Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotiske Celler i doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Heri beskrives et fagocytose assay under anvendelse af de dispergerede embryonale celler af Drosophila . Det sætter os i stand til nemt og præcist at kvantificere phagocytose niveauer in vivo og at identificere nye molekyler, der er nødvendige for phagocytose af apoptotiske celler.

Abstract

De molekylære mekanismer, der ligger til grund for phagocytosen af ​​apoptotiske celler, skal præciseres mere detaljeret på grund af dets rolle i immune og inflammatoriske, uoprettelige sygdomme. Her har vi udviklet en eksperimentel metode til undersøgelse af fagocytose kvantitativt ved anvendelse af frugtflyve Drosophila , hvor gennetværket , der styrer engulferingsreaktioner, evolutionelt konserveres fra pattedyr. For at nøjagtigt detektere og tælle engulfing og un-engulfing fagocytter under anvendelse af hele dyr, blev Drosophila embryoner homogeniseret for at opnå dispergerede celler, herunder phagocytter og apoptotiske celler. Anvendelsen af ​​dispergerede embryonale celler gør det muligt for os at måle in vivo fagocytose niveauer som om vi udførte et in vitro fagocytose assay, hvor det er muligt at observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoner og præcist kvantificere niveauet af fagocytose. Vi bekræftede, at denne metode gengiver de tidligere studierDer identificerede de gener, der kræves til fagocytose af apoptotiske celler. Denne metode gør det muligt at analysere opbrydning af døde celler, og når de kombineres med Drosophila 's kraftige genetik, vil de afsløre de komplekse fagocytiske reaktioner, der består af migration, genkendelse, opfangning og nedbrydning af apoptotiske celler af fagocytter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I metazoan dyr, f.eks. Nematoden Caenorhabditis elegans , frugtflyve Drosophila melanogaster og mus og mennesker, gennemgår et stort antal celler apoptose under udvikling for at forme deres kroppe og i voksenalderen for at opretholde homeostase 1 , 2 . Apoptotiske celler skal fjernes hurtigt, fordi de inducerer inflammation i det omgivende væv ved at frigive immunogene intracellulære materialer, hvis de ikke fjernes fuldstændigt 3 . For at lette hurtig fjernelse frembyder apoptotiske celler såkaldte eat-me-signaler, som genkendes af engulferingsreceptorerne af fagocytter, og elimineres af phagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Fagocytose spiller således en afgørende rolle i vedligeholdelsen af ​​værtshomeostase og dermed elucidere molekylet Lar mekanismer, der ligger til grund for fagocytose af apoptotiske celler, er vigtige.

Mekanismerne ansvarlige for phagocytose af apoptotiske celler synes at være evolutionelt konserveret blandt arter i nematoder, fluer og mus 7 . Adskillige fagocytose-analyser er i øjeblikket tilgængelige for at vurdere opfangningen af ​​apoptotiske celler i disse modeldyr. I C. elegans undergår 131 somatiske celler programmeret celledød under udvikling, og cellekroppe er fagocytosed af naboceller, som er ikke-faglige fagocytter 8 . Således tæller antallet af resterende cellekroppe i C. elegans angiver niveauet af fagocytose in vivo . Ved at søge efter nematode mutanter, der viser et forøget antal døde celler, er der blevet identificeret flere gener for phagocytose og genetisk karakteriseret 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Eks vivo fagocytose assays med primære kultur fagocytter, generelt makrofager, anvendes ofte i mus. Apoptotiske celler fremstilles under anvendelse af cellelinjer, såsom Jurkat-celler, og blandes med primære fagocytter. Efter en inkubation i flere timer tælles det totale antal fagocytter og engulfing fagocytter for at vurdere niveauet af fagocytose. Som en sofistikeret modifikation af denne metode udviklede Nagatas gruppe et eks vivo fagocytose assay med celler, der udtrykker en caspase-resistent ICAD (inhibitor af caspaseaktiveret DNase), hvor apoptotiske celler ikke undergår apoptotisk DNA-fragmentering, men DNA spaltes stadig når Celler er phagocytosed. Når disse celler anvendes som apoptotiske mål i et fagocytose assay, fragmenteres kun DNA'et af engulferede apoptotiske celler og farves med TdT-medieret DUTP nick end-mærkning (TUNEL). Derfor lever deL af apoptotisk celle-engulfering måles ved at tælle TUNEL-signaler i en blanding af phagocytter og apoptotiske celler 13 .

I D. melanogaster er faglige fagocytter, der hedder hæmocytter, Drosophila- makrofager, ansvarlige for fagocytosen af ​​apoptotiske celler 14 , 15 . Ud over in vitro fagocytose-assays med kulturcellelinier er in vivo fagocytose-analyser med hele Drosophila- embryoner tilgængelige. Drosophila embryoner er et kraftfuldt redskab til at undersøge niveauet af apoptotisk celleopfyldning, fordi mange celler gennemgår apoptose og fagocytteres af hæmocytter under embryonisk udvikling 14 , 15 , 16 . Et eksempel på et in vivo fagocytose assay er metoden udviklet af Francs gruppe. I deres metode er hæmocytter deBeskadiget ved immunostaining af peroxidasin, en hæmocytmarkør, farves apoptotiske celler under anvendelse af det nukleare farvestof, 7-amino-actinomycin D i hele Drosophila- embryoner, og antallet af dobbelt positive celler tælles som et signal af fagocytose 17 . Et andet eksempel på et fagocytose-assay på embryoner er baseret på begrebet Nagatas metode beskrevet ovenfor; Imidlertid evalueres fagocytose in vivo under anvendelse af embryonerne af dCAD ( Drosophila caspase-aktiverede DNase) mutant fluer 18 , 19 . Disse in vivo fagocytose-assays er nyttige til direkte observation af fagocytose in situ . Vanskeligheder er imidlertid forbundet med at udelukke enhver mulig forspænding i trinnet med at tælle fagocytoseceller, fordi det er svært at observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoner på grund af dens tykkelse.

For at overvinde denne begrænsning udvikler viUdarbejdet et nyt fagocytose assay i Drosophila embryoner. I vores metode homogeniseres hele embryoner for at fremstille dispergerede embryonale celler for nemt at tælle fagocytoserende hæmocytter. Phagocytter detekteres ved immunforaining af en fagocytmarkør, og apoptotiske celler påvises af TUNEL med disse dispergerede embryonale celler. Anvendelsen af ​​dispergerede embryonale celler gør det muligt for os at måle in vivo fagocytose niveauer som om vi udførte et in vitro fagocytose assay, der præcist kvantificerer niveauet af fagocytose. Alle genotyper af fluer kan anvendes i dette assay, hvis de udvikler sig til stadium 16 af embryoner 20 , udviklingsstadiet, hvor apoptotisk celleklaration ved phagocytose er den mest rigelige. Denne metode har den fordel at kvantificere niveauet af phagocytose kvantitativt og kan således bidrage til identifikationen af ​​nye molekyler involveret i phagocytose af apoptotiske celler in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling

  1. Fremstilling af friske druesaft-agarplader
    1. Tilsæt 100 ml vand til 4,4 g agar og opvarm blandingen i en mikrobølgeovn for at opløse agar.
    2. Tilsæt 80 ml frisk druesaft, 5 ml eddikesyre og 5 ml ethanol til agaropløsning.
    3. Hæld ca. 1,5 ml af opløsningen med en pipette på hvert glasskinne og lad det størkne.
  2. Fremstilling af 6 cm skål agaroseplader
    1. Tilsæt 50 ml vand til 0,5 g agarose og opvarm blandingen i en mikrobølgeovn for at opløse agarose.
    2. Hæld ca. 2,5 ml agaroseopløsning på en 6 cm skål med en pipette.

2. fase 16 embryo samling

  1. Indsamle voksne fluer, og tilføj 200 kvinder og 200 hanner i et 50 ml konisk rør.
  2. Sæt en plade frisk druesaft agar på gær i 50 ml rør, og luk med en svamp cas.
  3. Inkuber fluerne ved 16 ° C i lyset i 2 - 3 dage. Skift tallerken en gang om dagen.
  4. Flyv fluerne til mørket ved 25 ° C i 1 time.
  5. Skift den gamle plade til en ny uden gær. Tillad fluer at lægge æg i 2 timer.
  6. Saml pladen og inkuber ved 16 ° C i 26 timer.
  7. Saml embryoner fra pladen med en pensel i 1 ml PBS indeholdende 0,2% (vol / vol) Triton X-100.
  8. Vask embryoner to gange med 1 ml PBS indeholdende 0,2% (vol / vol) Triton X-100.
  9. For at fjerne chorionen tilsættes 1,2 ml natriumhypochloritopløsning (2,2 - 3,4% Cl) til embryoner i 3 minutter.
  10. Vask embryoner 4 gange med 1 ml PBS indeholdende 0,2% (vol / vol) Triton X-100.
  11. Placer embryoner på 6 cm skål agaroseplader. Pick up 16 embryoner under et mikroskop som beskrevet af Roberts 20 . Indsamle ca. 50 embryoner i et 1,5 ml Treff mikrotestrør med en mikropipette.

3. PrepaRation af embryonale celler

  1. Vask embryoner to gange med 150 μl PBS.
  2. Homogeniser embryoner 30 gange i et 1,5 ml mikrotestrør og pelletsblander i nærvær af 200 μl kollagenase (0,25% (vægt / volumen)) i PBS.
  3. Disperse embryonale celler ved pipettering 10 gange, og flyt cellesuspensionen til et 1,5 ml rør. Inkuber celler ved 37 ° C i 1 minut i et vandbad. Gentag dette trin to gange.
  4. Tilsæt 800 μl PBS til cellesuspensionen, og centrifuger ved 1400 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
  5. Fjern supernatanten og tilsæt 200 μL trypsin (0,25% (w / v)) i PBS til cellerne. Disperse embryonale celler ved pipettering 50 gange.
  6. Filtrer cellesuspensionen med en 70 μm cellestrøm.
  7. For at stoppe trypsinaktiviteten tilsættes 40 μl varmeinaktiveret føtalt bovint serum til den filtrerede cellesuspension. Tilsæt 800 μl PBS og centrifuge ved 1.400 x g ved 4 ° C i 5 min.
  8. Fjern supernataNt, suspendere udfældede celler i 200 μl PBS og centrifuge ved 1400 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
  9. Fjern supernatanten og suspendere udfældede celler i 30 μl PBS.
  10. Monter den forberedte cellesuspension på aminopropyltriethoxysilanbelagte glasskinner og vent i 10-15 minutter, indtil cellerne fastgøres til glasskinnerne.
  11. Fjern den resterende opløsning på glasskinnerne med en pipette. Monter 60-70 μl PBS indeholdende 4% (w / v) PFA (paraformaldehyd) på celler i 10-15 minutter til fiksering.
  12. Fjern fixeringsopløsningen, og læg glasskinner i PBS i mere end 1 min.

4. Farvning af hæmocytter

  1. Immunostaining med et anti-Croquemort antistof
    1. Serielt sug glasskinner i methanol i 10 minutter i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter og derefter i PBS i 10 minutter.
    2. Fyld 20 μl 5% (v / v) hele svineserum i PBS-indholdNg 0,2% (vol / vol) Triton X-100 på celler til blokering. Inkubér dias ved stuetemperatur i 20 minutter.
    3. Fjern opløsningen fra glasskinner og monter 20 μL anti-Croquemort antiserum 19 , 21 (0,1% (vol / vol)) i PBS indeholdende 0,2% (vol / vol) Triton X-100 på celler. Inkubér dias ved 4 ° C natten over.
    4. Sug glasskinner i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 gange.
    5. Sug glasskinner i PBS i 10 minutter.
    6. Fyld 20 μl alkalisk phosphatase-mærket anti-rotte-IgG (0,5% (v / v)) i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 og 5% (v / v) Temperatur i 1 time.
    7. Sug glasskinner i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 gange.
    8. Sættetid objektglas i buffer indeholdende 100 mM Tris-HCI, pH 9,5, 100 mM NaCl og 50 mM MgCl2 i 10 minutter.
    9. Mount phosphatase substratopløsning indeholdende 0,23 mg / ml 5-brom-4chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP), 0,35 mg / ml nitro blue tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCI, pH 9,5, 100 mM NaCl og 50 mM MgCl2 på celler.
    10. Overhold celler under et mikroskop for korrekt farvning. Når stærke lilla signaler optræder i hæmocyternes granuler, fjern substratopløsningen og blød glasplader i buffer bestående af 10 mM Tris-HCI, pH 8,5 og 1 mM EDTA. Farvning i ca. 5 - 10 min anbefales.
  2. Immunostaining med et anti-GFP antistof (en anden mulighed for farvning af hæmocytter)
    1. Serielt sug glasskinner i methanol i 10 minutter, PBS indeholdende 0,2% (vol / vol) Triton X-100 i 10 minutter og PBS i 10 minutter.
    2. Fyld 20 μl 5% (v / v) hele svineserum i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 på celler til blokering. Inkubér dias ved stuetemperatur i 20 minutter.
    3. Fjern opløsningen på glasskinner og monter 20 μL af mus anti-GFP antistoffet (1% (vol / vol)) / PBS cOpnåelse af 0,2% (vol / vol) Triton X-100 på celler. Inkubér dias ved stuetemperatur natten over.
    4. Sug glasskinner i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 gange.
    5. Sug glasskinner i PBS i 10 minutter.
    6. Montere 20 μl alkalisk phosphatase-mærket anti-mus-IgG (0,5% (v / v)) i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 og 5% (v / v) Temperatur i 1 time.
    7. Sug glasskinner i PBS indeholdende 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 gange.
    8. Sættetid objektglas i puffer bestående af 100 mM Tris-HCI, pH 9,5, 100 mM NaCl og 50 mM MgCl2 i 10 minutter.
    9. Monter fosfatasesubstratopløsning indeholdende 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCI, pH 9,5, 100 mM NaCl og 50 mM MgCl2 på celler.
    10. Overhold celler under et mikroskop for korrekt farvning. Når lilla signaler optræder i hele hæmocytter, fjern substratopløsningen og sug dias i buffer beståendeAf 10 mM Tris-HCI, pH8,5 og 1 mM EDTA. Farvning i ca. 10-15 minutter anbefales.

5. Stil apoptotiske celler af TUNEL

  1. Sug glasskinner i PBS i 5 min.
  2. Gentag med nye PBS.
  3. Monter Equilibration buffer (Se Materialetabel) på celler i 10 minutter.
  4. Fjern opløsningen fra glasskinner og monter 20 μl TdT-opløsning indeholdende 5 μl terminal deoxynucleotidyltransferase og 15 μl reaktionsbuffer på celler ved 37 ° C i 1 time.
  5. Fjern opløsningen fra glasskinner og sug dias i buffer, der består af 0,5 ml STOP / Vaskbuffer og 17 ml vand.
  6. Sug dias i PBS i 5 minutter 3 gange.
  7. Montér 20 μl anti-digoxigenin-peroxidase på celler ved stuetemperatur i 30 minutter.
  8. Sug glasskinner i PBS i 5 minutter 4 gange.
  9. Sug glasskinner i peroxidasubstratopløsning bestående af 30 ml 50 mM Tris-HCI, pH7,5 indeholdendega fuld mikro spatel af 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrichloride (DAB) og 0,002% (volumen / volumen) H2O 2 i 30 sek.
  10. Gentag trin 5.9, indtil apoptotiske celler farves brun. Sug glas glider i vand for at stoppe peroxidase reaktionen.
  11. Indsæt celler med vand til observation.

6. Mål niveauet for phagocytose af apoptotiske celler

  1. Overhold prøver under et lysmikroskop for at vurdere niveauet af fagocytose. Count Croquemort-positive celler eller GFP-positive celler som hæmocytter, TUNEL-positive celler som apoptotiske celler og dobbelt positive celler som fagocytoserende hæmocytter.
  2. Det fagocytiske indeks er defineret som antallet af dobbelt positive celler til det totale antal Croquemort-positive celler eller GFP-positive celler. Det anbefales at overholde mere end 300 hæmocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at undersøge phagocytosen af ​​apoptotiske celler blev Drosophila- embryoner fra udviklingsstadiet 16 opsamlet og fremstillet som dispergerede celler. Hæmocytter, Drosophila makrofager, blev farvet ved immuncytokemi for hæmocyt markør "Croquemort" 17, 22 under anvendelse af et specifikt antistof 19, 21, og apoptotiske celler blev farvet ved TUNEL i dispergerede embryonale celler (figur 1A). Croquemort, en Drosophila CD36-relateret receptor, udtrykkes specifikt på alle embryonale hæmocytter 22 og er blevet vist genetisk at være involveret i clearance af apoptotiske celler i Drosophila- embryoner 17 . Croquemort-positive celler har lilla signaler i deres små granuler. TUNEL-positive celler viser abRown signal i hele corpuses. TUNEL-positive celler er mindre end andre celler, og nogle er inde i Croquemort-positive celler, som anses for at være fagocytosedøde celler. Mellem 2 og 10% observeres Croquemort-positive celler og 1 - 5% TUNEL-positive celler normalt i alle embryonale celler.

I Drosophila er der to signalveje til opfangning af apoptotiske celler. To fagocytose receptorer for de tilsvarende veje, Draper og integrin a PS3 p ν uafhængigt genkende døde celler 19, 21, 23, 24, 25. Draper er et transmembranprotein, der besidder atypiske epidermale vækstfaktor (EGF) -lignende sekvenser i den ekstracellulære region og de to phosphorylerbare motiver NPxY og YxxL i INtracellulær del 26 . Integrin α PS3 β ν er også en transmembran receptor bestående af en heterodimer af a- og p-underenheder 25. Figur 1B viser forholdet mellem fagocytoserende hæmocytter til totale hæmocytter i vildtype- eller drpr- eller Itgbn-enkeltmutantembryoner . Ved at tælle alle Croquemort-positive celler (totale hæmocytter) og Croquemort- og TUNEL-dobbelt positive celler (fagocytoserende hæmocytter) beregnede vi fagocytindekset som antallet af fagocytoserende hæmocytter til det totale antal hæmocytter. Det fagocytiske indeks var lavere i drpr- eller Itgbn- mutanten end i vildtype, mens antallet af hæmocytter og apoptotiske celler var ens ( figur 1C- D ), hvilket indikerer, at disse to gener er nødvendige for apoptotisk celleintulfation som tidligereeported.

Når et anti-Croquemort-antistof ikke er tilgængeligt eller mutantlinjer med ændret Croquemort-ekspression undersøges, skal vi vælge en anden mulighed for at detektere hæmocytter. Embryoer med en GAL4-driver styret af en hæmocytspecifik promotor ( srpHemo-GAL4 ) og GFP-genet styret af en opstrøms aktiveringssekvens (UAS), der indbefatter GAL4-bindingsstedet ( UAS-EGFP ), har GFP-mærkede hæmocytter 27 , Som gør det muligt for os at opdage hæmocytter ved hjælp af anti-GFP. Figur 2A viser et billede opnået efter påvisning af hæmocytter og apoptotiske celler med immunfarvning ved anvendelse af et anti-GFP-antistof og TUNEL i embryonale celler med srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Mens et anti-Croquemort-antistof pletter små granuler i celler, spilder et anti-GFP-antistof hele hæmocytter. I lighed med figur 1A er 2 - 6% GFP-positive celler og 1 - 5% TUNEL-positive Celler observeres i alle embryonale celler. Nogle TUNEL-positive celler detekteres inden for GFP-positive celler, som anses for at være fagocytosedøde celler. RNAi-medieret knockdown anvendes let for at vurdere eventuelle gener for deres involvering i phagocytose ved at krydse fluer med UAS-dsRNA fra kandidatgenene med srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Den RNAi-medierede knockdown af drpr eller Itgbn reducerede fagocytisk indeks ( figur 2B ), mens antallet af hæmocytter og apoptotiske celler i embryonale celler var sammenlignelige ( figur 2C -2D ), hvilket igen viser, at disse fagocytose receptorer er involveret i fagocytose af Apoptotiske celler. Lignende fagocytiske indekser opnås fra begge hemocytdetekteringsmetoder, hvilket tyder på, at begge er kompatible.

G "/>
Figur 1 : Farvning af embryonale celler med et anti-Croquemort-antistof og TUNEL. ( A ) Lysfeltbilleder af dispergerede embryonale celler fra w 1118- stammen ved immunfarvning med et anti-Croquemort-antistof og TUNEL. Forstørrede billeder af repræsentative positivt eller negativt farvede celler (top 4 paneler) og et lavt strømfelt (bundpanel) vises. Skalestænger, 5 μm (top); 50 μm (bund). ( B ) Forholdet mellem Croquemort-positive hæmocytter med TUNEL-signalet til alle Croquemort-positive hæmocytter i drpr- eller Itgbn- mutanten blev analyseret med dispergerede embryonale celler. ( C ) Forholdet mellem Croquemort-positive hæmocytter til alle celler i drpr- eller Itgbn- mutanten blev analyseret med dispergerede embryonale celler. ( D ) Forholdet mellem TUNEL-positive apoptotiske celler til alle celler i drpr ellerItgbn- mutant blev analyseret med dispergerede embryonale celler. genotyper w 1118 (vildtype-kontrol), drpr Δ5 (drpr mutant), og Itgbn 2 (integrin β ν mutant). Data var repræsentative for tre uafhængige eksperimenter og analyseret af Studentets t- test. Ca. 300 Croquemort-positive hæmocytter blev observeret i hvert forsøg, og værdier repræsenterer middel ± SD af tre mikroskopiske felter. *; p <0,05, ns; Forskel ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Farvning af embryonale celler af AntI-GFP og TUNEL. ( A ) Lysfeltbilleder af dispergerede embryonale celler fra srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + -stammen ved immunfarvning med et anti-GFP-antistof og TUNEL. Forstørrede billeder af repræsentative positivt eller negativt farvede celler (top 4 paneler) og et lavt strømfelt (bundpanel) vises. Skalestænger = 5 μm (top); 50 μm (bund). ( B ) Forholdet mellem GFP-positive hæmocytter med TUNEL-signalet til alle GFP-positive hæmocytter i RNAi-medierede knockdown-fluer af drpr eller Itgbn blev analyseret med dispergerede embryonale celler. ( C ) Forholdet mellem GFP-positive hæmocytter til alle celler i RNAi-medierede knockdown fluer af drpr eller Itgbn blev analyseret med dispergerede embryonale celler. ( D ) Forholdet mellem TUNEL-positive apoptotiske celler til alle celler i RNAi-medierede knockdown fluer af drpr eller Itgbn blev analyseret med dispergerede embryonale celler. genotyper RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Data var repræsentative for tre uafhængige eksperimenter og analyseret af Studentets t- test. Ca. 300 GFP-positive hæmocytter blev observeret i hvert forsøg, og værdier repræsenterer middel ± SD af tre mikroskopiske felter. *; P <0,05, ns; Forskel ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi heri beskrev et fagocytose assay ved anvendelse af Drosophila embryoner. Ved at anvende dispergerede embryonale celler til måling af fagocytose kvantitativt, hæmocytter, Drosophila faglige fagocytter immunostained for hemocytmarkøren Croquemort eller srpHemo- driven GFP, og apoptotiske celler påvises af TUNEL i denne protokol. Niveauet af fagocytose udtrykkes som et fagocytisk indeks ved at tælle det totale antal hæmocytter og fagocytoserende hæmocytter. Anvendelsen af ​​dispergerede embryonale celler gør det muligt for os at observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoner og præcist kvantificere niveauet af fagocytose. Desuden opdager vores metode hæmocytter og apoptotiske celler med farvestoffer, der er observerbare under et lysmikroskop, ikke et fluorescensmikroskop. Dette letter vurderingen af ​​phagocytose niveauer, fordi det er muligt at observere hæmocytter og apoptotiske celler samtidigt uden at ændre noget filter.

Ve_content "> Følgende punkter er afgørende for farvning af embryonale celler. I fikseringstrinnet af embryonale celler skal der anvendes frisk PFA fremstillet inden for to uger. Ved immunforøgelse af Croquemort skal inkubationen af ​​celler med anti-Croquemort udføres Ved 4 ° C. Ved TUNEL-farvning skal inkubationen af ​​celler med DAB udføres ved omhyggeligt at kontrollere under et mikroskop for at undgå overdreven farvning. TUNEL visualiserer fragmenteret DNA ved at detektere 3'-OH, hvilket er rigeligt i apoptotiske celler. Normale celler har også 3'-OH i DNA'ens 3'-terminal, men på et lavere niveau end det i apoptotiske celler. Derfor vil en inkubation af celler med DAB for lang tid ikke blot affekte apoptotiske celler, men også normale celler . Observation af celler hver 15. eller 30 s under DAB-farvning anbefales for at forhindre dette.

I denne protokol, selvom kvantificering af phagocytosniveauet er hurtig og præcis, er nogle oplysninger suCh, da stedet for opsving eller fordeling af hæmocytter er tabt. Vi viste tidligere, at denne analyse og et in situ fagocytose assay ved anvendelse af hele embryoner frembragte lignende resultater med hensyn til fagocytisk indeks 21 . Derfor anbefaler vi at udføre et in situ fagocytose assay parallelt for at kunne fortolke de opnåede resultater i nogle tilfælde.

Drosophila har en anden faglig fagocyt, glialceller, i centralnervesystemet. Selv om vi ikke beskriver, hvordan man vurderer fagocytose af apoptotiske neuroner med glialceller i embryoner i denne protokol, anvendes den samme protokol til at kvantificere niveauet af ophobning som det, der er rapporteret af Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . På samme måde antyder dette assay, at TUNEL-positive celler i Drosophila- embryoner sandsynligvis er fagocytosed af ikke-faglige fagocytter. Phagocytose af de uidentificerede phAgocytter med ukendte engulferingsreceptorer kan forklare resultatet ( figur 1D ), at det totale antal apoptotiske celler i embryonale celler ikke synes at øges i en fagocytosegenmutant.

Som konklusion har denne protokol med succes ført til opdagelsen af ​​gener, der er nødvendige for fagocytose af apoptotiske celler af faglige fagocytter. 24 , 25 , 28 . Baseret på den evolutionære bevarelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for fagocytose 7 , kan afslørende genfunktioner i Drosophila- embryoner, der involverer komplekse fagocytose-reaktioner, tilvejebringe meningsfuld indsigt i phagocytisk clearance af døde celler, som er relateret til inflammatoriske lidelser og autoimmune sygdomme hos pattedyr 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Kaz Nagaosa og Akiko Shiratsuchi for deres råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Phagocytosis Assay for Apoptotiske Celler i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter