Summary

Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans<em> Drosophila</em> Embryons

Published: August 03, 2017
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Summary

Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d'identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques.

Abstract

Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques doivent être élucidés plus en détail en raison de leur rôle dans les maladies immunitaires et intrathables. Nous avons développé ici une méthode expérimentale pour étudier quantitativement la phagocytose à l'aide de la Drosophila de la mouche des fruits, dans laquelle le réseau de gènes contrôlant les réactions d'absorption est conservé d'évolution des mammifères. Afin de détecter et compter avec précision les phagocytes englobants et non absorbants utilisant des animaux entiers, les embryons de Drosophila ont été homogénéisés pour obtenir des cellules dispersées comprenant des phagocytes et des cellules apoptotiques. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro dans lequel il est possible d'observer tous les phagocytes et cellules apoptotiques dans des embryons entiers et quantifier précisément le niveau de phagocytose. Nous avons confirmé que cette méthode reproduit celles d'études antérieuresQui a identifié les gènes requis pour la phagocytose des cellules apoptotiques. Cette méthode permet d'analyser l'engourdissement des cellules mortes et, combinée à la génétique puissante de Drosophila , révélera les réactions phagocytaires complexes qui composent la migration, la reconnaissance, l'engorgement et la dégradation des cellules apoptotiques par des phagocytes.

Introduction

Dans les animaux métazoaires, par exemple, le nématode Caenorhabditis elegans , la mouche à fruits Drosophila melanogaster , et les souris et les humains, un grand nombre de cellules subissent une apoptose au cours du développement pour façonner leur corps et à l'âge adulte pour maintenir l'homéostasie 1 , 2 . Les cellules apoptotiques doivent être rapidement éliminées car elles induisent une inflammation dans les tissus environnants en libérant des matériaux intracellulaires immunogènes, sinon complètement éliminés 3 . Afin de faciliter l'élimination rapide, les cellules apoptotiques présentent les signaux dits "eat-me" qui sont reconnus par les récepteurs d'engulfment des phagocytes et sont éliminés par phagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Ainsi, la phagocytose joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie de l'hôte et donc, l'élucidation de la molécule Les mécanismes marquants sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques sont importants.

Les mécanismes responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques semblent être conservés d'une manière évolutive chez les espèces des nématodes, des mouches et des souris 7 . Plusieurs tests de phagocytose sont actuellement disponibles pour évaluer l'absorption de cellules apoptotiques dans ces modèles d'animaux. Dans C. elegans , 131 cellules somatiques subissent une mort cellulaire programmée pendant le développement, et les cadavres cellulaires sont phagocytés par des cellules voisines, qui sont des phagocytes non professionnels 8 . Ainsi, le nombre de cadavres de cellules restants dans C. elegans indique le niveau de phagocytose in vivo . En recherchant des mutants de nématodes qui montrent un nombre accru de cellules mortes, plusieurs gènes requis pour la phagocytose ont été identifiés et caractérisés génétiquement 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Des tests de phagocytose ex vivo avec des phagocytes de culture primaire, généralement des macrophages, sont souvent utilisés chez la souris. Les cellules apoptotiques sont préparées en utilisant des lignées cellulaires telles que des cellules Jurkat, et sont mélangées avec des phagocytes primaires. Après une incubation pendant plusieurs heures, le nombre total de phagocytes et de phagocytes engloutis sont comptés afin d'évaluer le niveau de phagocytose. En tant que modification sophistiquée de cette méthode, le groupe de Nagata a développé un test de phagocytose ex vivo avec des cellules exprimant une ICAD résistante aux caspases (inhibiteur de la DNase activée par caspase), dans laquelle les cellules apoptotiques ne subissent pas de fragmentation de l'ADN apoptotique, mais l'ADN est encore clivé lorsque Les cellules sont phagocytées. Lorsque ces cellules sont utilisées comme cibles apoptotiques dans un test de phagocytose, seul l'ADN des cellules apoptotiques englouties est fragmenté et coloré par un marquage de l'extrémité du DUTP médié par TdT (TUNEL). Par conséquent, le niveauL de l'absorption de cellule apoptotique est mesurée en comptant les signaux TUNEL dans un mélange de phagocytes et de cellules apoptotiques 13 .

Dans D. melanogaster , les phagocytes professionnels appelés hémocytes, les macrophages de Drosophila , sont responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques 14 , 15 . En plus des essais de phagocytose in vitro avec des lignées cellulaires de culture, des tests de phagocytose in vivo avec des embryons complets de Drosophila sont disponibles. Les embryons de Drosophila sont un outil puissant pour examiner le niveau d'absorption des cellules apoptotiques car de nombreuses cellules subissent une apoptose et sont phagocytées par des hémocytes pendant le développement embryonnaire 14 , 15 , 16 . Un exemple d'un test de phagocytose in vivo est la méthode développée par le groupe de Franc. Dans leur méthode, les hémocytes sont lesProtégés par l'immunocoloration de la peroxidasine, un marqueur d'hémocyte, des cellules apoptotiques sont colorées en utilisant le colorant nucléaire, la 7-amino actinomycine D dans des embryons de Drosophila entiers, et le nombre de cellules posologiques doubles est considéré comme un signal de phagocytose 17 . Un autre exemple d'un test de phagocytose sur des embryons est basé sur le concept de la méthode de Nagata décrit ci-dessus; Cependant, la phagocytose in vivo est évaluée à l'aide des embryons de DNC ( Drosophila caspase-activase DNase) mutants flies 18 , 19 . Ces tests de phagocytose in vivo sont utiles pour observer directement la phagocytose in situ . Cependant, des difficultés sont associées à exclure tout biais possible dans l'étape de compter les cellules phagocytes car il est difficile d'observer tous les phagocytes et les cellules apoptotiques dans les embryons entiers en raison de leur épaisseur.

Pour surmonter cette limitation, nous développonsUn nouvel essai de phagocytose dans des embryons de Drosophila . Dans notre méthode, afin de compter facilement les hémocytes phagocytants, les embryons entiers sont homogénéisés pour préparer des cellules embryonnaires dispersées. Les phagocytes sont détectés par l'immunocoloration d'un marqueur de phagocytes, et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL avec ces cellules embryonnaires dispersées. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro qui quantifie précisément le niveau de phagocytose. Tous les génotypes de mouches peuvent être utilisés dans ce dosage si elles se développent au stade 16 des embryons 20 , le stade de développement au cours duquel la clairance cellulaire apoptotique par phagocytose est la plus abondante. Cette méthode présente l'avantage d'évaluer quantitativement le niveau de phagocytose et peut donc contribuer à l'identification de nouvelles molécules impliquées dans la phagocytose des cellules apoptotiques in vivo .

Protocol

1. Préparation Préparation de plaques d'agar de jus de raisin frais Ajouter 100 ml d'eau à 4,4 g d'agar et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agar. Ajouter 80 ml de jus de raisin frais, 5 mL d'acide acétique et 5 mL d'éthanol à la solution d'agar. Verser environ 1,5 ml de la solution avec une pipette sur chaque glissière de verre, et la laisser solidifier. Préparation de…

Representative Results

Afin d'examiner la phagocytose des cellules apoptotiques, les embryons de Drosophila du stade de développement 16 ont été recueillis et préparés sous forme de cellules dispersées. Les hémocytes, les macrophages de Drosophila , ont été colorés par immunocytochimie pour le marqueur hémocytaire "Croquemort" 17 , 22 en utilisant un anticorps spécifique 19 ,</sup…

Discussion

Nous avons décrit ici un test de phagocytose en utilisant des embryons de Drosophila . En utilisant des cellules embryonnaires dispersées pour mesurer quantitativement la phagocytose, les hémocytes, les phagocytes professionnels de Drosophila , sont immunostained pour le marqueur de l'hémocyte Croquemort ou le GFP axé sur la MA , et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL dans ce protocole. Le niveau de phagocytose est exprimé sous forme d'indice phagocytaire e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Kaz Nagaosa et Akiko Shiratsuchi pour leurs conseils.

Materials

whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Company Catalog Number Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1

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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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