагоцитоза для апоптозных клеток в doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Мы здесь описываем анализ фагоцитоза с использованием дисперсных эмбриональных клеток Drosophila . Это позволяет нам легко и точно определять уровни фагоцитоза in vivo и идентифицировать новые молекулы, необходимые для фагоцитоза апоптозных клеток.

Abstract

Молекулярные механизмы, лежащие в основе фагоцитоза апоптозных клеток, должны быть выяснены более подробно из-за его роли в иммунных и воспалительных трудноизлечимых заболеваниях. Мы разработали экспериментальный метод количественного исследования фагоцитоза с использованием фруктовой мухи Drosophila , в которой генная сеть, контролирующая реакции поглощения, эволюционно сохраняется у млекопитающих. Для точного обнаружения и подсчета поглощающих и не поглощающих фагоцитов с использованием целых животных эмбрионы дрозофилы гомогенизировали для получения диспергированных клеток, включая фагоциты и апоптотические клетки. Использование дисперсных эмбриональных клеток позволяет измерять уровни фагоцитоза in vivo, как если бы мы проводили анализ фагоцитоза in vitro, в котором можно наблюдать все фагоциты и апоптотические клетки целых эмбрионов и точно определять уровень фагоцитоза. Мы подтвердили, что этот метод воспроизводит результаты предыдущих исследованийКоторые идентифицировали гены, необходимые для фагоцитоза апоптозных клеток. Этот метод позволяет анализировать поглощение мертвых клеток и в сочетании с мощной генетикой дрозофилы выявит сложные фагоцитарные реакции, связанные с миграцией, распознаванием, поглощением и деградацией апоптотических клеток фагоцитами.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В метазоановых животных, например, нематод Caenorhabditis elegans , фруктовая муха Drosophila melanogaster и мыши и люди, большое количество клеток подвергается апоптозу во время развития, чтобы сформировать свои тела и в зрелом возрасте поддерживать гомеостаз 1 , 2 . Апоптотические клетки необходимо быстро удалить, потому что они индуцируют воспаление в окружающих тканях путем высвобождения иммуногенных внутриклеточных материалов, если они не полностью удалены 3 . Чтобы облегчить быстрое удаление, апоптотические клетки представляют собой так называемые сигналы питания, которые распознаются поглощающими рецепторами фагоцитов и устраняются фагоцитозом 3 , 4 , 5 , 6 . Таким образом, фагоцитоз играет решающую роль в поддержании гомеостаза хозяина и, следовательно, выясняет молекулу Важные механизмы, лежащие в основе фагоцитоза апоптозных клеток, имеют важное значение.

Механизмы, ответственные за фагоцитоз апоптотических клеток, по-видимому, эволюционно сохраняются среди видов у нематод, мух и мышей 7 . В настоящее время доступно несколько анализов фагоцитоза для оценки охвата апоптотических клеток у этих модельных животных. У C. elegans 131 соматические клетки подвергаются запрограммированной гибели клеток во время развития, а трупы клеток фагоцитируются соседними клетками, которые являются непрофессиональными фагоцитами 8 . Таким образом, подсчет количества оставшихся трупы клеток у C. elegans указывает на уровень фагоцитоза in vivo . Путем поиска мутантов нематод, которые показывают увеличенное количество мертвых клеток, было идентифицировано несколько генов, необходимых для фагоцитоза, и генетически характеризуются 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Экс- фагоцитоз ex vivo с фагоцитами первичной культуры, обычно макрофагами, часто используют у мышей. Апоптотические клетки получают с использованием клеточных линий, таких как клетки Jurkat, и смешивают с первичными фагоцитами. После инкубации в течение нескольких часов подсчитывают общее количество фагоцитов и поглощающих фагоцитов для оценки уровня фагоцитоза. В качестве сложной модификации этого метода группа Nagata разработала анализ фагоцитоза ex vivo с клетками, экспрессирующими резистентный к каспазе ICAD (ингибитор активированной каспазой ДНКазы), в которой апоптотические клетки не подвергаются апоптотической фрагментации ДНК, но ДНК все еще расщепляется, когда Клетки фагоцитированы. Когда эти клетки используются в качестве апоптотических мишеней в анализе фагоцитоза, только ДНК поглощенных апоптотических клеток фрагментируется и окрашивается опосредованной TdT опорой концевого звена dUTP (TUNEL). Следовательно,L популяции апоптотических клеток измеряется путем подсчета сигналов TUNEL в смеси фагоцитов и апоптотических клеток 13 .

В D. melanogaster профессиональные фагоциты, названные гемоцитами, макрофагами Drosophila , ответственны за фагоцитоз апоптотических клеток 14 , 15 . В дополнение к анализу фагоцитоза in vitro с клеточными линиями клеток доступны анализы фагоцитоза in vivo с целыми эмбрионами дрозофилы . Зародыши дрозофилы являются мощным инструментом для изучения уровня апоптотического захвата клеток, поскольку многие клетки подвергаются апоптозу и фагоцитируются гемоцитами во время эмбрионального развития 14 , 15 , 16 . Примером анализа фагоцитоза in vivo является метод, разработанный группой Франка. В их методе гемоциты являютсяПри помощи иммуноокрашивания пероксидазина маркер гемоцитов апоптотические клетки окрашиваются с использованием ядерного красителя, 7-амино актиномицина D у всех эмбрионов дрозофилы , а число двойных положительных клеток считается сигналом фагоцитоза 17 . Другой пример анализа фагоцитоза на эмбрионах основан на концепции описанного выше метода Нагаты; Однако фагоцитоз in vivo оценивается с использованием эмбрионов мутантов dCAD ( дрозофила каспазы-активированной ДНКазы) 18 , 19 . Эти анализы фагоцитоза in vivo полезны для непосредственного наблюдения фагоцитоза in situ . Однако трудности связаны с исключением любого возможного смещения на этапе подсчета фагоцитозирующих клеток, потому что из-за его толщины трудно наблюдать все фагоциты и апоптотические клетки у всех эмбрионов.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы развиваемсяОпубликовал новый анализ фагоцитоза у эмбрионов дрозофилы . В нашем методе, чтобы легко подсчитать фагоцитозирующие гемоциты, целые эмбрионы гомогенизируют для получения дисперсных эмбриональных клеток. Фагоциты обнаруживают путем иммуноокрашивания маркера фагоцитов, а апоптотические клетки обнаруживают TUNEL с этими диспергированными эмбриональными клетками. Использование дисперсных эмбриональных клеток позволяет измерять уровни фагоцитоза in vivo, как если бы мы провели анализ фагоцитоза in vitro, который точно определяет уровень фагоцитоза. Все генотипы мух могут быть использованы в этом анализе, если они развиваются до стадии 16 эмбрионов 20 , стадии развития, при которой апоптотический клиренс клеток фагоцитозом является наиболее распространенным. Этот метод имеет то преимущество, что количественно оценивает уровень фагоцитоза и, таким образом, может способствовать идентификации новых молекул, участвующих в фагоцитозе апоптотических клеток in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка

  1. Приготовление агара из свежих виноградных соков
    1. Добавьте 100 мл воды к 4,4 г агара и нагрейте смесь в микроволновой печи для растворения агара.
    2. Добавьте 80 мл свежего виноградного сока, 5 мл уксусной кислоты и 5 мл этанола в раствор агара.
    3. Налейте примерно 1,5 мл раствора пипеткой на каждый стеклянный предмет и дайте ему затвердеть.
  2. Приготовление 6 см чашечных агарозных пластин
    1. Добавить 50 мл воды до 0,5 г агарозы и нагреть смесь в микроволновой печи для растворения агарозы.
    2. Налейте приблизительно 2,5 мл раствора агарозы на блюдо 6 см с пипеткой.

2. Этап 16 Коллекция эмбрионов

  1. Соберите взрослых мух и добавьте 200 женщин и 200 мужчин в коническую трубку объемом 50 мл.
  2. Поместите тарелку свежего агара из виноградного сока на дрожжи в трубку объемом 50 мл и закройте губкой caп.
  3. Инкубируйте мух при 16 ° C на свет в течение 2 - 3 дней. Изменяйте тарелку один раз в день.
  4. Переместите мухи в темноту при 25 ° C в течение 1 часа.
  5. Измените старую пластину на новую без дрожжей. Позвольте мухам откладывать яйца на 2 часа.
  6. Соберите планшет и инкубируйте при 16 ° C в течение 26 часов.
  7. Собирайте эмбрионы с пластины кистью в 1 мл PBS, содержащей 0,2% (об. / Об.) Triton X-100.
  8. Промывают эмбрионы дважды с помощью 1 мл PBS, содержащего 0,2% (об. / Об.) Triton X-100.
  9. Чтобы удалить хорион, добавьте 1,2 мл раствора гипохлорита натрия (2,2-3,4% Cl) к эмбрионам в течение 3 мин.
  10. Промывают эмбрионы 4 раза 1 мл PBS, содержащего 0,2% (об. / Об.) Triton X-100.
  11. Поместите эмбрионы на 6-сантиметровые агарозные пластины. Возьмите за основу эмбрионы стадии 16 под микроскопом, как описано Roberts 20 . Соберите приблизительно 50 эмбрионов в 1,5-миллилитровой микропробирке Treff с микропипеткой.

3. ПрепаРацион эмбриональных клеток

  1. Промывайте эмбрионы дважды 150 мкл PBS.
  2. Гомогенизировать эмбрионы 30 раз в 1,5 мл микропробирке и таблетировочном смесителе в присутствии 200 мкл коллагеназы (0,25% (мас. / Об.)) В PBS.
  3. Диспергируют эмбриональные клетки путем пипетирования 10 раз и перемещают суспензию клеток в 1,5 мл пробирку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 мин на водяной бане. Повторите этот шаг дважды.
  4. Добавить 800 мкл PBS к суспензии клеток и центрифугировать при 1400 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
  5. Удалите супернатант и добавьте 200 мкл трипсина (0,25% (мас. / Об.)) В PBS к клеткам. Диспергировать эмбриональные клетки путем пипетирования 50 раз.
  6. Фильтрат клеточной суспензии с помощью клеточного фильтра 70 мкм.
  7. Чтобы остановить активность трипсина, добавьте 40 мкл термонактивированной фетальной бычьей сыворотки в фильтрационную клеточную суспензию. Добавить 800 мкл PBS и центрифугировать при 1400 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
  8. Удалить супернатыNt, суспендировать осажденные клетки в 200 мкл PBS и центрифугировать при 1400 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
  9. Удалите супернатант и суспендируйте осажденные клетки в 30 мкл PBS.
  10. Нанесите подготовленную клеточную суспензию на стеклянные слайды с покрытием из аминопропилтриэтоксисилана и подождите 10-15 минут, пока клетки не присоединятся к стеклянным слайдам.
  11. Удалите оставшееся решение на стеклянных горках с помощью пипетки. Установите 60 - 70 мкл PBS, содержащего 4% (мас. / Об.) PFA (параформальдегид) на клетки в течение 10 - 15 минут для фиксации.
  12. Удалите раствор фиксации и поместите стеклянные слайды в PBS более 1 минуты.

4. Окрашивание гемоцитов

  1. Иммуноокрашивание антителом против Croquemort
    1. Серийно выдерживают стеклянные слайды в метаноле в течение 10 мин, в PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин, а затем в PBS в течение 10 мин.
    2. Установите 20 мкл 5% (об. / Об.) Всей свиной сыворотки в PBS.0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках для блокировки. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 20 мин.
    3. Удалите раствор из стеклянных слайдов и установите 20 мкл антисыворотки Ant-Croquemort 19 , 21 (0,1% (об. / Об.)) В PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках. Инкубируйте слайды при 4 ° C в течение ночи.
    4. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
    5. Замачивайте стеклянные слайды в PBS в течение 10 мин.
    6. На 20 мкл меченого щелочным фосфатазой антикрыла IgG (0,5% (об. / Об.)) В PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 и 5% (об. / Об.) Всей сыпи в свиней на клетках в комнате Температура в течение 1 часа.
    7. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
    8. Смочите стеклянные слайды в буфере, содержащем 100 мМ Трис-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl 2 в течение 10 мин.
    9. Раствор основания фосфатазы, содержащий 0,23 мг / мл 5-бром-4Хлор-3-индолилфосфат (BCIP), 0,35 мг / мл нитро-синего тетразолия (NBT), 100 мМ Трис-HCl, рН 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl 2 на клетках.
    10. Соблюдайте клетки под микроскопом для правильного окрашивания. Когда в гранулах гемоцитов появляются сильные фиолетовые сигналы, удалите раствор субстрата и промойте стеклянное стекло в буфере, состоящем из 10 мМ Трис-HCl, pH 8,5 и 1 мМ ЭДТА. Рекомендуется окрашивание в течение приблизительно 5 - 10 минут.
  2. Иммуноокрашивание антителом против GFP (другой вариант для окрашивания гемоцитов)
    1. Последовательно выдерживают стеклянные слайды в метаноле в течение 10 мин, PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин и PBS в течение 10 мин.
    2. Установите 20 мкл 5% (об. / Об.) Всей свиной сыворотки в PBS, содержащей 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках для блокировки. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 20 мин.
    3. Удалите раствор на стеклянных слайдах и установите 20 мкл мышиного анти-GFP-антитела (1% (об. / Об.)) / PBS cПолучая 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 на клетках. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение ночи.
    4. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
    5. Замачивайте стеклянные слайды в PBS в течение 10 мин.
    6. На 20 мкл меченого щелочным фосфатазой антимышиного IgG (0,5% (об. / Об.)) В PBS, содержащем 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 и 5% (об. / Об.) Всей сыворотки свиней на клетках в комнате Температура в течение 1 часа.
    7. Смочите стеклянные слайды в PBS, содержащие 0,2% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин 5 раз.
    8. Замачивайте стеклянные слайды в буфере, состоящем из 100 мМ Трис-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl 2 в течение 10 мин.
    9. Подсоедините раствор фосфатазы, содержащий 0,23 мг / мл BCIP, 0,35 мг / мл NBT, 100 мМ Трис-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl 2 на клетках.
    10. Соблюдайте клетки под микроскопом для правильного окрашивания. Когда фиолетовые сигналы появляются в целых гемоцитах, удалите раствор субстрата и промойте слайды в буфере, состоящем из10 мМ Трис-HCl, pH 8,5 и 1 мМ ЭДТА. Рекомендуется окрашивание в течение приблизительно 10 - 15 минут.

5. Пятнооптические клетки TUNEL

  1. Замочите стеклянные слайды в PBS в течение 5 мин.
  2. Повторите с новым PBS.
  3. Буфер для выравнивания буфера (см. Таблицу материалов) на ячейках в течение 10 мин.
  4. Удалите раствор из стеклянных слайдов и установите 20 мкл раствора TdT, содержащего 5 мкл концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы и 15 мкл реакционного буфера на клетках при 37 ° С в течение 1 часа.
  5. Удалите раствор из стеклянных слайдов и промойте слайды в буфере, состоящем из 0,5 мл буфера STOP / Wash и 17 мл воды.
  6. Замачивайте слайды в PBS в течение 5 мин 3 раза.
  7. Установите 20 мкл анти-дигоксигенин-пероксидазы на клетки при комнатной температуре в течение 30 мин.
  8. Замочите стеклянные слайды в PBS в течение 5 минут 4 раза.
  9. Замачивать стеклянные слайды в растворе субстрата пероксидазы, состоящем из 30 мл 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, содержится вGa полный микро шпатель 3,3'-диаминобензидинового тетрагидрохлорида (DAB) и 0,002% (об. / Об.) H 2 O 2 в течение 30 с.
  10. Повторите шаг 5.9 до тех пор, пока апоптотические клетки не окрасятся в коричневый цвет. Смочите стекло скольжения в воде, чтобы остановить реакцию пероксидазы.
  11. Закрепите клетки водой для наблюдения.

6. Измерьте уровень фагоцитоза апоптозных клеток

  1. Наблюдайте образцы под легким микроскопом, чтобы оценить уровень фагоцитоза. Грамотрицательные клетки или GFP-позитивные клетки в качестве гемоцитов, TUNEL-позитивные клетки в качестве апоптотических клеток и двойные положительные клетки в качестве фагоцитозирующих гемоцитов.
  2. Фагоцитарный индекс определяется как количество двойных положительных клеток на общее число положительных клеток в Крукморт или GFP-положительных клетках. Рекомендуется, чтобы наблюдалось более 300 гемоцитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Чтобы исследовать фагоцитоз апоптотических клеток, эмбрионы дрозофилы стадии развития 16 собирали и получали в виде дисперсных клеток. Гемоциты, макрофаги дрозофилы , окрашивали иммуноцитохимией для маркера гемоцитов «Croquemort» 17 , 22 с использованием специфического антитела 19 , 21 , а апоптотические клетки окрашивали TUNEL в диспергированных эмбриональных клетках ( фиг. 1A ). Croquemort, рецептор Drosophila CD36, специфически экспрессируется на всех эмбриональных гемоцитах 22 , и было показано, что он генетически участвует в очистке апоптотических клеток у эмбрионов дрозофилы 17 . Крокеморто-положительные клетки имеют фиолетовые сигналы в маленьких гранулах их клеток. TUNEL-позитивные клетки показывают abСигнал в целом по корпусам. TUNEL-положительные клетки меньше, чем другие клетки, а некоторые из них находятся в клетках Croquemort-positive, которые считаются фагоцитированными мертвыми клетками. От 2 до 10% Крукморт-положительные клетки и 1-5% TUNEL-позитивные клетки обычно наблюдаются во всех эмбриональных клетках.

В Drosophila существует два сигнальных пути для поглощения апоптотических клеток. Два рецептора фагоцитоза для соответствующих путей, Draper и integrin α PS3 β ν, независимо распознают мертвые клетки 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper представляет собой трансмембранный белок, который обладает атипичными эпидермальными факторами роста (EGF) -последовательностями во внеклеточной области и двумя фосфорилируемыми мотивами NPxY и YxxL в iNtracellular часть 26 . Integrin α PS3 β ν также является трансмембранным рецептором, состоящим из гетеродимера α и β- субъединиц 25 . На фигуре 1В показано отношение фагоцитозирующих гемоцитов к общим гемоцитам у эмбрионов одного мутанта дикого типа или дпр или Игбн . Считая все клетки, содержащие Croquemort-положительные (общие гемоциты) и Croquemort- и TUNEL-двойные положительные клетки (фагоцитозирующие гемоциты), мы рассчитали фагоцитарный индекс как число фагоцитозирующих гемоцитов в общее число гемоцитов. Фагоцитарный индекс был ниже у мутанта drpr или Itgbn, чем у дикого типа, в то время как количество гемоцитов и апоптотических клеток было сходным ( рис. 1C -D ), что указывает на то, что эти два гена необходимы для апоптотического клеточного охвата, как и ранее reported.

Когда анти-Croquemort антитела недоступны или мутантные линии с измененной экспрессией Croquemort, нам нужно выбрать еще один вариант для обнаружения гемоцитов. Эмбрионы с драйвером GAL4, контролируемые промотором, специфичным для гемоцитов ( srpHemo-GAL4 ), и GFP-ген, контролируемый восходящей активационной последовательностью (UAS), включая сайт связывания GAL4 ( UAS-EGFP ), имеют GFP-меченные гемоциты 27 , Что позволяет нам обнаруживать гемоциты с использованием анти-GFP. На фиг.2А показано изображение, полученное после обнаружения гемоцитов и апоптотических клеток с иммуноокрашиванием с использованием антитела против GFP и TUNEL в эмбриональных клетках с srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Хотя антитело против Croquemort окрашивает небольшие гранулы в клетки, анти-GFP-антитело окрашивает целые гемоциты. Аналогично фиг. 1А , 2-6% GFP-положительных клеток и 1-5% TUNEL-положительных Клетки наблюдаются во всех эмбриональных клетках. Некоторые TUNEL-позитивные клетки обнаруживаются внутри GFP-позитивных клеток, которые считаются фагоцитированными мертвыми клетками. RNAi-опосредованный нокдаун легко применяется для оценки любых генов для их участия в фагоцитозе путем скрещивания мух с UAS-dsRNA генов-кандидатов с srpHemo-GAL4UAS-EGFP . RNAi-опосредованный нокдаун drpr или Itgbn уменьшал фагоцитарный индекс ( рис. 2B ), тогда как число гемоцитов и апоптотических клеток в эмбриональных клетках было сопоставимым ( рис. 2C -2D ), что еще раз указывает на то, что эти рецепторы фагоцитоза участвуют в фагоцитозе Апоптотические клетки. Подобные фагоцитарные индексы получены из обоих методов обнаружения гемоцитов, что говорит о том, что оба они совместимы.

G "/>
Рисунок 1 : Окрашивание эмбриональных клеток анти-Crokemort антителом и TUNEL. ( A ) Яркие полевые изображения дисперсных эмбриональных клеток из штамма w 1118 путем иммуноокрашивания антителом против Croquemort и TUNEL. Показаны увеличенные виды репрезентативных положительно или негативно окрашенных ячеек (верхние 4 панели) и маломощное поле (нижняя панель). Масштабные бруски, 5 мкм (сверху); 50 мкм (снизу). ( В ). Отношение гликозитов, положительных к Croquemort, с сигналом TUNEL ко всем положительным гликозитам Croquemort у мутанта drpr или Itgbn анализировали с помощью дисперсных эмбриональных клеток. ( C ) Соотношение гликозитов, положительных к Croquemort, ко всем клеткам мутанта drpr или Itgbn анализировали с помощью диспергированных эмбриональных клеток. ( D ) Отношение TUNEL-положительных апоптотических клеток ко всем клеткам в drpr илиМутант Itgbn анализировали с помощью дисперсных эмбриональных клеток. генотипы; W 1118 (контроль дикого типа), drpr Δ5 ( drpr мутант) и Itgbn 2 (интегрин β ν мутант). Данные были представлены тремя независимыми экспериментами и анализировались по t- критерию Студента. В каждом эксперименте наблюдалось около 300 гемоцитов с положительным скелетом, а значения представляли среднее ± SD трех микроскопических полей. *; п <0,05, ns; Разница незначительна. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Окрашивание эмбриональных клеток с помощью AntI-GFP и TUNEL. ( A ) Яркие полевые изображения дисперсных эмбриональных клеток из штамма srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + путем иммуноокрашивания антителом против GFP и TUNEL. Показаны увеличенные виды репрезентативных положительно или негативно окрашенных ячеек (верхние 4 панели) и маломощное поле (нижняя панель). Шкала шкалы = 5 мкм (верхняя); 50 мкм (снизу). ( B ) Отношение GFP-положительных гемоцитов с сигналом TUNEL ко всем GFP-позитивным гемоцитам у RNAi-опосредованных нокаутирующих мух drpr или Itgbn анализировали с помощью дисперсных эмбриональных клеток. ( C ) Отношение GFP-положительных гемоцитов ко всем клеткам в RNAi-опосредованных мух нокдауна drpr или Itgbn анализировали с помощью дисперсных эмбриональных клеток. ( D ). Отношение TUNEL-положительных апоптотических клеток ко всем клеткам в RNAi-опосредованных мух нокдауна дррр или Itgbn анализировали с помощью диспергированных эмбриональных клеток. генотипы; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Данные были представлены тремя независимыми экспериментами и анализировались по t- критерию Студента. В каждом эксперименте наблюдалось приблизительно 300 GFP-положительных гемоцитов, а значения представляли среднее ± SD трех микроскопических полей. *; P <0,05, ns; Разница незначительна. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы описали анализ фагоцитоза с использованием эмбрионов дрозофилы . Используя диспергированные эмбриональные клетки для количественного измерения фагоцитоза, гемоциты, профессиональные фагоциты Drosophila , иммуноокрашены для маркера гемоцитов Croquemort или srpHemo- driven GFP, а апоптотические клетки обнаруживаются TUNEL в этом протоколе. Уровень фагоцитоза выражается как фагоцитарный индекс, подсчитывая общее количество гемоцитов и фагоцитозирующих гемоцитов. Использование дисперсных эмбриональных клеток позволяет наблюдать все фагоциты и апоптотические клетки у всех эмбрионов и точно определять уровень фагоцитоза. Кроме того, наш метод обнаруживает гемоциты и апоптотические клетки с красителями, которые наблюдаются под легким микроскопом, а не флуоресцентным микроскопом. Это облегчает оценку уровней фагоцитоза, потому что одновременно можно наблюдать гемоциты и апоптотические клетки без изменения какого-либо фильтра.

Ve_content "> Следующие моменты имеют решающее значение для окрашивания эмбриональных клеток. На этапе фиксации эмбриональных клеток необходимо использовать свежий PFA в течение двух недель. При иммуноокрашивании Croquemort необходимо провести инкубацию клеток с анти-Croquemort При температуре 4 o C. При окрашивании TUNEL инкубацию клеток с DAB необходимо выполнять, тщательно проверив под микроскопом, чтобы избежать чрезмерного окрашивания. TUNEL визуализирует фрагментированную ДНК, обнаруживая 3'-ОН, которая в изобилии в апоптотических клетках. Однако, Нормальные клетки также имеют 3'-ОН в 3'-конце ДНК, но на более низком уровне, чем в апоптотических клетках. Поэтому инкубация клеток с DAB слишком долго будет окрашивать не только апоптотические клетки, но и нормальные клетки Наблюдение клеток каждые 15 или 30 с при окрашивании DAB рекомендуется для предотвращения этого.

В этом протоколе, хотя количественное определение уровня фагоцитоза является быстрым и точным, некоторая информация suЧ, поскольку сайт охвата или распространения гемоцитов теряется. Ранее мы показали, что этот анализ и анализ фагоцитоза in situ с использованием целых эмбрионов дали аналогичные результаты с точки зрения фагоцитарного индекса 21 . Поэтому мы рекомендуем проводить анализ фагоцитоза in situ параллельно, чтобы точно интерпретировать результаты, полученные в некоторых случаях.

У дрозофилы есть еще один профессиональный фагоцит, глиальные клетки, в центральной нервной системе. Хотя мы не описываем, как оценивать фагоцитоз апоптотических нейронов глиальными клетками у эмбрионов в этом протоколе, тот же протокол применяется для количественного определения уровня охвата, как описано Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . Аналогичным образом, этот анализ показывает, что положительные клетки TUNEL у эмбрионов дрозофилы , вероятно, будут фагоцитированы непрофессиональными фагоцитами. Фагоцитоз этими неопознанными phАгоциты с неизвестными рецепторами поглощения могут объяснить результат ( рис. 1D ), что общее количество апоптотических клеток в эмбриональных клетках, по-видимому, не увеличивается у мутанта гена фагоцитоза.

В заключение, этот протокол успешно привел к обнаружению генов, необходимых для фагоцитоза апоптотических клеток профессиональными фагоцитами. 24 , 25 , 28 . Основываясь на эволюционном сохранении молекулярных механизмов, лежащих в основе фагоцитоза 7 , выявление функций генов у эмбрионов дрозофилы, которые включают сложные реакции фагоцитоза, может дать осмысленное представление о фагоцитарном клиренсе мертвых клеток, что связано с воспалительными расстройствами и аутоиммунными заболеваниями у млекопитающих 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарны Каз Нагаосе и Акико Ширацути за их советы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Анализ фагоцитоза для апоптозных клеток в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter