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Immunology and Infection

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Published: August 3, 2017 doi: 10.3791/56352
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

Summary

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Abstract

Os mecanismos moleculares subjacentes à fagocitose das células apoptóticas precisam ser esclarecidos com mais detalhes devido ao seu papel nas doenças imunes e inflamatórias intratáveis. Aqui desenvolvemos um método experimental para investigar a fagocitose quantitativamente usando a Drosophila da mosca da fruta, na qual a rede de genes que controla as reações de engulfment é conservada evolutivamente de mamíferos. A fim de detectar com precisão e contar fagócitos envolventes e não envolventes utilizando animais inteiros, os embriões de Drosophila foram homogeneizados para obter células dispersas, incluindo fagócitos e células apoptóticas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro em que seja possível observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros e quantificar com precisão o nível de fagocitose. Confirmamos que este método reproduz os de estudos préviosQue identificou os genes necessários para a fagocitose das células apoptóticas. Este método permite analisar a absorção de células mortas e, quando combinado com a poderosa genética da Drosophila , revelará as complexas reações fagocíticas que compõem a migração, reconhecimento, engolfamento e degradação de células apoptóticas por fagócitos.

Introduction

Em animais metazoários, por exemplo , o nematóide Caenorhabditis elegans , a mosca da fruta Drosophila melanogaster e os camundongos e os seres humanos, um grande número de células sofre apoptose durante o desenvolvimento para moldar seus corpos e na idade adulta para manter a homeostase 1 , 2 . As células apoptóticas precisam ser rapidamente removidas porque induzem inflamação nos tecidos circundantes, liberando materiais intracelulares imunogênicos, se não forem completamente removidos 3 . A fim de facilitar a remoção rápida, as células apoptóticas apresentam os chamados sinais de comer-me que são reconhecidos pelos receptores de engulfment de fagócitos e são eliminados por fagocitose 3 , 4 , 5 , 6 . Assim, a fagocitose desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do hospedeiro e, portanto, elucidando a molécula Os mecanismos subjacentes à fagocitose das células apoptóticas são importantes.

Os mecanismos responsáveis ​​pela fagocitose das células apoptóticas parecem ser conservados evolutivamente entre as espécies nos nematóides, moscas e camundongos 7 . Vários ensaios de fagocitose estão atualmente disponíveis para avaliar a absorção de células apoptóticas nestes animais modelo. Em C. elegans , 131 células somáticas sofrem morte celular programada durante o desenvolvimento, e cadáveres celulares são fagocitadas por células vizinhas, que são fagócitos não profissionais 8 . Assim, contar o número de cadáveres de células restantes em C. elegans indica o nível de fagocitose in vivo . Ao procurar por mutantes de nematóides que mostram um número aumentado de células mortas, vários genes necessários para a fagocitose foram identificados e caracterizados geneticamente 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Os ensaios de fagocitose ex vivo com fagócitos de cultura primária, geralmente macrófagos, são frequentemente utilizados em camundongos. As células apoptóticas são preparadas usando linhas celulares tais como células Jurkat e são misturadas com fagócitos primários. Após uma incubação por várias horas, o número total de fagócitos e fagócitos envolventes são contados para avaliar o nível de fagocitose. Como uma modificação sofisticada deste método, o grupo de Nagata desenvolveu um teste de fagocitose ex vivo com células que expressam um ICAD resistente a caspases (inibidor da DNase ativada por caspase), em que as células apoptóticas não sofrem fragmentação do DNA apoptótico, mas o DNA ainda é escorado quando As células são fagocitadas. Quando estas células são utilizadas como alvos apoptóticos num ensaio de fagocitose, apenas o ADN de células apoptóticas engolidas é fragmentado e corado por marcação de endereçamento DUTP mediada por TdT (TUNEL). Portanto, o leveL de engolimento de células apoptóticas é medido contando sinais de TUNEL em uma mistura de fagócitos e células apoptóticas 13 .

Em D. melanogaster , fagócitos profissionais denominados hemócitos, macrófagos de Drosophila , são responsáveis ​​pela fagocitose das células apoptóticas 14 , 15 . Além dos ensaios de fagocitose in vitro com linhas celulares de cultura, estão disponíveis ensaios de fagocitose in vivo com embriões de Drosophila inteiros. Os embriões de Drosophila são uma poderosa ferramenta para examinar o nível de absorção de células apoptóticas porque muitas células sofrem apoptose e são fagocitadas por hemócitos durante o desenvolvimento embrionário 14 , 15 , 16 . Um exemplo de um teste de fagocitose in vivo é o método desenvolvido pelo grupo de Franc. No seu método, os hemócitos são deProtegido pela imunocoloração da peroxidasina, um marcador hemicítico, as células apoptóticas são coradas usando o corante nuclear, a 7-amino-actinomicina D em embriões de Drosophila inteiros, e o número de células positivas duplas é contado como um sinal de fagocitose 17 . Outro exemplo de um teste de fagocitose em embriões baseia-se no conceito do método de Nagata descrito acima; No entanto, a fagocitose in vivo é avaliada utilizando os embriões de DNC ( Drosophila caspase-activada DNase) moscas mutantes 18 , 19 . Estes ensaios de fagocitose in vivo são úteis para observar diretamente a fagocitose in situ . Contudo, as dificuldades estão associadas à exclusão de qualquer possível viés na etapa de contagem de células fagocitantes porque é difícil observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros devido à sua espessura.

Para superar essa limitação, desenvolvemosUm novo teste de fagocitose em embriões de Drosophila . Em nosso método, para conter facilmente os hemocitros fagocitantes, os embriões integrais são homogeneizados para preparar células embrionárias dispersas. Os fagócitos são detectados pela imunocoloração de um marcador de fagócitos e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL com estas células embrionárias dispersas. O uso de células embrionárias dispersas nos permite medir níveis de fagocitose in vivo como se realizássemos um teste de fagocitose in vitro que quantificasse precisamente o nível de fagocitose. Todos os genótipos de moscas podem ser empregados neste ensaio se desenvolverem o estágio 16 de embriões 20 , o estágio de desenvolvimento no qual a depuração celular apoptótica por fagocitose é a mais abundante. Este método tem a vantagem de avaliar quantitativamente o nível de fagocitose e, portanto, pode contribuir para a identificação de novas moléculas envolvidas na fagocitose de células apoptóticas in vivo .

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Protocol

1. Preparação

  1. Preparação de placas de agar de suco de uva fresca
    1. Adicione 100 mL de água a 4,4 g de ágar e aquecer a mistura num forno de microondas para dissolver o ágar.
    2. Adicione 80 mL de suco de uva fresco, 5 mL de ácido acético e 5 mL de solução de etanol em ágar.
    3. Despeje aproximadamente 1,5 ml da solução com uma pipeta em cada lâmina de vidro e deixe solidificar.
  2. Preparação de placas de agarose de prato de 6 cm
    1. Adicionar 50 mL de água a 0,5 g de agarose e aquecer a mistura num forno de microondas para dissolver a agarose.
    2. Despeje aproximadamente 2.5 mL de solução de agarose em um prato de 6 cm com uma pipeta.

2. Coleção de embriões do estágio 16

  1. Recolha moscas adultas e adicione 200 fêmeas e 200 machos a um tubo cônico de 50 mL.
  2. Coloque um prato de agar de suco de uva fresco em fermento no tubo de 50 mL e feche com uma esponja caP.
  3. Incube as moscas a 16 ° C na luz por 2 a 3 dias. Mude a placa uma vez por dia.
  4. Mova as moscas para o escuro a 25 ° C durante 1 h.
  5. Mude a placa velha para uma nova sem fermento. Deixe as moscas colocar ovos por 2 h.
  6. Recolher a placa e incubar a 16 ° C por 26 h.
  7. Coletar embriões da placa com um pincel em 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  8. Lavar embriões duas vezes com 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  9. Para remover o corion, adicione 1,2 ml de solução de hipoclorito de sódio (2,2 - 3,4% Cl) aos embriões durante 3 min.
  10. Lavar embriões 4 vezes com 1 mL de PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  11. Coloque os embriões em placas de agarose de prato de 6 cm. Pegue os embriões do estágio 16 sob um microscópio, conforme descrito por Roberts 20 . Recolher cerca de 50 embriões em um tubo de teste de Treff de 1,5 mL com uma micropipeta.

3. PrepaRação de células embrionárias

  1. Lavar embriões duas vezes com 150 μL de PBS.
  2. Homogeneizar embriões 30 vezes em um tubo de teste micro e microondas de 1,5 mL na presença de 200 μL de colagenase (0,25% (p / v)) em PBS.
  3. Disperse células embrionárias por pipetagem 10 vezes e mova a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL. Incubar células a 37 ° C durante 1 min num banho de água. Repita este passo duas vezes.
  4. Adicione 800 μL de PBS à suspensão celular e centrifugue a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  5. Remova o sobrenadante e adicione 200 μL de tripsina (0,25% (p / v)) em PBS às células. Disperse células embrionárias por pipetagem 50 vezes.
  6. Filtra a suspensão celular com um filtro celular de 70 μm.
  7. Para parar a actividade da tripsina, adicionar 40 μL de soro bovino fetal inactivado por calor à suspensão celular filtrada. Adicionar 800 μL de PBS e centrifugar a 1.400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  8. Remova os supernatosNt, suspender células precipitadas em 200 μL de PBS e centrifugar a 1400 x g a 4 ° C durante 5 min.
  9. Remover o sobrenadante e suspender as células precipitadas em 30 μL de PBS.
  10. Monte a suspensão celular preparada em lâminas de vidro revestidas com aminopropil trietoxissilano e aguarde 10 a 15 minutos até as células serem fixadas nas lâminas de vidro.
  11. Remova a solução restante nas lâminas de vidro com uma pipeta. Monte 60 - 70 μL de PBS contendo 4% (p / v) de PFA (paraformaldeído) em células durante 10-15 min para fixação.
  12. Remova a solução de fixação e coloque as lâminas de vidro em PBS por mais de 1 min.

4. Coloração de Hemócitos

  1. Imunossinção com um anticorpo anti-Croquemort
    1. Embeber em série lâminas de vidro em metanol durante 10 minutos, em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) durante 10 minutos e depois em PBS durante 10 min.
    2. Monte 20 μL de soro de porco inteiro a 5% (v / v) em PBS contidaNg 0,2% (v / v) Triton X-100 em células para bloqueio. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Retire a solução de lâminas de vidro e monte 20 μL de antisoro anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) em células. Incubar as lâminas a 4 ° C durante a noite.
    4. Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes.
    5. Empurrar lâminas de vidro em PBS por 10 min.
    6. Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) e soro de porco inteiro a 5% (v / v) nas células na sala Temperatura durante 1 h.
    7. Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes.
    8. Soak lâminas de vidro em tampão contendo Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM durante 10 min.
    9. Solução de substrato de fosfatase de montagem contendo 0,23 mg / mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg / ml de nitro azul de tetrazólio (NBT), Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM em células.
    10. Observe as células ao microscópio para coloração adequada. Quando os sinais roxos fortes aparecem nos grânulos de hemócitos, remova a solução de substrato e remova as lâminas de vidro em tampão consistindo em Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e EDTA 1 mM. Recomenda-se a coloração de aproximadamente 5 a 10 min.
  2. Imunossinção com anticorpo anti-GFP (outra opção para a coloração de hemócitos)
    1. Embeber em série lâminas de vidro em metanol durante 10 min, PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 min e PBS durante 10 min.
    2. Monte 20 μL de soro de suco inteiro de 5% (v / v) em PBS contendo Triton X-100 a 0,2% (v / v) em células para bloqueio. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 20 min.
    3. Remova a solução em lâminas de vidro e monte 20 μL do anticorpo anti-GFP de mouse (1% (v / v)) / PBS cApresentando Triton X-100 a 0,2% (v / v) nas células. Incube as lâminas à temperatura ambiente durante a noite.
    4. Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes.
    5. Empurrar lâminas de vidro em PBS por 10 min.
    6. Monte 20 μL de IgG anti-rato marcado com fosfatase alcalina (0,5% (v / v)) em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 e 5% (v / v) de soro inteiro de suíno em células na sala Temperatura durante 1 h.
    7. Embeber escorregas de vidro em PBS contendo 0,2% (v / v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 vezes.
    8. Soak lâminas de vidro, em tampão que consiste em Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM durante 10 min.
    9. Montar a solução de substrato de fosfatase contendo 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, Tris-HCl a 100, pH 9,5, NaCl 100 mM e MgCl 2 50 mM em células.
    10. Observe as células ao microscópio para coloração adequada. Quando os sinais roxos aparecem em hemócitos inteiros, remova a solução do substrato e remova as lâminas em tampãoDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 e EDTA 1 mM. Recomenda-se a coloração de aproximadamente 10 a 15 min.

5. Mancha de células apoptóticas por TUNEL

  1. Empurre as lâminas de vidro em PBS por 5 min.
  2. Repita com o novo PBS.
  3. Mount Equilibration buffer (Ver Tabela de Materiais) em células durante 10 min.
  4. Retire a solução de lâminas de vidro e monte 20 μL de solução de TdT contendo 5 μL de desoxinucleotidil transferase terminal e 15 μL de Tampão de Reação em células a 37 ° C durante 1 h.
  5. Remova a solução das lâminas de vidro e remova as lâminas em tampão, que consiste em 0,5 mL de STOP / tampão de lavagem e 17 mL de água.
  6. Empurre as lâminas em PBS por 5 min 3 vezes.
  7. Monte 20 μL de Anti-Digoxigenina-Peroxidase em células à temperatura ambiente durante 30 min.
  8. Empurre as lâminas de vidro em PBS por 5 min 4 vezes.
  9. Embeber lâminas de vidro na solução de substrato de peroxidase consistindo em 30 mL de Tris-HCl 50 mM, contendo pH7,5E uma micro-espátula completa de tetra-hidrocloreto de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e 0,2% (v / v) de H 2 O 2 durante 30 s.
  10. Repita o passo 5.9 até que as células apoptóticas sejam manchadas em marrom. Empurre as lâminas de vidro em água para parar a reação da peroxidase.
  11. Anexe células com água para observação.

6. Medir o nível de fagocitose das células apoptóticas

  1. Observe amostras sob um microscópio de luz para avaliar o nível de fagocitose. Contagem de células positivas de Croquemort ou células GFP-positivas como hemócitos, células TUNEL-positivas como células apoptóticas e células positivas duplas como hemocitopes fagocitantes.
  2. O índice fagocítico é definido como o número de células duplas positivas para o número total de células positivas para Croquemort ou células GFP positivas. Recomenda-se que mais de 300 hemócitos sejam observados.

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Representative Results

Para examinar a fagocitose das células apoptóticas, os embriões de Drosophila do estádio de desenvolvimento 16 foram coletados e preparados como células dispersas. Hemocitus, macrófagos de Drosophila , foram corados por imunocitoquímica para o marcador de hemicíticos "Croquemort" 17 , 22 usando um anticorpo específico 19 , 21 e as células apoptóticas foram coradas por TUNEL em células embrionárias dispersas ( Figura 1A ). Croquemort, um receptor relacionado à Drosophila CD36, é expressamente expresso em todos os hemócitos embrionários 22 e foi mostrado geneticamente envolvido na depuração de células apoptóticas em embriões de Drosophila 17 . As células positivas para Croquemort possuem sinais roxos nos pequenos grânulos de suas células. As células positivas para TUNEL mostram abSinal de rocha em corpus completos. As células TUNEL-positivas são menores do que outras células, e algumas estão dentro das células positivas para Croquemort, que são consideradas como células mortas fagocitadas. Entre 2 e 10% de células positivas para Croquemort e 1 a 5% de células positivas para TUNEL são normalmente observadas em todas as células embrionárias.

Em Drosophila , existem duas vias de sinalização para a absorção de células apoptóticas. Dois receptores de fagocitose para as vias correspondentes, Draper e integrina α PS3 β ν, reconhecem independentemente as células mortas 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper é uma proteína transmembranar que possui sequências atípicas de fator de crescimento epidérmico (EGF) na região extracelular e os dois motivos fosforiláveis ​​NPxY e YxxL no iParcela ntracelular 26 . Integrin α PS3 β ν é também um receptor transmembranar que consiste em um heterodímero de subunidades α e β 25 . A Figura 1B mostra a proporção de hemocitros fagocitantes para hemócitos totais em embriões mutantes simples de tipo selvagem ou de Drpr ou Itgbn . Ao contar todas as células positivas de Croquemort (hemócitos totais) e Croquemort e TUNEL - células dobradas duas vezes (hemocitopes fagocitantes), calculamos o índice fagocítico como o número de hemocitros fagocitantes ao número total de hemócitos. O índice fagocitária foi menor no drpr ou Itgbn mutante do que no tipo selvagem, ao passo que os números de hemócitos e de células apoptóticas foram semelhantes (Figura 1C-D), indicando que estes dois genes são necessários para a imersão celular apoptótica, como anteriormente rEported.

Quando um anticorpo anti-Croquemort não está disponível ou se as linhas mutantes com expressão alterada de Croquemort são examinadas, precisamos selecionar outra opção para detectar hemócitos. Os embriões com um driver GAL4 controlado por um promotor específico de hemicíticos ( srpHemo-GAL4 ) e o gene GFP controlado por uma seqüência de ativação a montante (UAS), incluindo o local de ligação GAL4 ( UAS-EGFP ), possuem hemocitose marcado com GFP 27 , O que nos permite detectar hemócitos usando anti-GFP. A Figura 2A mostra uma imagem obtida após a detecção de hemócitos e células apoptóticas com imunocoloração usando um anticorpo anti-GFP e TUNEL em células embrionárias com srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Enquanto um anticorpo anti-Croquemort mancha pequenos grânulos em células, um anticorpo anti-GFP mancha hemócitos inteiros. Semelhante à Figura 1A , 2 a 6% de células GFP positivas e 1 a 5% de TUNEL positivo As células são observadas em todas as células embrionárias. Algumas células TUNEL-positivas são detectadas dentro de células GFP-positivas, que são consideradas como células mortas fagocitadas. O knockdown mediado por RNAi é facilmente aplicado para avaliar quaisquer genes por seu envolvimento na fagocitose através do cruzamento de moscas com o UAS-dsRNA dos genes candidatos com srpHemo-GAL4UAS-EGFP . O knockdown mediado por RNAi de drpr ou Itgbn reduziu o índice fagocítico ( Figura 2B ), enquanto o número de hemócitos e células apoptóticas em células embrionárias foi comparável ( Figura 2C- 2D ), indicando novamente que esses receptores de fagocitose estão envolvidos na fagocitose de Células apoptóticas. Índices fagocíticos semelhantes são obtidos de ambos os métodos de detecção de hemócitos, sugerindo que ambos são compatíveis.

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Figura 1 : Coloração de células embrionárias por um anticorpo anti-Croquemort e TUNEL. ( A ) Imagens de campo brilhante de células embrionárias dispersas da estirpe w 1118 por imunocoloração com anticorpo anti-Croquemort e TUNEL. As vistas ampliadas de células representativas positivamente ou negativamente manchadas (top 4 painéis) e um campo de baixa potência (painel inferior) são mostrados. Barras de escala, 5 μm (topo); 50 μm (inferior). (B) A proporção de hemócitos Croquemort-positivas com o sinal de TUNEL para todos os hemócitos Croquemort-positivas no drpr ou Itgbn mutante foi analisada com células embrionárias dispersas. (C) A proporção de hemócitos Croquemort-positivos para todas as células na drpr ou Itgbn mutante foi analisada com células embrionárias dispersas. ( D ) A proporção de células apoptóticas TUNEL-positivas para todas as células no drpr ouO mutante de Itgbn foi analisado com células embrionárias dispersas. Genótipos; W 1118 (de tipo selvagem de controlo), drpr Δ5 (drpr mutante), e Itgbn 2 (integrina β ν mutante). Os dados foram representativos de três experimentos independentes e analisados ​​pelo teste t de Student. Aproximadamente 300 hemócitos positivos para Croquemort foram observados em cada experimento e os valores representam a média ± DP de três campos microscópicos. *; P <0,05, ns; Diferença não significativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Coloração de células embrionárias por formigaI-GFP e TUNEL. ( A ) Imagens de campo brilhante de células embrionárias dispersas da estirpe srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + por imunocoloração com anticorpo anti-GFP e TUNEL. As vistas ampliadas de células representativas positivamente ou negativamente manchadas (top 4 painéis) e um campo de baixa potência (painel inferior) são mostrados. Barras de escala = 5 μm (superior); 50 μm (inferior). ( B ) A proporção de hemocitose GFP-positivos com o sinal TUNEL para todos os hemocitose GFP-positivos em moscas knockdown mediadas por RNAi de Drpr ou Itgbn foi analisada com células embrionárias dispersas. ( C ) A proporção de hemocitose GFP-positivas para todas as células em moscas knockdown mediadas por RNAi de Drpr ou Itgbn foi analisada com células embrionárias dispersas. ( D ) A proporção de células apoptóticas TUNEL-positivas para todas as células em moscas knockdown mediadas por RNAi de drpr ou Itgbn foi analisada com células embrionárias dispersas. Genótipos; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Os dados foram representativos de três experimentos independentes e analisados ​​pelo teste t de Student. Aproximadamente 300 hemócitos GFP positivos foram observados em cada experimento e os valores representam a média ± DP de três campos microscópicos. *; P <0,05, ns; Diferença não significativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando embriões de Drosophila . Ao usar células embrionárias dispersas para medir a fagocitose quantitativamente, os hemócitos, os fagócitos profissionais de Drosophila , são imunossincionados para o marcador de hemicíticos Croquemort ou GFP dirigido por srpHemo , e as células apoptóticas são detectadas por TUNEL neste protocolo. O nível de fagocitose é expresso como um índice fagocítico contando o número total de hemócitos e hemocitos fagocitantes. O uso de células embrionárias dispersas nos permite observar todos os fagócitos e células apoptóticas em embriões inteiros e quantificar com precisão o nível de fagocitose. Além disso, nosso método detecta hemicíticos e células apoptóticas com corantes que são observáveis ​​sob um microscópio de luz, não um microscópio de fluorescência. Isso facilita a avaliação dos níveis de fagocitose, pois é possível observar simultaneamente hemócitos e células apoptóticas sem alterar nenhum filtro.

Ve_content "> Os seguintes pontos são críticos para a coloração de células embrionárias. No passo de fixação de células embrionárias, é necessário usar PFA fresco preparado dentro de duas semanas. Na imunocoloração de Croquemort, a incubação de células com anti-Croquemort precisa ser realizada A 4 ° C. Na coloração TUNEL, a incubação de células com DAB deve ser realizada por meio de uma verificação cuidadosa ao microscópio para evitar coloração excessiva. TUNEL visualiza DNA fragmentado detectando 3'-OH, que é abundante em células apoptóticas. No entanto, As células normais também têm 3'-OH no terminal 3 'do DNA, mas a um nível inferior ao das células apoptóticas. Portanto, uma incubação de células com DAB por muito tempo irá manchar não só células apoptóticas, mas também células normais . Recomenda-se a observação das células a cada 15 ou 30 s durante a coloração DAB para evitar isso.

Neste protocolo, embora a quantificação do nível de fagocitose seja rápida e precisa, algumas informações sãoQuando o local de engulfment ou distribuição de hemócitos é perdido. Nós anteriormente mostramos que este ensaio e um teste de fagocitose in situ usando embriões inteiros produziram resultados semelhantes em termos do índice fagocítico 21 . Portanto, recomendamos realizar um teste de fagocitose in situ em paralelo para interpretar com precisão os resultados obtidos em alguns casos.

Drosophila tem outro fagócito profissional, células gliais, no sistema nervoso central. Embora não descrevemos como avaliar a fagocitose de neurônios apoptóticos por células gliais em embriões neste protocolo, o mesmo protocolo é aplicado para quantificar o nível de engulfment como o relatado por Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . Do mesmo modo, este ensaio sugere que células TUNEL positivas em embriões de Drosophila são susceptíveis de serem fagocitadas por fagócitos não profissionais. Fagocitose por esses ph não identificadosOs agocitos com receptores de engulfment desconhecidos podem explicar o resultado ( Figura 1D ) de que o número total de células apoptóticas em células embrionárias parece não ser aumentado em um gene mutante de fagocitose.

Em conclusão, este protocolo conduziu com sucesso à descoberta dos genes necessários para a fagocitose das células apoptóticas por fagócitos profissionais. 24 , 25 , 28 . Com base na conservação evolutiva dos mecanismos moleculares subjacentes à fagocitose 7 , revelar funções genéticas em embriões de Drosophila que envolvem reações de fagocitose complexas podem fornecer informações relevantes sobre a depuração fagocítica de células mortas, o que está relacionado a distúrbios inflamatórios e doenças autoimunes em mamíferos 29 .

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a Kaz Nagaosa e Akiko Shiratsuchi pelo seu conselho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate		 Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 		 Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride		 nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

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References

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Imunologia Edição 126 fagocitose células apoptóticas, Embrião hemócito,
Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões
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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., … More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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