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Immunology and Infection

Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d'identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques.

Abstract

Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques doivent être élucidés plus en détail en raison de leur rôle dans les maladies immunitaires et intrathables. Nous avons développé ici une méthode expérimentale pour étudier quantitativement la phagocytose à l'aide de la Drosophila de la mouche des fruits, dans laquelle le réseau de gènes contrôlant les réactions d'absorption est conservé d'évolution des mammifères. Afin de détecter et compter avec précision les phagocytes englobants et non absorbants utilisant des animaux entiers, les embryons de Drosophila ont été homogénéisés pour obtenir des cellules dispersées comprenant des phagocytes et des cellules apoptotiques. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro dans lequel il est possible d'observer tous les phagocytes et cellules apoptotiques dans des embryons entiers et quantifier précisément le niveau de phagocytose. Nous avons confirmé que cette méthode reproduit celles d'études antérieuresQui a identifié les gènes requis pour la phagocytose des cellules apoptotiques. Cette méthode permet d'analyser l'engourdissement des cellules mortes et, combinée à la génétique puissante de Drosophila , révélera les réactions phagocytaires complexes qui composent la migration, la reconnaissance, l'engorgement et la dégradation des cellules apoptotiques par des phagocytes.

Introduction

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Dans les animaux métazoaires, par exemple, le nématode Caenorhabditis elegans , la mouche à fruits Drosophila melanogaster , et les souris et les humains, un grand nombre de cellules subissent une apoptose au cours du développement pour façonner leur corps et à l'âge adulte pour maintenir l'homéostasie 1 , 2 . Les cellules apoptotiques doivent être rapidement éliminées car elles induisent une inflammation dans les tissus environnants en libérant des matériaux intracellulaires immunogènes, sinon complètement éliminés 3 . Afin de faciliter l'élimination rapide, les cellules apoptotiques présentent les signaux dits "eat-me" qui sont reconnus par les récepteurs d'engulfment des phagocytes et sont éliminés par phagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Ainsi, la phagocytose joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie de l'hôte et donc, l'élucidation de la molécule Les mécanismes marquants sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques sont importants.

Les mécanismes responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques semblent être conservés d'une manière évolutive chez les espèces des nématodes, des mouches et des souris 7 . Plusieurs tests de phagocytose sont actuellement disponibles pour évaluer l'absorption de cellules apoptotiques dans ces modèles d'animaux. Dans C. elegans , 131 cellules somatiques subissent une mort cellulaire programmée pendant le développement, et les cadavres cellulaires sont phagocytés par des cellules voisines, qui sont des phagocytes non professionnels 8 . Ainsi, le nombre de cadavres de cellules restants dans C. elegans indique le niveau de phagocytose in vivo . En recherchant des mutants de nématodes qui montrent un nombre accru de cellules mortes, plusieurs gènes requis pour la phagocytose ont été identifiés et caractérisés génétiquement 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Des tests de phagocytose ex vivo avec des phagocytes de culture primaire, généralement des macrophages, sont souvent utilisés chez la souris. Les cellules apoptotiques sont préparées en utilisant des lignées cellulaires telles que des cellules Jurkat, et sont mélangées avec des phagocytes primaires. Après une incubation pendant plusieurs heures, le nombre total de phagocytes et de phagocytes engloutis sont comptés afin d'évaluer le niveau de phagocytose. En tant que modification sophistiquée de cette méthode, le groupe de Nagata a développé un test de phagocytose ex vivo avec des cellules exprimant une ICAD résistante aux caspases (inhibiteur de la DNase activée par caspase), dans laquelle les cellules apoptotiques ne subissent pas de fragmentation de l'ADN apoptotique, mais l'ADN est encore clivé lorsque Les cellules sont phagocytées. Lorsque ces cellules sont utilisées comme cibles apoptotiques dans un test de phagocytose, seul l'ADN des cellules apoptotiques englouties est fragmenté et coloré par un marquage de l'extrémité du DUTP médié par TdT (TUNEL). Par conséquent, le niveauL de l'absorption de cellule apoptotique est mesurée en comptant les signaux TUNEL dans un mélange de phagocytes et de cellules apoptotiques 13 .

Dans D. melanogaster , les phagocytes professionnels appelés hémocytes, les macrophages de Drosophila , sont responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques 14 , 15 . En plus des essais de phagocytose in vitro avec des lignées cellulaires de culture, des tests de phagocytose in vivo avec des embryons complets de Drosophila sont disponibles. Les embryons de Drosophila sont un outil puissant pour examiner le niveau d'absorption des cellules apoptotiques car de nombreuses cellules subissent une apoptose et sont phagocytées par des hémocytes pendant le développement embryonnaire 14 , 15 , 16 . Un exemple d'un test de phagocytose in vivo est la méthode développée par le groupe de Franc. Dans leur méthode, les hémocytes sont lesProtégés par l'immunocoloration de la peroxidasine, un marqueur d'hémocyte, des cellules apoptotiques sont colorées en utilisant le colorant nucléaire, la 7-amino actinomycine D dans des embryons de Drosophila entiers, et le nombre de cellules posologiques doubles est considéré comme un signal de phagocytose 17 . Un autre exemple d'un test de phagocytose sur des embryons est basé sur le concept de la méthode de Nagata décrit ci-dessus; Cependant, la phagocytose in vivo est évaluée à l'aide des embryons de DNC ( Drosophila caspase-activase DNase) mutants flies 18 , 19 . Ces tests de phagocytose in vivo sont utiles pour observer directement la phagocytose in situ . Cependant, des difficultés sont associées à exclure tout biais possible dans l'étape de compter les cellules phagocytes car il est difficile d'observer tous les phagocytes et les cellules apoptotiques dans les embryons entiers en raison de leur épaisseur.

Pour surmonter cette limitation, nous développonsUn nouvel essai de phagocytose dans des embryons de Drosophila . Dans notre méthode, afin de compter facilement les hémocytes phagocytants, les embryons entiers sont homogénéisés pour préparer des cellules embryonnaires dispersées. Les phagocytes sont détectés par l'immunocoloration d'un marqueur de phagocytes, et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL avec ces cellules embryonnaires dispersées. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro qui quantifie précisément le niveau de phagocytose. Tous les génotypes de mouches peuvent être utilisés dans ce dosage si elles se développent au stade 16 des embryons 20 , le stade de développement au cours duquel la clairance cellulaire apoptotique par phagocytose est la plus abondante. Cette méthode présente l'avantage d'évaluer quantitativement le niveau de phagocytose et peut donc contribuer à l'identification de nouvelles molécules impliquées dans la phagocytose des cellules apoptotiques in vivo .

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Protocol

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1. Préparation

  1. Préparation de plaques d'agar de jus de raisin frais
    1. Ajouter 100 ml d'eau à 4,4 g d'agar et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agar.
    2. Ajouter 80 ml de jus de raisin frais, 5 mL d'acide acétique et 5 mL d'éthanol à la solution d'agar.
    3. Verser environ 1,5 ml de la solution avec une pipette sur chaque glissière de verre, et la laisser solidifier.
  2. Préparation de plaques d'agarose à plat de 6 cm
    1. Ajouter 50 ml d'eau à 0,5 g d'agarose et chauffer le mélange dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agarose.
    2. Verser environ 2,5 ml de solution d'agarose sur un plat de 6 cm avec une pipette.

2. Phase 16 Collection d'embryons

  1. Recueillir des mouches adultes et ajouter 200 femelles et 200 mâles dans un tube conique de 50 ml.
  2. Mettez une assiette d'agar de jus de raisin frais sur la levure dans le tube de 50 ml et fermez avec une éponge caP.
  3. Incuber les mouches à 16 ° C dans la lumière pendant 2 à 3 jours. Changez la plaque une fois par jour.
  4. Déplacez les mouches vers le noir à 25 ° C pendant 1 h.
  5. Changez la vieille plaque en une nouvelle sans levure. Laisser moucher des œufs pendant 2 h.
  6. Recueillir la plaque et incuber à 16 ° C pendant 26 h.
  7. Recueillir des embryons de la plaque avec un pinceau dans 1 mL de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  8. Laver les embryons deux fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  9. Afin d'éliminer le chorion, ajouter 1,2 ml de solution d'hypochlorite de sodium (2,2 à 3,4% Cl) aux embryons pendant 3 min.
  10. Laver les embryons 4 fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100.
  11. Placer les embryons sur des assiettes à l'agarose de 6 cm. Ramassez les embryons au stade 16 sous un microscope tel que décrit par Roberts 20 . Recueillir environ 50 embryons dans un tube de test micro Treff de 1,5 ml avec une micropipette.

3. PrepaRation des cellules embryonnaires

  1. Laver les embryons deux fois avec 150 μL de PBS.
  2. Homogénéiser les embryons 30 fois dans un tube à micro-essai de 1,5 ml et un mélangeur de pastilles en présence de 200 μl de collagénase (0,25% (p / v)) dans du PBS.
  3. Dispersez les cellules embryonnaires en pipettant 10 fois et déplacez la suspension cellulaire vers un tube de 1,5 ml. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 min dans un bain d'eau. Répétez cette étape deux fois.
  4. Ajouter 800 μL de PBS à la suspension cellulaire et centrifuger à 1400 x g à 4 ° C pendant 5 min.
  5. Enlever le surnageant et ajouter 200 μL de trypsine (0,25% (p / v)) dans du PBS aux cellules. Disperse les cellules embryonnaires en pipetant 50 fois.
  6. Filtrer la suspension cellulaire avec un filtre cellulaire de 70 μm.
  7. Afin d'arrêter l'activité de la trypsine, ajouter 40 μL de sérum de bovin fœtal inactivé par la chaleur à la suspension de cellules filtrées. Ajouter 800 μL de PBS et centrifuger à 1 400 x g à 4 ° C pendant 5 min.
  8. Supprimer les supernataNt, suspendre les cellules précipitées dans 200 ul de PBS et centrifuger à 1400 x g à 4 ° C pendant 5 min.
  9. Enlever le surnageant et suspendre les cellules précipitées dans 30 μL de PBS.
  10. Monter la suspension cellulaire préparée sur des lames de verre recouvertes de triéthoxysilane aminopropylique et attendre de 10 à 15 minutes jusqu'à ce que les cellules soient fixées aux glissières de verre.
  11. Retirez la solution restante sur les diapositives en verre avec une pipette. Montez 60 - 70 μL de PBS contenant 4% (p / v) de PFA (paraformaldéhyde) sur les cellules pendant 10 à 15 minutes pour la fixation.
  12. Retirez la solution de fixation et placez les diapositives de verre dans du PBS pendant plus d'une minute.

4. Coloration des hémocytes

  1. L'immunocoloration avec un anticorps anti-Croquemort
    1. Tremper en série les lames de verre dans du methanol pendant 10 minutes, dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 min, puis dans du PBS pendant 10 min.
    2. Monter 20 μL de sérum de porc entier entier à 5% (v / v) dans PBS contenirNg 0,2% (v / v) Triton X-100 sur les cellules pour le blocage. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min.
    3. Retirez la solution des glissières en verre et montez 20 μL d'antiserès anti-Croquemort 19 , 21 (0,1% (v / v)) dans du PBS contenant Triton X-100 à 0,2% (v / v) sur les cellules. Incuber les lames à 4 ° C pendant la nuit.
    4. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
    5. Faire tremper les glissières de verre en PBS pendant 10 min.
    6. Monter 20 μL d'IgG anti-rat marqué à la phosphatase alcaline (0,5% (v / v)) dans du PBS contenant du Triton X-100 à 0,2% (v / v) et du sérum de porc entier entier à 5% (v / v) sur les cellules dans la pièce Température pendant 1 h.
    7. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
    8. Faire tremper les lames de verre dans un tampon contenant 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 pendant 10 minutes.
    9. Solution de substrat de phosphate de Mount contenant 0,23 mg / ml de 5-bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP), 0,35 mg / mL nitro bleu de tétrazolium (NBT), Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl 2 sur les cellules.
    10. Observez les cellules sous un microscope pour une coloration appropriée. Lorsque des signaux violets forts apparaissent dans les granules d'hémocytes, éliminer la solution de substrat et tremper les glissières de verre dans un tampon constitué de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,5 et 1 mM d'EDTA. On recommande de colorer environ 5 à 10 min.
  2. L'immunocoloration avec un anticorps anti-GFP (une autre option pour la coloration des hémocytes)
    1. Tremper en série les lames de verre dans du methanol pendant 10 minutes, PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 min et PBS pendant 10 min.
    2. Monter 20 μL de sérum de porc entier complet à 5% (v / v) dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 sur les cellules pour le blocage. Incuber les lames à température ambiante pendant 20 min.
    3. Retirez la solution sur les lames de verre et montez 20 μL de l'anticorps anti-GFP de souris (1% (v / v)) / PBS cAtteignant 0,2% (v / v) de Triton X-100 sur les cellules. Incuber les glissières à température ambiante pendant une nuit.
    4. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
    5. Faire tremper les glissières de verre en PBS pendant 10 min.
    6. Montez 20 μl d'IgG anti-souris marquée par la phosphatase alcaline (0,5% (v / v)) dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 et 5% (v / v) de sérum de porc entier sur les cellules dans la pièce Température pendant 1 h.
    7. Faire tremper les lames de verre dans du PBS contenant 0,2% (v / v) de Triton X-100 pendant 10 minutes 5 fois.
    8. Faire tremper les lames de verre dans un tampon constitué de Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 pendant 10 minutes.
    9. Monter la solution de substrat de phosphatase contenant 0,23 mg / ml de BCIP, 0,35 mg / ml de NBT, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, 100 mM de NaCl et 50 mM de MgCl2 sur les cellules.
    10. Observez les cellules sous un microscope pour une coloration appropriée. Lorsque les signaux violets apparaissent dans des hémocytes entiers, enlevez la solution de substrat et trempez les glissières dans un tampon constituéDe Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 et EDTA 1 mM. Il est recommandé de colorer environ 10 à 15 minutes.

5. Tacher les cellules apoptotiques par TUNEL

  1. Faire tremper les glissières en verre dans PBS pendant 5 min.
  2. Répétez avec un nouveau PBS.
  3. Mount Equilibration buffer (Voir la Table des matériaux) sur les cellules pendant 10 min.
  4. Retirez la solution des glissières en verre et montez 20 μL de solution TdT contenant 5 μL de désoxynucléotidyl transferase terminale et 15 μL de tampon réactionnel sur les cellules à 37 ° C pendant 1 h.
  5. Retirez la solution des glissières de verre et trempez les glissières dans un tampon constitué de 0,5 ml de STOP / tampon de lavage et 17 ml d'eau.
  6. Faire tremper les diapositives dans PBS pendant 5 minutes 3 fois.
  7. Monter 20 μL de Anti-Digoxigenine-Peroxydase sur les cellules à température ambiante pendant 30 min.
  8. Tremper les glissières en verre dans PBS pendant 5 minutes 4 fois.
  9. Faire tremper les lames de verre dans une solution de substrat de peroxydase consistant en 30 ml de Tris-HCl 50 mM, contenant pH7,5La micro spatule complète de 3,3'-diaminobenzidine tétrahydro-chlorure (DAB) et 0,002% (v / v) d'H 2 O 2 pendant 30 s.
  10. Répétez l'étape 5.9 jusqu'à ce que les cellules apoptotiques soient colorées au brun. Tremper les lames de verre dans l'eau pour arrêter la réaction de la peroxydase.
  11. Entourez les cellules avec de l'eau pour l'observation.

6. Mesurer le niveau de phagocytose des cellules apoptotiques

  1. Observer les échantillons sous microscope optique afin d'évaluer le niveau de phagocytose. Les cellules positives de Count Croquemort ou les cellules positives pour la GFP comme hémocytes, les cellules TUNEL positives comme cellules apoptotiques et les cellules positives doubles comme phococytes des hémocytes.
  2. L'indice phagocytaire est défini comme le nombre de cellules double positives pour le nombre total de cellules positives à Croquemort ou de cellules GFP positives. Il est recommandé d'observer plus de 300 hémocytes.

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Representative Results

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Afin d'examiner la phagocytose des cellules apoptotiques, les embryons de Drosophila du stade de développement 16 ont été recueillis et préparés sous forme de cellules dispersées. Les hémocytes, les macrophages de Drosophila , ont été colorés par immunocytochimie pour le marqueur hémocytaire "Croquemort" 17 , 22 en utilisant un anticorps spécifique 19 , 21 et les cellules apoptotiques ont été colorées par TUNEL dans des cellules embryonnaires dispersées ( Figure 1A ). Croquemort, un récepteur lié à la CD36 de Drosophila , est spécifiquement exprimé sur tous les hémocytes embryonnaires 22 et a été montré génétiquement pour impliquer dans la clairance des cellules apoptotiques dans les embryons de Drosophila 17 . Les cellules positives à la Croquemort ont des signaux violets dans les petits granules de leurs cellules. Les cellules TUNEL-positives montrent abSignal de roc dans des corpus entiers. Les cellules TUNEL-positives sont plus petites que les autres cellules, et certaines sont à l'intérieur des cellules positives à Croquemort, qui sont considérées comme des cellules mortes phagocytées. Entre 2 et 10% de cellules positives à Croquemort et 1 à 5% de cellules positives au TUNEL sont normalement observées dans toutes les cellules embryonnaires.

Dans Drosophila , il existe deux voies de signalisation pour l'absorption des cellules apoptotiques. Deux récepteurs de phagocytose pour les voies correspondantes, Draper et intégrine α PS3 β ν, reconnaissent indépendamment les cellules mortes 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper est une protéine transmembranaire qui possède des séquences de facteur de croissance épidermique atypique (EGF) dans la région extracellulaire et les deux motifs phosphorylables NPxY et YxxL dans le iPortion ntracellulaire 26 . L'intégrine α PS3 β ν est également un récepteur transmembranaire consistant en un hétérodimère de sous -unités α et β 25 . La figure 1B montre le rapport entre les hémocytes phagocytants et les hémocytes totaux dans des embryons mutants simples à virus sauvage ou drpr ou Itgbn . En comptant toutes les cellules positives de Croquemort (hémocytes totaux) et Croquemort et TUNEL-double positives (phagocytes des hémocytes), nous avons calculé l'indice phagocytaire comme le nombre d'hémocytes phagocytants au nombre total d'hémocytes. L'indice phagocytaire était plus faible chez le mutant drpr ou Itgbn que dans le type sauvage, alors que le nombre d'hémocytes et de cellules apoptotiques était similaire ( Figure 1C -D ), ce qui indique que ces deux gènes sont nécessaires pour l'absorption des cellules apoptotiques, comme précédemmentEporté.

Lorsqu'un anticorps anti-Croquemort n'est pas disponible ou que des lignes mutantes avec une expression altérée de Croquemort sont examinées, nous devons sélectionner une autre option pour détecter les hémocytes. Les embryons avec un pilote GAL4 contrôlé par un promoteur spécifique de l'hémocyte ( srpHemo-GAL4 ) et le gène GFP contrôlé par une séquence d'activation en amont (UAS) incluant le site de liaison GAL4 ( UAS-EGFP ) ont des hémocytes marqués au GFP 27 , Ce qui nous permet de détecter les hémocytes en utilisant anti-GFP. La figure 2A montre une image obtenue après détection d'hémocytes et de cellules apoptotiques avec immunocoloration en utilisant un anticorps anti-GFP, et TUNEL dans des cellules embryonnaires avec srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Alors qu'un anticorps anti-Croquemort tache de petits granules dans les cellules, un anticorps anti-GFP tache des hémocytes entiers. Semblable à la figure 1A , 2 à 6% de cellules GFP positives et 1 à 5% de TUNEL positif Des cellules sont observées dans toutes les cellules embryonnaires. Certaines cellules TUNEL-positives sont détectées dans des cellules GFP-positives, qui sont considérées comme des cellules mortes phagocytées. Le knockdown médié par RNAi est facilement appliqué pour évaluer tous les gènes de leur participation à la phagocytose en traversant des mouches avec l'UAS-dsRNA des gènes candidats avec srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Le knockdown médié par RNAi de drpr ou Itgbn a réduit l'indice phagocytaire ( Figure 2B ), alors que le nombre d'hémocytes et de cellules apoptotiques dans les cellules embryonnaires était comparable ( Figure 2C -2D ), ce qui indique à nouveau que ces récepteurs de phagocytose sont impliqués dans la phagocytose de Cellules apoptotiques. Des indices phagocytaires similaires sont obtenus à partir des deux méthodes de détection des hémocytes, ce qui suggère que les deux sont compatibles.

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Figure 1 : coloration des cellules embryonnaires par un anticorps Anti-Croquemort et TUNEL. ( A ) Images de champs lumineux de cellules embryonnaires dispersées de la souche w 1118 par immunocoloration avec un anticorps anti-Croquemort et TUNEL. Des vues agrandies de cellules représentatives positivement ou négativement colorées (4 panneaux supérieurs) et un champ de faible puissance (panneau inférieur) sont affichés. Barres à l'échelle, 5 μm (haut); 50 μm (en bas). ( B ) Le rapport des hémocytes positifs à Croquemort avec le signal TUNEL à tous les hémocytes positifs à Croquemort chez le mutant Drpr ou Itgbn a été analysé avec des cellules embryonnaires dispersées. ( C ) Le rapport des hémocytes positifs à Croquemort à toutes les cellules du mutant Drpr ou Itgbn a été analysé avec des cellules embryonnaires dispersées. ( D ) Le rapport des cellules apoptotiques TUNEL-positives à toutes les cellules dans le drpr ouLe mutant Itgbn a été analysé avec des cellules embryonnaires dispersées. Génotypes; W 1118 (contrôle de type sauvage), drpr Δ5 (mutant drpr ) et Itgbn 2 (intégrin β ν mutant). Les données étaient représentatives de trois expériences indépendantes et analysées par le test t de Student. Environ 300 hémocytes positifs à Croquemort ont été observés dans chaque expérience, et les valeurs représentent la moyenne ± DE de trois champs microscopiques. *; P <0,05, ns; Différence non significative. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Coloration des cellules embryonnaires par la fourmiI-GFP et TUNEL. ( A ) Images de champ lumineux de cellules embryonnaires dispersées de la souche srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + par immunocoloration avec un anticorps anti-GFP et TUNEL. Des vues agrandies de cellules représentatives positivement ou négativement colorées (4 panneaux supérieurs) et un champ de faible puissance (panneau inférieur) sont affichés. Barres d'échelle = 5 μm (en haut); 50 μm (en bas). ( B ) Le rapport des hémocytes GFP-positifs avec le signal TUNEL à tous les hémocytes GFP-positifs dans les mouches knockdowns médiées par RNAi de Drpr ou Itgbn a été analysé avec des cellules embryonnaires dispersées. ( C ) Le rapport des hémocytes GFP-positives à toutes les cellules dans des mouches knockdowns médiées par RNAi de Drpr ou Itgbn a été analysé avec des cellules embryonnaires dispersées. ( D ) Le rapport des cellules apoptotiques positives au TUNEL à toutes les cellules dans les mouches knockdowns médiées par RNAi de Drpr ou Itgbn a été analysé avec des cellules embryonnaires dispersées. Génotypes; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Les données étaient représentatives de trois expériences indépendantes et analysées par le test t de Student. Environ 300 hémocytes GFP-positifs ont été observés dans chaque expérience, et les valeurs représentent la moyenne ± SD de trois champs microscopiques. *; P <0,05, ns; Différence non significative. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Nous avons décrit ici un test de phagocytose en utilisant des embryons de Drosophila . En utilisant des cellules embryonnaires dispersées pour mesurer quantitativement la phagocytose, les hémocytes, les phagocytes professionnels de Drosophila , sont immunostained pour le marqueur de l'hémocyte Croquemort ou le GFP axé sur la MA , et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL dans ce protocole. Le niveau de phagocytose est exprimé sous forme d'indice phagocytaire en comptant le nombre total d'hémocytes et d'hémocytes phagocytants. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet d'observer tous les phagocytes et cellules apoptotiques dans des embryons entiers et de quantifier précisément le niveau de phagocytose. En outre, notre méthode détecte les hémocytes et les cellules apoptotiques avec des colorants qui sont observables sous un microscope optique, pas un microscope à fluorescence. Cela facilite l'évaluation des niveaux de phagocytose car il est possible d'observer simultanément les hémocytes et les cellules apoptotiques sans changer de filtre.

Ve_content "> Les points suivants sont essentiels pour la coloration des cellules embryonnaires. Dans l'étape de fixation des cellules embryonnaires, on prépare une PFA fraîche préparée dans les deux semaines. Dans l'immunocoloration de Croquemort, il faut effectuer l'incubation de cellules avec anti-Croquemort À 4 ° C. Dans la coloration TUNEL, l'incubation des cellules avec DAB doit être effectuée en vérifiant soigneusement au microscope pour éviter une coloration excessive. TUNEL visualise l'ADN fragmenté en détectant le 3'-OH, abondant dans les cellules apoptotiques. Cependant, Les cellules normales ont également 3'-OH dans le 3'-terminal de l'ADN, mais à un niveau inférieur à celui des cellules apoptotiques. Par conséquent, une incubation de cellules avec DAB pendant trop longtemps va tacher non seulement les cellules apoptotiques, mais aussi les cellules normales L'observation des cellules toutes les 15 ou 30 s pendant la coloration DAB est recommandée pour éviter cela.

Dans ce protocole, bien que la quantification du niveau de phagocytose soit rapide et précise, certaines informationsCh lorsque le site d'engloutissement ou de distribution d'hémocytes est perdu. Nous avons déjà montré que ce dosage et un test de phagocytose in situ utilisant des embryons entiers ont produit des résultats similaires en termes d'indice phagocytaire 21 . Par conséquent, nous recommandons d'effectuer un test de phagocytose in situ en parallèle afin d'interpréter avec précision les résultats obtenus dans certains cas.

La drosophile possède un autre phagocyte professionnel, des cellules gliales, dans le système nerveux central. Bien que nous ne décrions pas comment évaluer la phagocytose des neurones apoptotiques par les cellules gliales dans les embryons dans ce protocole, on applique le même protocole pour quantifier le niveau d'engulfment que celui rapporté par Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . De même, ce dosage suggère que les cellules positives de TUNEL dans les embryons de Drosophila sont susceptibles d'être phagocytées par des phagocytes non professionnels. Phagocytose par les ph non identifiésLes agocytes avec des récepteurs d'engouement inconnus pourraient expliquer le résultat ( figure 1D ) selon lequel le nombre total de cellules apoptotiques dans les cellules embryonnaires ne semble pas augmenter dans un mutant de gène de phagocytose.

En conclusion, ce protocole a mené à la découverte des gènes requis pour la phagocytose des cellules apoptotiques par des phagocytes professionnels. 24 , 25 , 28 . Sur la base de la conservation évolutive des mécanismes moléculaires sous-jacents à la phagocytose 7 , la révélation des fonctions génétiques dans les embryons de Drosophila qui impliquent des réactions de phagocytose complexes peut fournir des informations utiles sur la clairance phagocytaire des cellules mortes, ce qui est lié aux troubles inflammatoires et aux maladies auto-immunes chez les mammifères 29 .

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Kaz Nagaosa et Akiko Shiratsuchi pour leurs conseils.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

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References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons
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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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