Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Abstract

המנגנונים המולקולריים שבבסיס phagocytosis של תאים אפופטוטיים צריך להיות בהבהרה בפירוט רב יותר בשל תפקידה של מחלות דלקתיות ומחלות דלקתיות. פיתחנו שיטה ניסיונית לחקור phagocytosis כמותית באמצעות זבוב פירות תסיסנית , שבו רשת הגן השליטה התגובות התגלות הוא שימור evolutionally מ יונקים. על מנת לאתר במדויק ולספור phagocytes בולע ו un -ulfing באמצעות חיות שלמות, עוברי תסיסנית היו homogenized להשיג תאים מפוזרים, כולל phagocytes ותאים אפופטוטיים. השימוש בתאי מפוזר עובריים מאפשרת לנו למדוד in vivo רמות phagocytosis כאילו ביצענו assay phagocytosis במבחנה שבה אפשר להתבונן כל פגוציטים ותאי אפופטוטיים עוברים שלם ומדויק לכמת את רמת phagocytosis. אישרנו כי שיטה זו משחזרת את אלה של מחקרים קודמיםאשר זיהו את הגנים הנדרשים עבור phagocytosis של תאים אפופטוטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של תאים מתים כדי להיות מנותח, וכאשר בשילוב עם הגנטיקה החזקה של תסיסנית , יגלה את התגובות phagocytic מורכבים המורכבת של הגירה, הכרה, בליעה, והשפלה של תאים אפופטוטיים על ידי phagocytes.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אצל בעלי חיים metazoan, למשל נמטודות Caenorhabditis elegans , זבוב הפירות תסיסנית melanogaster , ועכברים ובני אדם, מספר רב של תאים עוברים אפופטוזיס במהלך הפיתוח כדי לעצב את גופם בבגרות כדי לשמור על הומאוסטזיס 1 , 2 . תאים אפופטוטיים יש להסיר במהירות כי הם גורמים לדלקת ברקמות הסובבות על ידי שחרור חומרים תאיים immunogenic אם לא הוסר לחלוטין 3 . על מנת להקל על הסרה מהירה, תאים אפופטוטיים מציגים את מה שמכונה "אותות האכילה" המוכרים על ידי קולטני ההטיה של פגוציטים, ומוסרים על ידי phagocytosis 3 , 4 , 5 , 6 . לפיכך, phagocytosis משחק תפקיד מכריע תחזוקה של הומאוסטזיס מארח, ומכאן, הבהרת המולקא מנגנוני lar שבבסיס phagocytosis של תאים אפופטוטיים הוא בעל חשיבות.

המנגנונים האחראים על phagocytosis של תאים אפופטוטיים נראה שימור evolutionally בין המינים של נמטודות, זבובים, ועכברים 7 . כמה מבחני phagocytosis זמינים כעת כדי להעריך את ההטיה של תאים אפופטוטיים אלה בעלי חיים מודל. ב C. elegans , 131 תאים סומטיים עוברים מוות התא מתוכנת במהלך הפיתוח, גופות תאים הם phagocytosed על ידי תאים סמוכים, אשר פגוציטס לא מקצועי 8 . לפיכך, ספירת מספר גופות תאים שנותרו ב C. elegans מציין את רמת phagocytosis ב vivo . על ידי חיפוש מוטציות nematode המציגות מספר גדל של תאים מתים, מספר גנים הדרושים phagocytosis זוהו ו מאופיינים גנטית 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Ex vivo phagocytosis מבחני עם phagocytes התרבות הראשית, בדרך כלל מקרופאגים, מנוצלים לעתים קרובות בעכברים. תאים אפופטוטיים מוכנים באמצעות שורות תאים כגון תאי Jurkat, והם מעורבים עם phagocytes הראשי. לאחר הדגירה במשך מספר שעות, את המספר הכולל של phagocytes ו phagocytes משתלט נספרים על מנת להעריך את רמת phagocytosis. כמו שינוי מתוחכם של שיטה זו, קבוצה של Nagata פיתחה assay vago vago vagocytosis לשעבר עם תאים להביע ICP עמיד ICP (מעכבת של DNase המופעל Caspase), שבו תאים אפופטוטיים לא עוברים פיצוץ DNA אפופטוטיים, אבל DNA הוא עדיין מתוחכם כאשר תאים הם phagocytosed. כאשר תאים אלה משמשים מטרות אפופטוטיים assay phagocytosis, רק ה- DNA של תאים אפופטוטיים אפוף הוא מקוטע, ומוכתמת על ידי TDT בתיווך DUTP סוף סוף תיוג (TUNEL). לכן, את leveL של תא אפופטוטי תא נמדדת על ידי ספירת אותות TUNEL בתערובת של phagocytes ותאים אפופטוטיים 13 .

ב ד melanogaster , phagocytes מקצועי בשם hemocytes, מקרופאגים תסיסנית , אחראים phagocytosis של תאים אפופטוטיים 14 , 15 . בנוסף מבחני phagocytosis מבחנה עם שורות תאים התרבות, ב vivo מבחני phagocytosis עם עוברי תסיסנית מלאים זמינים. עוברים תסיסנית הם כלי רב עוצמה לבחינת רמת התא אפופטוטיים תא כי תאים רבים עוברים אפופטוזיס והם phagocytosed על ידי hemocytes במהלך התפתחות עובריים 14 , 15 , 16 . דוגמה של vivo phagocytosis assay היא השיטה שפותחה על ידי הקבוצה של פרנק. בשיטה שלהם, hemocytes הם דההנגוע על ידי immunostaining של peroxidasin, סמן hemocyte, תאים אפופטוטיים מוכתמים באמצעות צבע גרעיני, 7-אמינו actinomycin D בכל עוברי תסיסנית , ומספר תאים חיוביים כפולים נספר כאות של phagocytosis 17 . דוגמה נוספת של assay phagocytosis על עוברים מבוסס על הרעיון של השיטה של ​​Nagata המתואר לעיל; עם זאת, in vivo phagocytosis מוערך באמצעות העוברים של dCAD (דרוזופילה caspase-מופעל DNase) זבובים מוטנטיים 18, 19. אלה מבחני phagocytosis vivo שימושיים עבור התבוננות ישירה phagocytosis באתרו . עם זאת, קשיים קשורים עם למעט כל הטיה אפשרית בשלב של ספירת תאים phagocytosing כי קשה לראות את כל phagocytes ותאים אפופטוטיים בעוברים שלמים בשל עובי שלה.

כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מפתחיםEd assay phagocytosis חדש בעוברים תסיסנית . בשיטה שלנו, על מנת לספור בקלות hemocytes phagocytosing, עוברים שלמים הם homogenized להכין תאים עובריים מפוזרים. Phagocytes מזוהים על ידי immunostaining של סמן phagocyte, ותאים אפופטוטיים מזוהים על ידי TUNEL עם תאים אלה עובריים מפוזרים. השימוש בתאים מפוזרים עובריים מאפשר לנו למדוד ברמות phagocytosis vivo כאילו בצענו assay phagocytosis במבחנה ב שדווקא מכמת את רמת phagocytosis. כל genotypes של זבובים ניתן להשתמש assay זה אם הם מתפתחים לשלב 16 של עוברי 20 , שלב התפתחותי שבו אפופטוזיה התא אישור על ידי phagocytosis הוא בשפע ביותר. שיטה זו יש את היתרון של הערכת רמת phagocytosis כמותית, ולכן, עשוי לתרום זיהוי של מולקולות חדשות המעורבים phagocytosis של תאים אפופטוטיים in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנה

  1. הכנת טריים ענבים אגר צלחות
    1. מוסיפים 100 מ"ל מים ל -4.4 גרם של אגר, ומחממים את התערובת בתנור מיקרוגל כדי לפזר אגר.
    2. הוסף 80 מ"ל של מיץ ענבים טריים, 5 מ"ל של חומצה אצטית, ו 5 מ"ל של אתנול לפתרון אגר.
    3. יוצקים כ 1.5 מ"ל של הפתרון עם פיפטה על כל שקופית זכוכית, ולאפשר לו לחזק.
  2. הכנת 6 ס"מ צלחות agarose צלחת
    1. מוסיפים 50 מ"ל מים ל 0.5 גרם של agarose, לחמם את התערובת בתנור מיקרוגל כדי להמיס agarose.
    2. יוצקים כ 2.5 מ"ל של תמיסת agarose על צלחת 6 ס"מ עם פיפטה.

2. שלב 16 אוסף העובר

  1. איסוף זבובים למבוגרים, ולהוסיף 200 נקבות ו 200 גברים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
  2. שים צלחת של אגר ענבים טריים על שמרים לתוך צינור 50 מ"ל, ולסגור עם ספוג ספוגעמ '
  3. דגירה זבובים ב 16 מעלות צלזיוס באור למשך 2-3 ימים. שנה את הצלחת פעם ביום.
  4. להעביר את הזבובים בחושך על 25 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
  5. לשנות את צלחת הישן אחד חדש ללא שמרים. אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 2 שעות.
  6. לאסוף את הצלחת דגירה על 16 מעלות צלזיוס במשך 26 שעות.
  7. איסוף העוברים מן הצלחת עם מברשת צבע לתוך 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100.
  8. לשטוף עוברי פעמיים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100.
  9. כדי להסיר את הסיסית, להוסיף 1.2 מ"ל של תמיסת hypochlorite נתרן (2.2 - 3.4% Cl) לעוברים במשך 3 דקות.
  10. לשטוף עוברי 4 פעמים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100.
  11. מקום עוברים על 6 ס"מ צלחות agarose צלחת. לאסוף שלב 16 עוברי תחת מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי רוברטס 20 . איסוף כ 50 עוברי ב 1.5-מ"ל Treff מיקרו צינור הבדיקה עם micropipette.

3. PrepaRation של תאים עובריים

  1. לשטוף עוברי פעמיים עם 150 μL של PBS.
  2. Homogenize עוברים 30 פעמים ב 1.5 מ"ל צינור בדיקה מיקרו מערבל גלולה בנוכחות μL 200 של collagenase (0.25% (w / v)) ב PBS.
  3. לפזר תאים עובריים ידי pipetting 10 פעמים, ולהזיז את ההשעיה התא לצינור 1.5 מ"ל. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות באמבט מים. חזור על פעולה זו פעמיים.
  4. הוסף 800 μL של PBS ההשעיה התא, צנטריפוגות ב 1400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. הסר את supernatant ולהוסיף 200 μL של טריפסין (0.25% (w / v)) ב PBS לתאים. לפזר תאים עובריים ידי pipetting 50 פעמים.
  6. תסנן את ההשעיה התא עם מסננת 70 מיקרומטר Cell.
  7. על מנת להפסיק פעילות trypsin, להוסיף 40 חום μL- חום מעובה בסרום שור עוית ​​ההשעיה תא מסוננים. הוסף 800 μL של PBS ו צנטריפוגות ב 1,400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  8. הסר את supernataNt, להשעות תאים זירז 200 μL של PBS, צנטריפוגות ב 1400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  9. הסר את supernatant, ו להשעות תאים זירז 30 μL של PBS.
  10. הר ההשעיה תא מוכן על aminopropyl triethoxysilane מצופה שקופיות זכוכית, ולחכות 10 - 15 דקות עד התאים לצרף את השקופיות זכוכית.
  11. הסר את הפתרון הנותר על שקופיות זכוכית עם פיפטה. הר 60 - 70 μL של PBS המכיל 4% (w / V) PFA (paraformaldehyde) על תאים 10 - 15 דקות עבור קיבעון.
  12. הסר את פתרון קיבוע, ומכניסים שקופיות זכוכית לתוך PBS במשך יותר מ 1 דקות.

4. מכתים של Hemocytes

  1. Immunostaining עם נוגדן אנטי Croquemort
    1. מקורית להשרות שקופיות זכוכית מתנול במשך 10 דקות, ב PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 במשך 10 דקות, ולאחר מכן ב- PBS במשך 10 דקות.
    2. הר 20 μL של 5% (V / V) בסרום חזיר שלם PBS containiNg 0.2% (v / v) Triton X-100 על תאים לחסימה. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. הסר את הפתרון מן שקופיות זכוכית, ועל הר 20 μL של antiserum אנטי Croquemort 19, 21 (0.1% (v / v)) ב PBS המכיל 0.2% (v / v) טריטון X-100 על תאים. דגירה שקופיות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים.
    5. ספוג שקופיות זכוכית PBS במשך 10 דקות.
    6. הר 20 μL של פוספטז אלקליין שכותרתו נגד עכברוש IgG (0.5% (v / v)) ב PBS המכיל 0.2% (v / v) טריטון X-100 ו 5% (v / v) בסרום חזיר שלם על תאים בחדר טמפרטורה עבור 1 שעות.
    7. להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים.
    8. להשרות שקופיות זכוכית במאגר המכיל 100 מ"מ Tris-HCl, pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, ו 50 מ"מ MgCl 2 במשך 10 דקות.
    9. הר תמיסת המצע phosphatase המכיל 0.23 מ"ג / מ"ל ​​5-bromo-4כלור-3-אינדוליל-פוספט (BCIP), 0.35 מ"ג / מ"ל ​​nitro כחול tetrazolium (NBT), 100 מ"מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, ו 50 מ"מ MgCl 2 על תאים.
    10. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עבור מכתים נכונה. כאשר אותות סגולים חזקים מופיעים גרגירים של hemocytes, להסיר את הפתרון המצע, ו להשרות שקופיות זכוכית במאגר המורכב 10 מ"מ טריס HCl, pH 8.5 ו 1 מ"מ EDTA. מכתים כ 5 - 10 דקות מומלץ.
  2. Immunostaining עם נוגדן אנטי GFP (אפשרות נוספת מכתים של hemocytes)
    1. Serial להשרות שקופיות זכוכית מתנול במשך 10 דקות, PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 במשך 10 דקות, ו PBS במשך 10 דקות.
    2. הר 20 μL של 5% (V / V) בסרום חזיר שלם PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 על תאים לחסימה. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. הסר את הפתרון על שקופיות זכוכית, ואת הר 20 μL של נוגדנים נגד נוגדנים GFP (1% (V / V)) / PBS געל 0.2% (v / v) טריטון X-100 על תאים. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    4. להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים.
    5. ספוג שקופיות זכוכית PBS במשך 10 דקות.
    6. הר 20 μL של הפוספטאז אלקליין שכותרתו נגד עכבר IgG (0.5% (V / V)) ב PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 ו 5% (V / V) סרום חזיר שלם על תאים בחדר טמפרטורה עבור 1 שעות.
    7. להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים.
    8. להשרות שקופיות זכוכית במאגר המורכב 100 מ"מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, ו 50 מ"מ MgCl 2 במשך 10 דקות.
    9. הר הפתרון phosphatase המצע המכיל 0.23 מ"ג / מ"ל ​​BCIP, 0.35 מ"ג / מ"ל ​​NBT, 100 מ"מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, ו 50 מ"מ MgCl 2 על תאים.
    10. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עבור מכתים נכונה. כאשר אותות סגולים מופיעים hemocytes שלם, להסיר את הפתרון המצע ולספוג שקופיות במאגר המורכבשל 10 מ"מ Tris-HCl, pH8.5 ו 1 מ"מ EDTA. מכתים כ 10 - 15 דקות מומלץ.

5. כתם תאים אפופטוטיים על ידי TUNEL

  1. לשטוף שקופיות זכוכית PBS במשך 5 דקות.
  2. חזור עם PBS חדש.
  3. הר חיץ איזון (ראה חומרים לוח) על תאים במשך 10 דקות.
  4. הסר את הפתרון משקופיות זכוכית, ואת הר 20 μL של פתרון TdT המכיל 5 μL של טרנזיט deoxynucleotidyl מסוף ו 15 μL של תגובה למאגר על תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
  5. הסר את הפתרון משקופיות זכוכית, ולספוג שקופיות במאגר המורכב של 0.5 מ"ל STOP / לשטוף חיץ ו 17 מ"ל של מים.
  6. משרים שקופיות PBS במשך 5 דקות 3 פעמים.
  7. הר 20 μL של אנטי Digoxigenin-peroxidase על תאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  8. לשטוף שקופיות זכוכית PBS במשך 5 דקות 4 פעמים.
  9. להשרות שקופיות זכוכית תמיסת המצע peroxidase בהיקף של 30 מ"ל של 50 מ"מ טריס HCl, pH7.5 מכיליםGa מלא spatula מיקרו של 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB), ו 0.002% (v / v) H 2 O 2 במשך 30 s.
  10. חזור על שלב 5.9 עד תאים אפופטוטיים מוכתמים חום. השריה שקופיות זכוכית במים כדי לעצור את התגובה peroxidase.
  11. צרף תאים עם מים לתצפית.

6. למדוד את רמת phagocytosis של תאים אפופטוטיים

  1. לבחון דגימות תחת מיקרוסקופ אור על מנת להעריך את רמת phagocytosis. Count Crocemort חיובי תאים או תאים GFP חיובי כמו hemocytes, תאים TUNEL חיובי כמו תאים אפופטוטיים, ותאים חיוביים כפול כמו hemocytes phagocytosing.
  2. מדד phagocytic מוגדר כמספר תאים חיוביים כפול למספר הכולל של תאים חיוביים Croquemort או תאים חיוביים GFP. מומלץ כי יותר מ 300 hemocytes הם נצפו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

על מנת לבחון את phagocytosis של תאים אפופטוטיים, עוברים תסיסנית של שלב 16 ההתפתחותי נאספו והוכנו כמו תאים מפוזרים. Hemocytes, מקרופאגים תסיסנית , היו מוכתמים על ידי immunocytochemistry עבור סמן hemocyte "Croquemort" 17 , 22 באמצעות נוגדנים ספציפיים 19 , 21 , תאים אפופטוטיים הוכתמו על ידי TUNEL בתאי עובריים מפוזרים ( איור 1 א ). Croquemort, קולטן תסיסנית CD36 הקשורות, באה לידי ביטוי ספציפי על כל hemocytes עובריים 22 , ו הוכח גנטית להיות מעורב בסילוק תאים אפופטוטיים עוברים תסיסנית 17 . לתאים חיוביים ל- Croquemort יש אותות סגולים בגרגרים הקטנים של התאים שלהם. תאי TUNEL חיובי להראות abאות רוני בגופות שלמות. תאי TUNEL חיובי הם קטנים יותר מאשר תאים אחרים, וחלקם בתוך תאים חיוביים Croquemort, אשר נחשבים תאים phagocytosed מת. בין 2 ל 10% תאים Crocemort חיובי 1 - 5% תאים TUNEL חיובי נצפים בדרך כלל בכל התאים עובריים.

ב תסיסנית , ישנם שני מסלולים איתות עבור ההטיה של תאים אפופטוטיים. שני קולטני phagocytosis עבור המסלולים המתאימים, Draper ו integrin α PS3 β ν, לזהות באופן עצמאי תאים מתים 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper הוא חלבון טרנסממברני אשר בעל גורם טיפוס אפידרמיס לא טיפוסית (EGF) כמו רצפים באזור תאיים ואת שני מוטיבים phosphorylatable NPxY ו YxxL ב iחלק ntracellular 26 . אינטגרין α PS3 β ν הוא גם קולטן טרנסממברני המורכב heterodimer של α β יחידות משנה 25 . איור 1B מראה את היחס בין hemocytes phagocytosing כדי hemocytes הכולל wild-type או דפר או Itgbn עוברים מוטציה אחת. על ידי ספירה של כל התאים החיוביים של Croquemort (hemocytes סך) ו Croquemort ו- TUNEL פעמיים תאים חיוביים (hegocytes phagocytosing), חישבנו את המדד phagocytic כמספר phococytosing hemocytes למספר הכולל של hemocytes. מדד phagocytic היה נמוך יותר ב drper או איגבן מוטציה מאשר בסוג בר, בעוד המספרים של hemocytes ותאי אפופטוטיים היו דומים ( איור 1C- D ), המציין כי שני גנים אלה נדרשים עבור אפופטוטיים תא בולע, כמו בעבר rיפורט.

כאשר נוגדן אנטי Croquemort אינו זמין או שורות מוטציה עם ביטוי Croquemort שונה נבדקים, אנחנו צריכים לבחור אפשרות אחרת כדי לזהות hemocytes. עוברים עם הנהג GAL4 נשלט על ידי האמרגן ספציפי hemocyte ( srpHemo-GAL4 ), ואת הגן GFP הנשלט על ידי רצף ההפעלה במעלה (UAS) כולל האתר GAL4 מחייב ( UAS-EGFP ), יש GFP שכותרתו hemocytes 27 , אשר מאפשר לנו לזהות hemocytes באמצעות אנטי GFP. איור 2 א מראה תמונה המתקבל לאחר גילוי hemocytes ותאי אפופטוטיים עם immunostaining באמצעות נוגדן אנטי GFP, ו TUNEL בתאי עובריים עם srpHemo-GAL4UAS-EGFP . בעוד נוגדן אנטי Croquemort כתמים גרגירים קטנים בתאים, אנטי-נוגדן כתמי נוגדן GHE כל hemocytes. בדומה לתרשים 1A , 2 - 6% תאים GFP חיובי 1 - 5% TUNEL חיובי תאים נצפים בכל התאים עובריים. כמה תאים חיוביים TUNEL מזוהים בתוך תאים חיוביים GFP, אשר נחשבים תאים phagocytosed מת. RNAi בתיווך מציאה מוחל בקלות להעריך גנים עבור המעורבות שלהם phagocytosis על ידי מעבר זבובים עם UAS-dsRNA של הגנים המועמדים עם srpHemo-GAL4UAS-EGFP . RNAi בתיווך מציאה של דפר או Itgbn הפחית את המדד phagocytic ( איור 2 ב ), ואילו המספרים של hemocytes ותאים אפופטוטיים בתאים עובריים היה דומה ( איור 2C -2D ), מה שמעיד שוב כי קולטנים אלה phagocytosis מעורבים phagocytosis של תאים אפופטוטיים. מדדים phagocytic דומים מתקבלים הן שיטות זיהוי hemocyte, דבר המצביע על שניהם תואמים.

G "/>
איור 1 : מכתים של תאים עובריים על ידי נוגדן אנטי Croquemort ו TUNEL. ( א ) תמונות שדה בהיר של תאים עובריים מפוזרים מן זן 1118 w על ידי immunostaining עם נוגדן אנטי Croquemort ו TUNEL. תצוגות מוגדלות של תאים מייצגים חיובי או שלילי מוכתם (העליון 4 פאנלים) ושדה מתח נמוך (הפאנל התחתון) מוצגים. סולם ברים, 5 מיקרומטר (למעלה); 50 מיקרומטר (תחתית). ( ב ) היחס בין hemocytes חיובי Croquemort עם האות TUNEL לכל hemocytes חיובי Croquemort ב drper או מוטבן mutgort נותח עם תאים עובריים מפוזרים. ( ג ) היחס של hemocytes חיובי Croquemort לכל התאים של דפר או מוטציה Itgbn נותח עם תאים עובריים מפוזרים. ( D ) היחס בין תאים אפופטוטיים חיוביים TUNEL לכל התאים בדפר אומוטציה זו נבדקה עם תאים עובריים מפוזרים. גנוטיפים; W 1118 (wild-type control), drper Δ5 (מוטציה drper ), ו Itgbn 2 (integrin β ν מוטציה). נתונים היו נציג של שלושה ניסויים עצמאיים ונותחו על ידי -test t של הסטודנט. כ -300 hemocytes חיובי Croquemort נצפו בכל ניסוי, והערכים מייצגים את הממוצע ± SD של שלושה שדות מיקרוסקופיים. * עמ ' <0.05, ns; ההבדל לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מכתים של תאים עובריים על ידי נמלהI-GFP ו TUNEL. ( א ) תמונות שדה בהיר של תאים עובריים מפוזרים מן הזרע srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + על ידי immunostaining עם נוגדן אנטי GFP ו TUNEL. תצוגות מוגדלות של תאים מייצגים חיובי או שלילי מוכתם (העליון 4 פאנלים) ושדה מתח נמוך (הפאנל התחתון) מוצגים. סולם ברים = 5 מיקרומטר (למעלה); 50 מיקרומטר (תחתית). ( ב ) היחס של hemocytes חיובי GFP עם האות TUNEL לכל hemocytes חיובי GFP ב RNAi בתיווך זבובים מכה של drper או Itgbn נותח עם תאים עובריים מפוזרים. ( ג ) היחס של hemocytes חיובי GFP לכל התאים RNAi בתיווך זבובים מכה של drper או Itgbn נותח עם תאים עובריים מפוזרים. ( ד ) היחס בין תאים אפופטוטיים חיוביים TUNEL לכל התאים זבובים זיקוק RNAi בתיווך של דפר או Itgbn נותח עם תאים עובריים מפוזרים. גנוטיפים; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . נתונים היו נציג של שלושה ניסויים עצמאיים ונותחו על ידי -test t של הסטודנט. כ -300 hemocytes חיובי GFP נצפו בכל ניסוי, והערכים מייצגים את הממוצע ± SD של שלושה שדות מיקרוסקופיים. * P <0.05, ns; ההבדל לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנו כאן תיאר assay phagocytosis באמצעות עוברים תסיסנית . על ידי שימוש בתאים עובריים מפוזרים למדוד phagocytosis כמותית, hemocytes, phagocytes מקצועי תסיסנית , הם immunostained עבור סמן hemocyte Croquemort או srpHemo מונע GFP, תאים אפופטוטיים מזוהים על ידי TUNEL בפרוטוקול זה. רמת phagocytosis מתבטא כמו אינדקס phagocytic על ידי ספירת המספר הכולל של hemocytes ו hegocytes phagocytosing. השימוש בתאים עובריים מפוזרים מאפשר לנו לבחון את כל phagocytes ותאים אפופטוטיים בעוברים שלמים כדי לכמת במדויק את רמת phagocytosis. בנוסף, השיטה שלנו מזהה hemocytes ותאים אפופטוטיים עם צבעים נצפים תחת מיקרוסקופ אור, לא מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מקל על הערכה של רמות phagocytosis כי ניתן לצפות hemocytes ותאים אפופטוטיים בו זמנית ללא שינוי כל מסנן.

"הנקודות הבאות הן קריטיות עבור מכתים תאים עובריים.בשלב קיבעון של תאים עובריים, PFA טרי מוכן בתוך שבועיים צריך להיות בשימוש.ב immunostaining של Croquemort, הדגירה של תאים עם anti-Croquemort צריך להתבצע ב 4 ° C. מכתים TUNEL, הדגירה של תאים עם DAB צריך להתבצע על ידי בדיקה בקפידה תחת מיקרוסקופ כדי למנוע מכתים מוגזמת.מודל מדמיין DNA מקוטעת על ידי זיהוי 3'-OH, אשר שופע תאים אפופטוטיים.עם זאת, לתאים נורמליים יש גם 3'-OH במסוף ה- DNA של 3 ', אבל ברמה נמוכה יותר מזה בתאים אפופטוטיים, ולכן דגירה של תאים עם DAB למשך זמן רב לא תכתים לא רק תאים אפופטוטיים, אלא גם תאים נורמליים התצפית של תאים בכל 15 או 30 s במהלך מכתים DAB מומלץ למנוע זאת.

בפרוטוקול זה, למרות כימות של רמת phagocytosis הוא מהיר ומדויק, כמה מידע suCh כמו האתר של engulfment או הפצה של hemocytes הוא איבד. הראינו בעבר כי assay זה assay phagocytosis באתרו באמצעות עוברים שלמים הפיק תוצאות דומות במונחים של המדד phagocytic 21 . לכן, אנו ממליצים לבצע assay phagocytosis באתרו במקביל על מנת לפרש במדויק את התוצאות שהתקבלו במקרים מסוימים.

תסיסנית יש עוד phagocyte מקצועי, תאים גליה, במערכת העצבים המרכזית. למרות שאנו לא מתארים כיצד להעריך את phagocytosis של נוירונים אפופטוטיים על ידי תאים גליה בעוברים בפרוטוקול זה, פרוטוקול זהה מוחל לכמת את רמת engulfment כפי שדווח על ידי Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . כמו כן, assay זה מציע כי תאים חיוביים TUNEL בעוברים תסיסנית צפויים להיות phagocytosed על ידי phagocytes שאינם מקצועיים. Phagocytosis על ידי אלה ph מזוהיםAgocytes עם קולטני ההבלטה לא ידוע עשוי להסביר את התוצאה ( איור 1D ) כי המספר הכולל של תאים אפופטוטיים בתאים עובריים נראה לא להיות גדל מוטציה הגן phagocytosis.

לסיכום, פרוטוקול זה הוביל בהצלחה לגילוי של גנים הדרושים phagocytosis של תאים אפופטוטיים על ידי phagocytes מקצועי. 24 , 25 , 28 . בהתבסס על שימור אבולוציוני של המנגנונים המולקולריים שבבסיס phagocytosis 7 , גילוי פונקציות הגן בעוברים תסיסנית המערבים תגובות phagocytosis מורכבים עשויים לספק תובנות משמעותיות לתוך פינוי phagocytic של תאים מתים, אשר קשורה להפרעות דלקתיות ומחלות אוטואימוניות אצל יונקים 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים Kaz Kazaosa ו Akiko Shiratsuchi על עצתם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter