Her beskrives en fagocytoseanalyse ved bruk av de dispergerte embryonale celler av Drosophila . Det gjør det mulig for oss å enkelt og nøyaktig kvantifisere fagfaktocytosnivåer in vivo , og å identifisere nye molekyler som kreves for fagocytose av apoptotiske celler.
De molekylære mekanismene som ligger til grund for fagocytosen til apoptotiske celler, må bli belyst i større detalj på grunn av sin rolle i immun- og inflammatoriske uopprettelige sykdommer. Her har vi utviklet en eksperimentell metode for å undersøke fagocytose kvantitativt ved bruk av fruktfluen Drosophila , hvor gennettverket som styrer engulferingsreaksjoner, evolusjoneres konservert fra pattedyr. For å nøyaktig oppdage og telle innfylling og unngulfing av fagocytter under anvendelse av hele dyr, ble Drosophila- embryoer homogenisert for å oppnå dispergerte celler, inkludert fagocytter og apoptotiske celler. Bruken av dispergerte embryonceller gjør det mulig for oss å måle in vivo fagocytose nivåer som om vi utførte en in vitro fagocytose-analyse der det er mulig å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer og nøyaktig kvantifisere nivået av fagocytose. Vi bekreftet at denne metoden gjengir dem fra tidligere studierSom identifiserte genene som kreves for fagocytose av apoptotiske celler. Denne metoden tillater at engulfering av døde celler analyseres, og når de kombineres med den kraftige genetikken til Drosophila , vil det avsløre de komplekse fagocytiske reaksjoner som består av migrasjon, anerkjennelse, engulfering og nedbrytning av apoptotiske celler av fagocytter.
I metazoan dyr, for eksempel nematoden Caenorhabditis elegans , fruktflugten Drosophila melanogaster og mus og mennesker, gjennomgår et stort antall celler apoptose under utvikling for å forme kroppene deres og i voksen alder for å opprettholde homøostasis 1 , 2 . Apoptotiske celler må fjernes raskt fordi de induserer betennelse i det omgivende vev ved å frigjøre immunogene intracellulære materialer hvis de ikke er helt fjernet 3 . For å lette rask fjerning presenterer apoptotiske celler såkalte spise-meg-signaler som er anerkjent av engulferingsreceptorene av fagocytter, og elimineres av fagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Fagocytose spiller således en avgjørende rolle i opprettholdelsen av vertshemostasen, og dermed utheve molekylen Lar mekanismer som ligger til grunn for fagocytose av apoptotiske celler er av betydning.
Mekanismene som er ansvarlige for fagocytose av apoptotiske celler, synes å være evolusjonelt konserverte blant arter i nematoder, fluer og mus 7 . Flere fagocytoseanalyser er for tiden tilgjengelige for å vurdere engulfering av apoptotiske celler i disse modelldyrene. I C. elegans gjennomgår 131 somatiske celler programmert celledød under utvikling, og cellekropper blir fagocytosed av nabo-celler, som er ikke-profesjonelle fagocytter 8 . Således teller antall gjenværende cellekropper i C. elegans indikerer nivået av fagocytose in vivo . Ved å lete etter nematode mutanter som viser et økt antall døde celler, har flere gener som kreves for fagocytose blitt identifisert og genetisk karakterisert 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .
Eks vivo fagocytose-analyser med primære kultur fagocytter, vanligvis makrofager, benyttes ofte i mus. Apoptotiske celler fremstilles ved bruk av cellelinjer som Jurkat-celler, og blandes med primære fagocytter. Etter en inkubasjon i flere timer, teller det totale antall fagocytter og engulfing fagocytter for å vurdere nivået av fagocytose. Som en sofistikert modifikasjon av denne metoden utviklet Nagatas gruppe en eks vivo fagocytose-analyse med celler som uttrykker en caspase-resistent ICAD (inhibitor av kaspas-aktivert DNase), hvor apoptotiske celler ikke gjennomgår apoptotisk DNA-fragmentering, men DNA spaltes fortsatt når Celler er fagocytosed. Når disse cellene blir brukt som apoptotiske mål i en fagocytoseanalyse, fragmenteres kun DNA fra engulferte apoptotiske celler og farves med TdT-mediert DUTP nick end-merking (TUNEL). Derfor lever deL av apoptotisk celleoppfylling måles ved å telle TUNEL-signaler i en blanding av fagocytter og apoptotiske celler 13 .
I D. melanogaster er faglige fagocytter som heter hemocytter, Drosophila- makrofager, ansvarlige for fagocytose av apoptotiske celler 14 , 15 . I tillegg til in vitro fagocytose-analyser med kulturcellelinjer er in vivo fagocytose-analyser med hele Drosophila- embryoer tilgjengelige. Drosophila- embryoer er et kraftig verktøy for å undersøke nivået av apoptotisk celleoppfylling fordi mange celler gjennomgår apoptose og fagocytteres av hemocytter under embryonisk utvikling 14 , 15 , 16 . Et eksempel på en in vivo fagocytoseanalyse er metoden utviklet av Francs gruppe. I deres metode er hemocytter deAntistoffert ved immunostaining av peroksidasin, en hemocytmarkør, blir apoptotiske celler farget ved bruk av det nukleære fargestoffet, 7-aminoaktinomycin D i hele Drosophila- embryoer, og antall doble positive celler teller som et signal av fagocytose 17 . Et annet eksempel på en fagocytoseanalyse på embryoer er basert på begrepet Nagatas metode beskrevet ovenfor; Imidlertid evalueres fagocytose in vivo ved bruk av embryoene av dCAD ( Drosophila caspase-aktivert DNase) mutantfluer 18 , 19 . Disse in vivo fagocytose-analysene er nyttige for direkte å observere fagocytose in situ . Imidlertid er vanskeligheter forbundet med å utelukke eventuell forspenning i trinnet med å telle fagocytoserende celler fordi det er vanskelig å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer på grunn av dens tykkelse.
For å overvinne denne begrensningen utvikler viUtgitt en ny fagocytoseanalyse i Drosophila- embryoer. I vår metode, for å enkelt telle fagocytoserende hemocytter, blir hele embryoer homogenisert for å fremstille dispergerte embryonale celler. Fagocytter detekteres ved immunfarging av en fagocytmarkør, og apoptotiske celler påvises av TUNEL med disse dispergerte embryonale celler. Bruken av dispergerte embryonceller gjør det mulig for oss å måle in vivo fagocytose nivåer som om vi utførte en in vitro fagocytoseanalyse som nettopp kvantifiserer nivået av fagocytose. Alle genotyper av fluer kan benyttes i denne analysen hvis de utvikler seg til stadium 16 av embryoer 20 , utviklingsstadiet hvor apoptotisk celleklarering ved fagocytose er den mest omfattende. Denne metoden har fordelen av å vurdere nivået av fagocytose kvantitativt, og kan således bidra til identifisering av nye molekyler involvert i fagocytose av apoptotiske celler in vivo .
Her beskrives en fagocytoseanalyse ved bruk av Drosophila- embryoer. Ved å bruke dispergerte embryonale celler for å måle fagocytose kvantitativt, hemocytter, Drosophila profesjonelle fagocytter, immunostained for hemocytmarkøren Croquemort eller srpHemo- driven GFP, og apoptotiske celler påvises av TUNEL i denne protokollen. Nivået av fagocytose uttrykkes som en fagocytisk indeks ved å telle totalt antall hemocytter og fagocytoserende hemocytter. Bruken av dispergerte embryonale …
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Kaz Nagaosa og Akiko Shiratsuchi for deres råd.
whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
Table of Fly Strains | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |