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Immunology and Infection

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

Abstract

Die molekularen Mechanismen, die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, müssen aufgrund ihrer Rolle bei immunen und entzündlichen, nicht beherrschbaren Krankheiten genauer aufgeklärt werden. Wir haben hier eine experimentelle Methode entwickelt, um die Phagozytose quantitativ unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila zu untersuchen , bei der das Gennetz, das die Verschlingungsreaktionen kontrolliert, evolutionär von Säugetieren konserviert wird. Um die Phagozyten mit ganzen Tieren genau zu erfassen und zu zerlegen, wurden Drosophila- Embryos homogenisiert, um dispergierte Zellen einschließlich Phagozyten und apoptotischen Zellen zu erhalten. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay durchgeführt haben, in dem es möglich ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen zu beobachten und genau das Niveau der Phagozytose zu quantifizieren. Wir bestätigten, dass diese Methode die früheren Studien wiedergibtDie die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen benötigten Gene identifizierten. Diese Methode erlaubt es, die Verschlüsselung von toten Zellen zu analysieren und in Kombination mit der mächtigen Genetik von Drosophila die komplexen phagozytischen Reaktionen aufzudecken, die die Migration, die Erkennung, die Verschlußung und den Abbau von apoptotischen Zellen durch Phagozyten umfassen.

Introduction

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In Metazoan-Tieren, z. B. die Nematoden Caenorhabditis elegans , die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und Mäuse und Menschen, eine große Anzahl von Zellen unterziehen Apoptose während der Entwicklung, um ihre Körper und im Erwachsenenalter zu pflegen Homöostase 1 , 2 . Apoptotische Zellen müssen schnell entfernt werden, weil sie eine Entzündung in den umliegenden Geweben durch Freisetzung von immunogenen intrazellulären Materialien induzieren, wenn sie nicht vollständig entfernt werden 3 . Um die schnelle Entfernung zu erleichtern, stellen apoptotische Zellen so genannte eat-me-Signale dar, die von den Engulfierungsrezeptoren von Phagozyten erkannt werden und durch Phagozytose 3 , 4 , 5 , 6 eliminiert werden. So spielt die Phagozytose eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Wirtshomöostase und damit der Aufklärung des Moleküls Die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, ist von Bedeutung.

Die Mechanismen , die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erscheinen evolutionär zwischen den Arten in den Nematoden, Fliegen und Mäuse 7 konserviert werden. Mehrere Phagozytose-Assays sind derzeit verfügbar, um die Verschlußung von apoptotischen Zellen in diesen Modelltieren zu beurteilen. In C. elegans werden 131 somatische Zellen während der Entwicklung einem programmierten Zelltod unterzogen, und Zellkerzen werden durch benachbarte Zellen phagozytiert, die nicht professionelle Phagozyten sind 8 . So zeigt das Zählen der Anzahl der verbleibenden Zellleichen in C. elegans den Grad der Phagozytose in vivo an . Durch die Suche nach Nematoden-Mutanten, die eine erhöhte Anzahl von toten Zellen zeigen, wurden mehrere für die Phagozytose benötigte Gene identifiziert und genetisch charakterisiert 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Ex-vivo- Phagozytose-Assays mit Primärkultur-Phagozyten, im allgemeinen Makrophagen, werden häufig bei Mäusen verwendet. Apoptotische Zellen werden unter Verwendung von Zelllinien wie Jurkat-Zellen hergestellt und mit primären Phagozyten vermischt. Nach einer Inkubation für mehrere Stunden werden die Gesamtzahl der Phagozyten und Verschlingungsphagozyten gezählt, um den Grad der Phagozytose zu bestimmen. Als eine ausgeklügelte Modifikation dieser Methode entwickelte die Nagata-Gruppe einen Ex-vivo- Phagozytose-Assay mit Zellen, die ein Caspase-resistentes ICAD (Inhibitor von Caspase-aktivierter DNase) exprimieren, bei dem apoptotische Zellen keine apoptotische DNA-Fragmentierung erfahren, aber die DNA wird immer noch gespalten Zellen sind phagozytiert. Wenn diese Zellen als apoptotische Targets in einem Phagozytose-Assay verwendet werden, wird nur die DNA von verschlungenen apoptotischen Zellen fragmentiert und durch TdT-vermittelte DUTP-Nick-Etikettierung (TUNEL) gefärbt. Also die leveL des apoptotischen Zellverschlusses wird durch Zählen von TUNEL-Signalen in einer Mischung von Phagozyten und apoptotischen Zellen gemessen 13 .

In D. melanogaster sind professionelle Phagozyten namens Hämocyten, Drosophila Makrophagen, verantwortlich für die Phagozytose von apoptotischen Zellen 14 , 15 . Zusätzlich zu in vitro Phagozytose-Assays mit Kulturzelllinien sind in vivo Phagozytose-Assays mit ganzen Drosophila- Embryonen verfügbar. Drosophila- Embryos sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Niveau der apoptotischen Zellverschlüsselung zu untersuchen, da viele Zellen einer Apoptose unterliegen und durch die Hämocyten während der embryonalen Entwicklung phagozytiert werden 14 , 15 , 16 . Ein Beispiel für einen in vivo Phagozytose-Assay ist die Methode, die von der Gruppe des Franc entwickelt wurde. In ihrer Methode sind die Hämocyten deDurch die Immunfärbung von Peroxidasin, einem Hämozytenmarker, werden die apoptotischen Zellen unter Verwendung des Kernfarbstoffs 7-Aminoaktinomycin D in ganzen Drosophila- Embryonen gefärbt, und die Anzahl der doppelten positiven Zellen wird als ein Signal der Phagozytose 17 gezählt . Ein weiteres Beispiel für einen Phagozytose-Assay auf Embryonen basiert auf dem oben beschriebenen Konzept der Nagata-Methode; In vivo wird jedoch die Phagozytose unter Verwendung der Embryonen von dCAD ( Drosophila caspase-aktivierten DNase) Mutantenfliegen 18 , 19 ausgewertet. Diese in vivo Phagozytose-Assays sind nützlich für die direkte Beobachtung der Phagozytose in situ . Allerdings sind Schwierigkeiten mit dem Ausschluss irgendeiner möglichen Vorspannung in dem Schritt des Zählens von Phagozytosierungszellen verbunden, da es schwierig ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen aufgrund ihrer Dicke zu beobachten.

Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickeln wirEinen neuen Phagozytose-Assay in Drosophila- Embryonen. In unserer Methode, um leicht phagozytierende Hämocyten zu zählen, werden ganze Embryos homogenisiert, um dispergierte embryonale Zellen herzustellen. Phagozyten werden durch die Immunfärbung eines Phagozytenmarkers nachgewiesen und apoptotische Zellen werden von TUNEL mit diesen dispergierten embryonalen Zellen nachgewiesen. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay, dass genau quantifiziert das Niveau der Phagozytose durchgeführt. Alle Genotypen von Fliegen können in diesem Assay angewendet werden, wenn sie sich auf Stufe 16 der Embryos 20 entwickeln , die Entwicklungsstufe, bei der die apoptotische Zellabtrennung durch Phagozytose am häufigsten ist. Diese Methode hat den Vorteil, den Grad der Phagozytose quantitativ zu beurteilen und kann somit zur Identifizierung neuer Moleküle beitragen, die an der Phagozytose von apoptotischen Zellen in vivo beteiligt sind .

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Protocol

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1. Vorbereitung

  1. Vorbereitung von frischen Traubensaft-Agarplatten
    1. 100 ml Wasser zu 4,4 g Agar geben und die Mischung in einem Mikrowellenofen erhitzen, um Agar aufzulösen.
    2. Füge 80 ml frischen Traubensaft, 5 ml Essigsäure und 5 ml Ethanol zu Agar-Lösung hinzu.
    3. Gießen Sie ca. 1,5 mL der Lösung mit einer Pipette auf jede Glasrutsche und lassen Sie sie verfestigen.
  2. Vorbereitung von 6 cm Schalen-Agarose-Platten
    1. Füge 50 ml Wasser zu 0,5 g Agarose hinzu und erhitze die Mischung in einem Mikrowellenofen, um Agarose aufzulösen.
    2. Gießen Sie ca. 2,5 ml Agarose-Lösung auf eine 6 cm Schale mit einer Pipette.

2. Stage 16 Embryo-Sammlung

  1. Sammeln Sie erwachsene Fliegen und fügen Sie 200 Frauen und 200 Männer in eine 50 ml konische Röhre.
  2. Setzen Sie einen Teller mit frischem Traubensaft-Agar auf Hefe in die 50-ml-Röhre und schließen Sie mit einem Schwamm caP.
  3. Inkubieren Sie die Fliegen bei 16 ° C im Licht für 2 - 3 Tage. Ändern Sie die Platte einmal pro Tag.
  4. Die Fliegen bei 25 ° C für 1 h zur Dunkelheit bringen.
  5. Ändern Sie die alte Platte zu einem neuen ohne Hefe. Lassen Sie Fliegen Eier für 2 Stunden legen.
  6. Sammeln Sie die Platte und inkubieren bei 16 ° C für 26 h.
  7. Sammle Embryos aus der Platte mit einem Pinsel in 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100.
  8. Waschen Sie Embryos zweimal mit 1 ml PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100.
  9. Um das Chorion zu entfernen, füge 1,2 mL Natriumhypochloritlösung (2,2 - 3,4% Cl) zu Embryonen für 3 min hinzu.
  10. Waschen Sie Embryos 4 mal mit 1 ml PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100.
  11. Legen Sie Embryonen auf 6-cm-Schalen-Agarose-Platten. Hebe die Embryonen der Stufe 16 unter einem Mikroskop auf, wie von Roberts 20 beschrieben . Sammle etwa 50 Embryos in einem 1,5-mL Treff Mikro-Reagenzglas mit einer Mikropipette.

3. PrepaRation von embryonalen Zellen

  1. Waschen Sie Embryos zweimal mit 150 μl PBS.
  2. Homogenisieren Sie Embryos 30 Mal in einem 1,5 mL Mikro-Teströhrchen und Pellet-Mischer in Gegenwart von 200 & mgr; l Collagenase (0,25% (w / v)) in PBS.
  3. Embryonale Zellen durch 10-minütiges Pipettieren dispergieren und die Zellsuspension auf ein 1,5 mL-Röhrchen bewegen. Inkubieren von Zellen bei 37 ° C für 1 min in einem Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  4. Füge 800 μl PBS zur Zellsuspension hinzu und zentrifugiere bei 1400 x g bei 4 ° C für 5 min.
  5. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl Trypsin (0,25% (w / v)) in PBS zu den Zellen hinzu. Embryonale Zellen durch mehrmaliges Pipettieren empergieren.
  6. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 70 μm Zell-Sieb.
  7. Um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, füge 40 μl hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum zu der filtrierten Zellsuspension hinzu. Füge 800 μl PBS zu und zentrifugiere bei 1.400 x g bei 4 ° C für 5 min.
  8. Entfernen Sie die Supernatant, suspendieren für 5 min - Zellen in 200 ul PBS und Zentrifugation bei 1400 x g bei 4 ° C ausgefällt.
  9. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ausgefällte Zellen in 30 μl PBS.
  10. Montieren Sie die vorbereitete Zellsuspension auf Aminopropyltriethoxysilan-beschichteten Glasscheiben und warten Sie 10 - 15 min, bis die Zellen an den Glasscheiben anhaften.
  11. Entfernen Sie die restliche Lösung auf den Glasscheiben mit einer Pipette. Montieren Sie 60 - 70 μl PBS mit 4% (w / v) PFA (Paraformaldehyd) auf Zellen für 10 - 15 min zur Fixierung.
  12. Entfernen Sie die Fixierlösung und legen Sie Glasscheiben in PBS für mehr als 1 min.

4. Färbung von Hämozyten

  1. Immunfärbung mit einem Anti-Croquemort-Antikörper
    1. Die Glasscheiben in 10 Minuten in Methanol gießen, in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und dann in PBS für 10 min.
    2. 20 μl 5% (v / v) vollständiges Schweine-Serum in PBS enthaltenNg 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min.
    3. Entfernen Sie die Lösung aus Glasscheiben und montieren Sie 20 μl Anti-Croquemort-Antiserum 19 , 21 (0,1% (v / v)) in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 4 ° C über Nacht.
    4. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    5. Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen.
    6. Mischen Sie 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Ratten-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) ganzes Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde.
    7. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    8. Einweichen von Glasrutschen in Puffer, enthaltend 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min.
    9. Mount-Phosphatase-Substratlösung, enthaltend 0,23 mg / ml 5-Brom-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP), 0,35 mg / ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 auf Zellen.
    10. Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn starke lila Signale in den Granulaten der Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Glasscheiben in Puffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Färbung für ca. 5 - 10 min wird empfohlen.
  2. Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper (eine weitere Option zur Färbung von Hämocyten)
    1. Manche Glasscheiben in Methanol für 10 min einwirken lassen, PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min und PBS für 10 min.
    2. 20 μl von 5% (v / v) Gesamtschweine-Serum in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zum Blockieren auftragen. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur für 20 min.
    3. Entfernen Sie die Lösung auf Glasplättchen und montieren Sie 20 μl des Maus-Anti-GFP-Antikörpers (1% (v / v)) / PBS c0,2% (v / v) Triton X-100 auf Zellen zu erhalten. Inkubieren von Objektträgern bei Raumtemperatur über Nacht.
    4. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    5. Glasscheiben in PBS für 10 min einweichen.
    6. 20 μl alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Maus-IgG (0,5% (v / v)) in PBS, enthaltend 0,2% (v / v) Triton X-100 und 5% (v / v) Gesamt-Schweine-Serum auf Zellen im Raum Temperatur für 1 Stunde.
    7. Glasscheiben in PBS mit 0,2% (v / v) Triton X-100 für 10 min 5 mal einweichen.
    8. Einweichen von Glasrutschen in Puffer bestehend aus 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 für 10 min.
    9. Montieren Sie die Phosphatase-Substratlösung, die 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl und 50 mM MgCl 2 enthält.
    10. Beobachten Sie Zellen unter einem Mikroskop für die richtige Färbung. Wenn lila Signale in ganzen Hämocyten auftreten, entfernen Sie die Substratlösung und tränken Sie Folien in Puffer, bestehend ausVon 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 und 1 mM EDTA. Die Färbung für ca. 10 - 15 min wird empfohlen.

5. Fleck apoptotische Zellen von TUNEL

  1. Glasscheiben in PBS für 5 min einweichen.
  2. Wiederholen Sie mit neuem PBS.
  3. Mount Equilibration Puffer (siehe Material Tabelle) auf Zellen für 10 min.
  4. Entfernen Sie die Lösung aus Glasplättchen und montieren Sie 20 & mgr; l TdT-Lösung, die 5 & mgr; l endständige Deoxynukleotidyltransferase und 15 & mgr; l Reaktionspuffer auf Zellen bei 37 ° C für 1 h enthält.
  5. Die Lösung aus den Glasscheiben entfernen und die Objektträger in Puffer aus 0,5 ml STOP / Waschpuffer und 17 ml Wasser einweichen.
  6. Läuft in PBS für 5 min 3 mal ein.
  7. 20 μl Anti-Digoxigenin-Peroxidase auf Zellen bei Raumtemperatur für 30 min auftragen.
  8. Glasscheiben in PBS für 5 min 4 mal einweichen.
  9. Einweichen von Glasscheiben in Peroxidase-Substratlösung, bestehend aus 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthaltendGa vollständiger Mikrospatel aus 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrichlorid (DAB) und 0,002% (v / v) H 2 O 2 für 30 s.
  10. Wiederholen Sie Schritt 5.9, bis apoptotische Zellen braun gefärbt sind. Einweichen Glas gleitet in Wasser, um die Peroxidase-Reaktion zu stoppen.
  11. Enthält Zellen mit Wasser zur Beobachtung.

6. Messen Sie den Grad der Phagozytose von apoptotischen Zellen

  1. Beobachten Sie Proben unter einem Lichtmikroskop, um das Niveau der Phagozytose zu beurteilen. Graf Croquemort-positive Zellen oder GFP-positive Zellen als Hämocyten, TUNEL-positive Zellen als apoptotische Zellen und doppelte positive Zellen als phagozytierende Hämocyten.
  2. Der phagozytische Index ist definiert als die Anzahl der doppelten positiven Zellen zur Gesamtzahl der Croquemort-positiven Zellen oder GFP-positiven Zellen. Es wird empfohlen, dass mehr als 300 Hämocyten beobachtet werden.

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Representative Results

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Um die Phagozytose von apoptotischen Zellen zu untersuchen, wurden Drosophila- Embryos der Entwicklungsstufe 16 gesammelt und als dispergierte Zellen hergestellt. Hemocyten, Drosophila- Makrophagen wurden durch Immunzytochemie für den Hämocytenmarker "Croquemort" 17 , 22 unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers 19 , 21 gefärbt und apoptotische Zellen wurden durch TUNEL in dispergierten embryonalen Zellen gefärbt ( 1A ). Croquemort, ein Drosophila- CD36-verwandter Rezeptor, wird spezifisch auf alle embryonalen Hämocyten 22 exprimiert und wurde genetisch in die Clearance von apoptotischen Zellen in Drosophila- Embryos 17 eingebunden. Croquemort-positive Zellen haben violette Signale in den kleinen Körnern ihrer Zellen. TUNEL-positive Zellen zeigen abWurzelsignal in ganzen Korpusen. TUNEL-positive Zellen sind kleiner als andere Zellen, und einige sind innerhalb von Croquemort-positiven Zellen, die als phagozytierte tote Zellen gelten. Zwischen 2 und 10% werden Croquemort-positive Zellen und 1 - 5% TUNEL-positive Zellen normalerweise in allen embryonalen Zellen beobachtet.

In Drosophila gibt es zwei Signalwege für die Verschlußung von apoptotischen Zellen. Zwei Phagozytose-Rezeptoren für die entsprechenden Pfade, Draper und Integrin α PS3 β ν, erkennen unabhängig tote Zellen 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper ist ein Transmembranprotein, das atypische epidermale Wachstumsfaktor (EGF) -ähnliche Sequenzen im extrazellulären Bereich und die beiden phosphorylierbaren Motive NPxY und YxxL im i besitztNtrazellulären Teil 26 . Integrin α PS3 β ν ist auch ein Transmembranrezeptor, bestehend aus einem Heterodimer von α- und β- Untereinheiten 25 . Fig. 1B zeigt das Verhältnis von phagozytierenden Hämocyten zu Gesamt-Hämocyten in Wildtyp- oder Drpr- oder Itgbn-Einzelmutanten- Embryonen. Durch die Zählung aller Croquemort-positiven Zellen (Gesamt-Hämocyten) und Croquemort- und TUNEL-doppelten positiven Zellen (phagozytierende Hämocyten) berechneten wir den phagozytischen Index als die Anzahl der phagozytierenden Hämocyten an die Gesamtzahl der Hämocyten. Der phagozytische Index war in der drpr- oder Itgbn- Mutante niedriger als im Wildtyp, während die Anzahl der Hämocyten und apoptotischen Zellen ähnlich war ( Abbildung 1C- D ), was darauf hinweist, dass diese beiden Gene für die apoptotische Zellverschleierung erforderlich sind, wie bisher rExportiert

Wenn ein Anti-Croquemort-Antikörper nicht verfügbar ist oder mutierte Linien mit veränderter Croquemort-Expression untersucht werden, müssen wir eine andere Option auswählen, um Hämocyten zu detektieren. Embryonen mit einem von einem Hämozytenspezifischen Promotor ( srpHemo-GAL4 ) kontrollierten GAL4-Treiber und dem von einer Upstream-Aktivierungssequenz (UAS) einschließlich der GAL4-Bindungsstelle ( UAS-EGFP ) kontrollierten GFP-Gen haben GFP-markierte Hämocyten 27 , Die es uns ermöglicht, Hämocyten mit anti-GFP zu detektieren. Fig. 2A zeigt ein Bild, das nach dem Nachweis von Hämocyten und apoptotischen Zellen mit Immunfärbung unter Verwendung eines Anti-GFP-Antikörpers und TUNEL in embryonalen Zellen mit srpHemo-GAL4UAS-EGFP erhalten wurde . Während ein Anti-Croquemort-Antikörper kleine Körner in Zellen färbt, färbt ein Anti-GFP-Antikörper ganze Hämocyten. Ähnlich wie bei Abbildung 1A , 2 - 6% GFP-positiven Zellen und 1 - 5% TUNEL-positiv Zellen werden in allen embryonalen Zellen beobachtet. Einige TUNEL-positive Zellen werden innerhalb von GFP-positiven Zellen nachgewiesen, die als phagozytierte tote Zellen gelten. RNAi-vermittelter Knockdown ist leicht angewendet, um alle Gene für ihre Beteiligung an der Phagozytose zu beurteilen, indem sie Fliegen mit der UAS-dsRNA der Kandidatengene mit srpHemo-GAL4UAS-EGFP überqueren . Der RNAi-vermittelte Knockdown von drpr oder Itgbn reduzierte den phagozytischen Index ( Abbildung 2B ), während die Anzahl der Hämocyten und apoptotischen Zellen in embryonalen Zellen vergleichbar war ( Abbildung 2C -2D ), was darauf hinweist, dass diese Phagozytose-Rezeptoren an der Phagozytose beteiligt sind Apoptotische Zellen. Ähnliche phagozytische Indizes werden aus beiden Hämocyten-Nachweisverfahren erhalten, was darauf hindeutet, dass beide kompatibel sind.

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Abbildung 1 : Färbung von embryonalen Zellen durch einen Anti-Croquemort-Antikörper und TUNEL. ( A ) Helle Feldbilder von dispergierten embryonalen Zellen aus dem w 1118- Stamm durch Immunfärbung mit einem Anti-Croquemort-Antikörper und TUNEL. Vergrößerte Ansichten von repräsentativen positiv oder negativ gefärbten Zellen (Top 4 Panels) und einem Low-Power-Feld (Bodenplatte) werden gezeigt. Maßstäbe, 5 μm (oben); 50 μm (unten). ( B ) Das Verhältnis von Croquemort-positiven Hämocyten mit dem TUNEL-Signal zu allen Croquemort-positiven Hämocyten in der drpr- oder Itgbn- Mutante wurde mit dispergierten embryonalen Zellen analysiert. ( C ) Das Verhältnis von Croquemort-positiven Hämocyten zu allen Zellen in der drpr- oder Itgbn- Mutante wurde mit dispergierten embryonalen Zellen analysiert. ( D ) Das Verhältnis von TUNEL-positiven apoptotischen Zellen zu allen Zellen im Drpr oderItgbn- Mutante wurde mit dispergierten embryonalen Zellen analysiert. Genotypen; W 1118 (Wildtyp-Kontrolle), drpr Δ5 ( drpr- Mutante) und Itgbn 2 (Integrin β ν-Mutante). Daten waren repräsentativ für drei unabhängige Experimente und analysiert durch den Student's t- test. In jedem Experiment wurden etwa 300 Croquemort-positive Hämocyten beobachtet, und Werte repräsentieren den Mittelwert ± SD von drei mikroskopischen Feldern. *; P <0,05, ns; Unterschied nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Färbung der embryonalen Zellen durch AntI-GFP und TUNEL. ( A ) Helle Feldbilder von dispergierten embryonalen Zellen aus dem srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + -Stamm durch Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper und TUNEL. Vergrößerte Ansichten von repräsentativen positiv oder negativ gefärbten Zellen (Top 4 Panels) und einem Low-Power-Feld (Bodenplatte) werden gezeigt. Maßstäbe = 5 μm (oben); 50 μm (unten). ( B ) Das Verhältnis von GFP-positiven Hämocyten mit dem TUNEL-Signal zu allen GFP-positiven Hämocyten in RNAi-vermittelten Knockdownfliegen von drpr oder Itgbn wurde mit dispergierten embryonalen Zellen analysiert. ( C ) Das Verhältnis von GFP-positiven Hämocyten zu allen Zellen in RNAi-vermittelten Knockdownfliegen von drpr oder Itgbn wurde mit dispergierten embryonalen Zellen analysiert. ( D ) Das Verhältnis von TUNEL-positiven apoptotischen Zellen zu allen Zellen in RNAi-vermittelten Knockdown-Fliegen von drpr oder Itgbn wurde mit dispergierten embryonalen Zellen analysiert. Genotypen; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Daten waren repräsentativ für drei unabhängige Experimente und analysiert durch den Student's t- test. Etwa 300 GFP-positive Hämocyten wurden in jedem Experiment beobachtet, und Werte repräsentieren den Mittelwert ± SD von drei mikroskopischen Feldern. *; P <0,05, ns; Unterschied nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Wir haben hierin einen Phagozytose-Assay unter Verwendung von Drosophila- Embryonen beschrieben. Durch die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen zur quantitativen Messung der Phagozytose werden Hämocyten, Drosophila- Profi-Phagozyten für den Hämocytenmarker Croquemort oder srpHemo- getriebenen GFP immunostainiert und apoptotische Zellen werden von TUNEL in diesem Protokoll nachgewiesen. Der Grad der Phagozytose wird als phagozytischer Index ausgedrückt, indem die Gesamtzahl der Hämocyten und phagozytisierenden Hämocyten gezählt wird. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen zu beobachten und den Grad der Phagozytose präzise zu quantifizieren. Darüber hinaus erkennt unsere Methode Hämocyten und apoptotische Zellen mit Farbstoffen, die unter einem Lichtmikroskop beobachtbar sind, kein Fluoreszenzmikroskop. Dies erleichtert die Beurteilung der Phagozytose, da es möglich ist, Hämocyten und apoptotische Zellen gleichzeitig zu beobachten, ohne jeglichen Filter zu verändern.

Ve_content "> Die folgenden Punkte sind entscheidend für die Färbung von embryonalen Zellen. Im Fixierungsschritt der embryonalen Zellen muss frisches PFA, das innerhalb von zwei Wochen hergestellt wird, verwendet werden. Bei der Immunfärbung von Croquemort muss die Inkubation von Zellen mit Anti-Croquemort durchgeführt werden Bei 4 ° C In der TUNEL-Färbung muss die Inkubation von Zellen mit DAB durch sorgfältiges Prüfen unter einem Mikroskop durchgeführt werden, um eine übermäßige Färbung zu vermeiden. TUNEL visualisiert die fragmentierte DNA durch Detektion von 3'-OH, das in apoptotischen Zellen reichlich vorhanden ist. Normale Zellen haben auch 3'-OH im 3'-terminalen DNA, aber auf einem niedrigeren Niveau als in apoptotischen Zellen. Daher wird eine Inkubation von Zellen mit DAB zu lange nicht nur apoptotische Zellen, sondern auch normale Zellen färben Die Beobachtung der Zellen alle 15 oder 30 s während der DAB-Färbung wird empfohlen, dies zu verhindern.

In diesem Protokoll, obwohl Quantifizierung der Ebene der Phagozytose ist schnell und präzise, ​​einige Informationen suCh als die Stelle der Verschlüsselung oder Verteilung der Hämocyten verloren geht. Wir haben zuvor gezeigt, dass dieser Assay und ein in situ Phagozytose-Assay mit ganzen Embryonen ähnliche Ergebnisse in Bezug auf den phagozytischen Index 21 hervorgebracht haben . Daher empfehlen wir die Durchführung eines in situ Phagozytose-Assays parallel, um die in einigen Fällen erhaltenen Ergebnisse genau zu interpretieren.

Drosophila hat einen anderen professionellen Phagozyten, Gliazellen, im zentralen Nervensystem. Obwohl wir nicht beschreiben, wie die Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Gliazellen in Embryonen in diesem Protokoll zu beurteilen, wird das gleiche Protokoll angewendet, um das Niveau der Verschlüsselung zu quantifizieren, wie es von Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . Ebenso deutet dieser Assay darauf hin, dass TUNEL-positive Zellen in Drosophila- Embryonen wahrscheinlich von nicht-professionellen Phagozyten phagozytiert werden. Phagozytose durch die nicht identifizierten phAgozyten mit unbekannten Engulfment-Rezeptoren könnte das Ergebnis erklären ( Abbildung 1D ), dass die Gesamtzahl der apoptotischen Zellen in embryonalen Zellen in einer Phagozytose-Gen-Mutante nicht zu erhöhen scheint.

Abschließend hat dieses Protokoll erfolgreich zur Entdeckung von Genen geführt, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch professionelle Phagozyten erforderlich sind. 24 , 25 , 28 Auf der Grundlage der evolutionären Konservierung der molekularen Mechanismen , die die Phagozytose 7, Genfunktionen in Drosophila - Embryo zeigt , dass komplexe Phagozytose Reaktionen beinhalten kann sinnvolle Einblicke in die phagozytischen Clearance von abgestorbenen Zellen bereitzustellen, die 29 bis entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunkrankheiten in Säugern in Beziehung steht.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken Kaz Nagaosa und Akiko Shiratsuchi für ihren Rat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

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References

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Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen
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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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