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Immunology and Infection

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

Abstract

세포 사멸 세포의 탐식 작용을하는 분자 기작은 면역 및 염증성 난치병에서의 역할 때문에 더 자세하게 밝혀야한다. 우리는 여기에 과일 파리 Drosophila를 사용하여 정량적으로 식균 작용을 조사하는 실험적 방법을 개발했다.이 방법은 삼투 반응을 조절하는 유전자 네트워크가 포유 동물로부터 진화 적으로 보존되어있다. 전체 동물을 사용하여 삼투 및 삼투 식각 세포를 정확하게 검출하고 계산하기 위해 Drosophila 배아를 균질화하여 식균 및 아폽토시스 세포를 포함한 분산 된 세포를 얻었다. 분산 된 배아 세포의 사용은 마치 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하고 식균 작용의 수준을 정량화 할 수 있는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. 이 방법이 이전 연구의 결과를 재현한다는 것을 확인했습니다.apoptotic 세포의 phagocytosis에 필요한 유전자를 확인했다. 이 방법은 죽은 세포의 삼투를 분석하고, 강력한 유전학 인 Drosophila 와 결합하면 식세포에 의한 세포 사멸 (apoptotic) 세포의 이동, 인식, 삼투 및 분해로 구성된 복잡한 식균 반응을 나타냅니다.

Introduction

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예를 들어 선충류 Caenorhabditis elegans , 초파리 Drosophila melanogaster 및 생쥐와 인간과 같은 전이 동물의 경우 많은 수의 세포가 발달 중에 체내를 형성하고 성인기에 항상성을 유지하기 위해 세포 사멸을 경험합니다 1 , 2 . 세포 사멸 세포는 완전히 제거되지 않으면 면역 원성 세포 내 물질을 방출하여 주변 조직에 염증을 유도하기 때문에 신속하게 제거해야합니다 3 . 신속한 제거를 촉진하기 위해 세포 사멸 세포는 식세포의 삼투 수용체에 의해 인식되고 식균 작용에 의해 제거되는 소위 먹기름 신호를 나타냅니다 3 , 4 , 5 , 6 . 따라서, 식균 작용은 숙주 항상성의 유지에 결정적인 역할을하므로, apoptotic 세포의 phagocytosis의 밑에 lar 기계 장치는 중요하다.

세포 사멸 세포의 식균 작용을 담당하는 메커니즘은 진화 적 선충, 초파리, 생쥐 7 종에 보존 한 것으로 나타났습니다. 여러 가지 식균 작용 분석법이 현재이 모델 동물에서 사멸 세포의 웅덩이를 평가하기 위해 이용 가능하다. C. 엘레 간스 에서 131 체세포는 발달 중에 프로그램 된 세포 사멸을 겪고 세포 시체는 비 전문적인 식세포 8 인 이웃 세포에 의해 탐식된다. 따라서, C. elegans 의 잔류 세포 시체 수를 세는 것은 생체 내에서 의 식균 작용의 정도를 나타낸다 . 증가 된 사멸 세포 수를 나타내는 선충 돌연변이를 탐색함으로써, 식균 작용에 필요한 여러 유전자가 동정되었고 유전 학적으로 9 , 10 ,s = "xref"> 11 , 12 .

일차 배양 식세포, 일반적으로 대 식세포를 사용한 생체 외 탐식 작용은 마우스에서 종종 이용된다. 아폽토시스 (apoptotic) 세포는 Jurkat 세포와 같은 세포주를 사용하여 준비되며 1 차 식균과 혼합됩니다. 수 시간 동안 배양 한 후, 식균 작용의 수준을 평가하기 위해 식세포와 삼투 식세포의 총 수를 세었다. 이 방법을 정교하게 변형시킨 Nagata의 연구팀은 apoptotic cell이 apoptotic DNA 단편화를 일으키지 않고 caspase-resistant ICAD (caspase-activated DNase의 억제제)를 발현하는 세포를 이용한 ex vivo 식균 작용 분석을 개발했다. 세포는 식균된다. 이러한 세포가 식균 작용 분석에서 세포 사멸 목표로 사용될 때, 삼투 된 세포 사멸 세포의 DNA 만 단편화되고 TdT 매개 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)에 의해 염색된다. 따라서,사멸 세포의 말림 (L)는 식세포 사멸 세포 및 13의 혼합물 TUNEL 신호를 카운트함으로써 측정된다.

D. melanogaster에서 , hemocytes, Drosophila macrophages라는 전문 식세포가 세포 사멸 세포의 탐식 작용을 담당합니다 14 , 15 . 배양 세포주를 이용한 in vitro phagocytosis assay 더하여, 전체 Drosophila 배아를 이용한 in vivo phagocytosis assay가 가능합니다. 초파리 배아는 많은 세포가 사멸을 받아야하고 배아 발달 14, 15, 16시 혈구에 의해 포식하기 때문에 세포 사멸 세포 말림의 수준을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 생체 내 식균 작용의 예는 프랑 그룹이 개발 한 방법입니다. 그들의 방법에서는, hemocytes는이다 deperoxidasin, 혈구 마커의 면역 염색에 의해 tected, 사멸 세포는 핵 염색 전체 초파리 배아 티노 마이신 D (7) 아미노산을 이용하여 염색하고, 이중 양성 세포의 수는 탐식 (17)의 신호로 간주된다. 배아에 대한 식균 작용 분석의 또 다른 예는 위에 기술 된 Nagata의 방법의 개념에 기초한다. 그러나, 생체 내 식균 작용은 dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) 돌연변이 파리 18 , 19 의 배아를 사용하여 평가됩니다. 이러한 in vivo phagocytosis assay는 in situ에서 phagocytosis를 직접 관찰하는데 유용합니다. 그러나, 어려움은 식균 세포를 계수하는 단계에서 가능한 모든 편향을 배제하는 것과 관련이 있는데, 그 이유는 그것의 두께로 인해 전체 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하기가 어렵 기 때문이다.

이 한계를 극복하기 위해 우리는Drosophila 배아에서 새로운 식균 작용을 분석했다. 우리의 방법에서는 식균 가능한 혈구를 쉽게 계산하기 위해 전체 배아를 균질화하여 분산 된 배아 세포를 준비한다. 식세포는 식세포 마커의 면역 염색에 의해 검출되며, 아폽토시스 세포는 이들 배아 세포가 분산 된 TUNEL에 의해 검출된다. 분산 된 배아 세포의 사용은 우리가 정확하게 식세포 증의 수준을 정량화하는 시험 관내 식균 작용을 수행하는 것처럼 생체 내 식균 작용 수준을 측정 할 수있게한다. phagocytosis에 의한 세포 사멸 (apoptotic cell clearance)이 가장 많은 발달 단계 인 배아 20의 16 단계로 발전하면 파리의 모든 유전형이이 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 식균 작용의 양을 정량적으로 평가할 수있는 장점이 있어 생체 내 apoptotic 세포의 식균 작용에 관여하는 새로운 분자의 동정에 기여할 수있다.

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Protocol

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1. 준비

  1. 신선한 포도 주스 한천 접시 준비
    1. 한천 4.4g에 물 100mL를 넣고 전자 레인지로 가열하여 한천을 녹인다.
    2. 한천 용액에 신선한 포도 주스 80 mL, 아세트산 5 mL 및 에탄올 5 mL를 넣는다.
    3. 각 유리 슬라이드 위에 피펫으로 약 1.5 mL의 용액을 부어 응고시킵니다.
  2. 6 cm 접시 아가로 오스 플레이트 준비
    1. 아가로 오스 0.5g에 물 50mL를 넣고 전자 레인지로 혼합물을 가열하여 아가 로스를 녹인다.
    2. 피펫으로 6cm 요리에 약 2.5 ML 아가로 오스 솔루션을 부어.

2. 단계 16 태아 수집

  1. 성인 파리를 모으고, 50 mL 원뿔 튜브에 200 명의 암컷과 200 마리의 수컷을 추가하십시오.
  2. 효모에 신선한 포도 주스 한천 한 접시를 50 ML 튜브에 넣고 스폰지 CA와 함께 닫습니다피.
  3. 2 ~ 3 일 동안 16 ° C에서 파리를 품어줍니다. 접시를 하루에 한 번씩 교체하십시오.
  4. 파리를 25 ° C에서 1 시간 동안 어둠으로 이동시킵니다.
  5. 오래된 접시를 효모가없는 새 접시로 바꾸십시오. 파리가 2 시간 동안 알을 낳도록하십시오.
  6. 플레이트를 수집하고 26 ° C에서 16 ° C로 배양하십시오.
  7. 0.2 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS 1 ML에 페인트 브러시로 접시에서 배아를 수집합니다.
  8. 0.2 % (브이 / 브이) 트리톤 X - 100을 포함하는 1 ML PBS로 배를 씻으십시오.
  9. chorion을 제거하기 위해 차아 ​​염소산 나트륨 용액 (2.2 ~ 3.4 % Cl) 1.2 mL를 3 분간 배양합니다.
  10. 0.2 % (브이 / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 1 ML PBS로 4 번 배아를 씻으십시오.
  11. 6cm 접시 아가로 오스 판에 배아를 놓습니다. 로버트 20에 설명 된대로 현미경으로 무대 16 태아를 데리러. micropipette 1.5 ML Treff 마이크로 테스트 튜브에 약 50 개의 배아를 수집합니다.

3. 준비배아 세포의 배급

  1. PBS 150 μL로 배아를 두 번 씻으십시오.
  2. PBS에 collagenase (0.25 % (w / v)) 200 μL의 존재에 1.5 ML 마이크로 테스트 튜브와 펠렛 믹서에 30 배를 균질.
  3. 10 배 pipetting하여 배아 세포를 분산하고, 1.5 ML 튜브에 세포 현탁액을 이동하십시오. 37에서 세포를 품어 ° C. 수 분이 1 분. 이 단계를 두 번 반복하십시오.
  4. 세포 현탁액에 PBS 800 μL를 추가하고 1400 X g 에서 원심 분리 4 ° C 5 분.
  5. 뜨는을 제거하고 세포에 PBS에서 트립신 (0.25 % (W / V)) 200 μL를 추가합니다. 50 배 pipetting하여 배아 세포를 분산시킵니다.
  6. 70 μm Cell Strainer로 세포 현탁액을 여과합니다.
  7. 트립신 활동을 중지하려면 여과 된 세포 현탁액에 열 불 활성화 된 태아 소 혈청 40 μL를 첨가합니다. PBS 800 μL를 첨가하고 1,400 x g 에서 4 분간 원심 분리하십시오 (5 분).
  8. 슈퍼 맵 삭제PBS 200 μL에 침전 된 세포를 정지시키고 4 ℃에서 1400 x g 에서 5 분간 원심 분리한다.
  9. 뜨는을 제거하고 PBS 30 μL에 침전 세포를 일시 중지합니다.
  10. 아미노 프로필 triethoxysilane - 코팅 유리 슬라이드에 준비 세포 현탁액을 탑재하고 세포가 유리 슬라이드에 첨부 할 때까지 10-15 분 기다립니다.
  11. 피펫으로 유리 슬라이드에 남아있는 솔루션을 제거합니다. PFA (파라 포름 알데히드) 4 % (w / v)를 함유 한 PBS 60 ~ 70 μL를 세포에 고정시킵니다.
  12. 고정 솔루션을 제거하고 1 분 이상 동안 PBS에 유리 슬라이드를 놓으십시오.

4. 혈구의 염색

  1. 항 Croquemort 항체로 면역 염색
    1. 10 분 동안 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에서 10 분 동안 10 분 동안 메탄올에서 글라스 슬라이드를 적신 다음, 10 분 동안 PBS에서 슬라이드시킨다.
    2. PBS containi에있는 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청 20 μL를 넣습니다.블로킹을 위해 0.2 % (v / v) 트리톤 X-100 세포에. 슬라이드를 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
    3. 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고 세포에 0.2 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 PBS에 안티 Croquemort 항혈청 19 , 21 (0.1 % (V / V)) 20 μL를 탑재. 슬라이드를 4 ° C에서 밤새 품어주십시오.
    4. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
    5. 유리를 PBS에 10 분 동안 담근다.
    6. 0.2 % (v / v) Triton X-100 및 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청을 함유 한 PBS에 알칼라인 포스파타제로 표지 된 항 - 랫트 IgG (0.5 % (v / v) 1 시간 동안 온도.
    7. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
    8. 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl 2 를 함유하는 완충액에서 10 분 동안 유리 슬라이드를 적시십시오.
    9. 0.23 mg / mL 5- 브로 모 -4를 함유하는 포스 파타 아제 기질 용액(BCIP), 0.35 mg / mL nitro blue tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl 2 를 세포에 첨가하여 항온 배양 하였다.
    10. 현미경으로 세포를 관찰하여 적절한 얼룩이 있는지 확인하십시오. hemocytes의 과립에 강한 보라색 신호가 나타날 때, 기판 솔루션을 제거하고 10 MM Tris-HCl, 산도 8.5 및 1 MM EDTA로 구성된 버퍼에 유리 슬라이드를 담가. 약 5 ~ 10 분 동안 염색하는 것이 좋습니다.
  2. 항 GFP 항체 (hemocytes의 얼룩에 대한 또 다른 옵션)와 Immunostaining
    1. 10 분 동안 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유하는 PBS를 10 분 동안 메탄올에 유리 슬라이드를 적시고, 10 분 동안 PBS를 적신 다음, PBS를 10 분 동안 적시십시오.
    2. 블로킹을 위해 세포에 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유 한 PBS에 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청 20 μL를 넣습니다. 슬라이드를 20 분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
    3. 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고, 마우스 anti-GFP 항체 (1 % (브이 /)) / PBS C의 20 μL를 탑재세포에 0.2 % (v / v) Triton X-100을 함유하고있다. 슬라이드를 밤새 상온에서 인큐베이션하십시오.
    4. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
    5. 유리를 PBS에 10 분 동안 담근다.
    6. 0.2 % (v / v) Triton X-100 및 5 % (v / v) 전체 돼지 혈청을 함유 한 PBS에 알칼라인 포스파타제 표지 항 마우스 IgG (0.5 % (v / v) 1 시간 동안 온도.
    7. 0.2 % (V / V) Triton X - 100을 포함하는 PBS에 유리 슬라이드를 10 분간 5 번 담근다.
    8. 100mM Tris-HCl, pH 9.5, 100mM NaCl 및 50mM MgCl 2 로 이루어진 완충액에서 10 분 동안 유리 슬라이드를 적시십시오.
    9. 0.23 mg / ml BCIP, 0.35 mg / mL NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl 2가 함유 된 포스파타제 기질 용액을 세포에 올려 놓습니다.
    10. 현미경으로 세포를 관찰하여 적절한 얼룩이 있는지 확인하십시오. 보라색 신호가 전체 hemocytes에 나타나면, 기판 솔루션을 제거하고 구성된 버퍼에 슬라이드를 담그다10mM 트리스 -HCl, pH8.5 및 1mM EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 인 방법. 약 10 ~ 15 분 동안 염색하는 것이 좋습니다.

5. TUNEL에 의한 세포 사멸 세포의 얼룩

  1. 유리를 PBS에 5 분 동안 담근다.
  2. 새로운 PBS로 반복하십시오.
  3. 10 분 동안 세포에 평형 완충액 (재료 표 참조)을 놓습니다.
  4. 유리 슬라이드에서 솔루션을 제거하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 세포 5 ML의 터미널 deoxynucleotidyl transferase 및 15 μL의 반응 버퍼를 포함하는 TdT 솔루션 20 μL를 탑재.
  5. 유리 슬라이드에서 용액을 제거하고 0.5 ML 중지 / 세척 버퍼와 물 17 ML로 구성된 버퍼에 슬라이드를 담그십시오.
  6. 슬라이드를 5 분 동안 PBS에 3 회 담그십시오.
  7. 30 분 동안 상온에서 세포에 20 μL의 Anti-Digoxigenin-Peroxidase를 넣는다.
  8. 유리를 PBS에 5 분 동안 4 회 담근다.
  9. 50mM Tris-HCl, pH7.5 함유 물 30 mL로 이루어진 퍼 옥시다아제 기질 용액에 유리 슬라이드를 담근다.3,3'- diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB) 및 0.002 % (v / v) H 2 O 2의 전체 마이크로 주걱을 30 초간 처리 하였다.
  10. apoptotic 세포가 갈색 얼룩 때까지 단계 5.9를 반복합니다. 유리를 물에 담그면 퍼 옥시다아제 반응이 멈 춥니 다.
  11. 관찰을 위해 세포를 물로 둘러 쌉니다.

6. Apoptotic 세포의 Phagocytosis의 수준을 측정

  1. phagocytosis의 수준을 평가하기 위해 샘플을 가벼운 현미경으로 관찰하십시오. Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포를 hemocytes로, TUNEL 양성 세포를 세포 사멸 세포로, double positive 세포를 탐식하는 혈구로 계산하십시오.
  2. 식균 지수는 Croquemort 양성 세포 또는 GFP 양성 세포의 총 수에 대한 이중 양성 세포의 수로 정의됩니다. 300 개 이상의 hemocytes가 관찰되는 것이 좋습니다.

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Representative Results

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apoptotic 세포의 식균 작용을 조사하기 위해 발달 단계의 Drosophila 배아를 모아서 분산 세포로 만들었다. Hemocytes, Drosophila macrophages는 특정 항체 19 , 21을 사용하여 hemocyte 마커 "Croquemort" 17 , 22에 대한 면역 세포 화학 검사로 염색되었으며, apoptotic 세포는 분산 배아 세포 ( 그림 1A )에서 TUNEL로 얼룩이지게되었다. Croquemort, 초파리 CD36과 관련된 수용체, 특히 모든 배아 혈구 세포 (22) 상에 표시되며, 유전 초파리 배아 17 사멸 세포의 간극에 관여하는 것으로 밝혀졌다. Croquemort 양성 세포는 세포의 작은 입자에 자주색 신호를 보입니다. TUNEL 양성 세포는 ab를 나타낸다.전체 corpuses에 rown 신호. TUNEL 양성 세포는 다른 세포보다 작고, 일부는 Croquemort 양성 세포 내에 있으며, 이들은 식균 된 죽은 세포로 간주됩니다. 2 ~ 10 %의 Croquemort 양성 세포와 1 ~ 5 %의 TUNEL 양성 세포가 모든 배아 세포에서 정상적으로 관찰됩니다.

Drosophila 에서는 apoptotic 세포의 engulfment에 대한 두 가지 신호 경로가 있습니다. Draper와 integrin α PS3 β ν는 각각 19 번 , 21 번 , 23 번 , 24 번 , 25 번에 해당하는 경로에 대한 두 개의 탐식 세포 수용체를 인식합니다. 드레이퍼 (Draper)는 세포 외 영역에 비정형 상피 성장 인자 (EGF) 유사 서열을 보유하고, i 세포 내에서 두 개의 인산화 가능한 모티프 인 NPxY 및 YxxL을 보유하는 트랜스 멤브레인 단백질이다세포 외 부분 ( 26) . Integrin α PS3 β ν는 αβ subunits의 heterodimer로 구성된 막 관통 수용체이기도합니다 25 . 그림 1B 는 야생 형 또는 drpr 또는 Itgbn 단일 돌연변이 배아의 총 hemocytes에 phagocytosing hemocytes의 비율을 보여줍니다. 모든 Croquemort 양성 세포 (총 hemocytes) 및 Croquemort 및 TUNEL 이중 양성 세포 (phagocytosing hemocytes)를 계산하여, 우리는 hemocytes의 총 수에 phagocytosing hemocytes의 숫자로 phagocytic 색인을 계산했습니다. 식염수 지수는 야생형보다 drpr 또는 Itgbn 돌연변이에서 더 낮았고 hemocytes와 apoptotic 세포의 수는 비슷했다 ( 그림 1C- D ). 이는 두 가지 유전자가 apoptotic cell engulfment에 필요하다는 것을 나타낸다.eported.

Anti-Croquemort 항체가 이용 가능하지 않거나 변경된 Croquemort 발현을 갖는 돌연변이 선을 검사 할 때, 우리는 hemocytes를 검출하기위한 또 다른 선택을 할 필요가있다. hemocyte-specific promoter ( srpHemo-GAL4 )에 의해 제어되는 GAL4 드라이버와 GAL4 결합 부위 ( UAS-EGFP )를 포함하는 상향 활성화 시퀀스 (UAS)에 의해 제어되는 GFP 유전자를 가진 태아는 GFP- 표지 된 hemocytes 27 , 이는 우리가 anti-GFP를 사용하여 hemocytes를 감지 할 수있게 해줍니다. 도 2a 는 항 -GFP 항체를 사용하여 면역 염색으로 혈구 및 아폽토시스 세포를 검출 한 후 얻은 이미지 및 srpHemo-GAL4UAS-EGFP를 갖는 배아 세포에서 TUNEL을 나타낸 것이다. 항 Croquemort 항체가 세포에서 작은 과립을 얼룩지게하는 동안, 항 -GFP 항체는 전체 혈구를 얼룩지게합니다. 도 1A 와 유사하게, 2-6 %의 GFP- 양성 세포 및 1-5 %의 TUNEL- 양성 세포 세포는 모든 배아 세포에서 관찰된다. 일부 TUNEL 양성 세포는 GFP 양성 세포 내에서 검출되며, 이는 식균 된 죽은 세포로 간주됩니다. RNAi 매개 녹다운은 srpHemo-GAL4UAS-EGFP로 후보 유전자의 UAS-dsRNA와 파리를 교차시킴으로써 식균 작용에 관여하는 모든 유전자를 평가하는 데 쉽게 적용됩니다. RNAi를 매개로 한 drpr 또는 Itgbn의 knockdown은 phagocytic index를 감소 시켰지만 ( 그림 2B ), 배아 세포의 세포 수와 apoptotic 세포 수는 비슷했다 ( 그림 2C -2D ). 다시 말해서 이들 phagocytosis 수용체는 세포 사멸 세포. 비슷한 식세포 지수가 양쪽 혈구 검출법으로부터 얻어지며, 이는 양립성이 있음을 시사한다.

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그림 1 : Anti-Croquemort Antibody와 TUNEL에 의한 배아 세포의 염색. ( A ) anti-Croquemort 항체와 TUNEL을 이용한 면역 염색으로 w 1118 균주에서 분산 된 배아 세포의 밝은 장 이미지. 양성 또는 음성으로 염색 된 세포 (상위 4 개 패널) 및 저전력 필드 (하위 패널)의 확대 된보기가 표시됩니다. 스케일 바, 5 μm (상단); 50 μm (바닥). ( B ) drpr 또는 Itgbn 돌연변이의 모든 Croquemort 양성 hemocytes에 TUNEL 신호 Croquemort 긍정적 인 hemocytes의 비율은 분산 배아 세포로 분석되었다. ( C ) Drpr 또는 Itgbn 돌연변이 체의 모든 세포에 대한 Croquemort 양성 혈구의 비율을 분산 된 배아 세포로 분석 하였다. ( D ) TUNEL 양성 세포 사멸 세포의 drpr 또는 모든 세포에 대한 비율Itgbn 돌연변이는 분산 된 배아 세포로 분석 하였다. 유전자형; w 1118 (야생형 대조군), drpr Δ5 ( drpr 돌연변이 체) 및 Itgbn 2 (인테그린 β ν 돌연변이 체). 데이터는 3 가지 독립적 인 실험을 대표하고 학생의 t- 테스트에 의해 분석되었다. 약 300 개의 Croquemort 양성 혈구가 각 실험에서 관찰되었고, 값은 3 개의 미세 필드의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. *; <0.05, ns; 차이는 중요하지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 개미에 의한 배아 세포 염색i-GFP 및 TUNEL. ( A ) 항 GFP 항체와 TUNEL로 immunostaining하여 srpHemo - GAL4UAS - EGFP / + 변형에서 배아 세포 분산의 밝은 현장 이미지. 양성 또는 음성으로 염색 된 세포 (상위 4 개 패널) 및 저전력 필드 (하위 패널)의 확대 된보기가 표시됩니다. 눈금 막대 = 5 μm (위쪽); 50 μm (바닥). ( B ) RNAi - 매개 knockdown 파리의 drpr 또는 Itgbn 의 모든 GFP 양성 hemocytes에 TUNEL 신호와 GFP 양성 hemocytes의 비율은 분산 배아 세포로 분석되었다. (C) 또는 drpr Itgbn의 RNAi를 매개 녹다운 파리의 모든 세포에 GFP 양성 혈구 세포의 비율은 분산 배아 세포를 분석 하였다. ( D ) RNAi를 매개로하는 drpr 또는 Itgbn의 파리의 모든 세포에 대한 TUNEL 양성 세포 사멸 세포의 비율을 분산 된 배아 세포로 분석 하였다. 유전자형; RNAi -: yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr : yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . 데이터는 3 가지 독립적 인 실험을 대표하고 학생의 t- 테스트에 의해 분석되었다. 각 실험에서 대략 300 개의 GFP 양성 혈구가 관찰되었으며, 값은 3 개의 미세 영역의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. *; p <0.05, ns; 차이는 중요하지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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우리는 여기에 Drosophila 배아를 사용하여 식균 작용 분석을 설명했다. 식균 작용을 정량적으로 측정하기 위해 분산 된 배아 세포를 사용함으로써 hemocyte, Drosophila professional phagocytes가 hemocyte marker Croquemort 또는 srpHemo- driven GFP에 대해 면역 염색되고, apoptotic 세포가이 프로토콜에서 TUNEL에 의해 검출됩니다. 식균 작용의 수준은 hemocytes와 phagocytosing hemocytes의 총 수를 세어 phagocytic index로 표현됩니다. 분산 된 배아 세포의 사용은 우리가 모든 배아에서 모든 식세포와 세포 사멸 세포를 관찰하고 식균 작용의 수준을 정량화 할 수있게한다. 또한, 우리의 방법은 형광 현미경이 아닌 가벼운 현미경으로 관찰 할 수있는 염료로 hemocytes와 apoptotic 세포를 감지합니다. 이것은 필터를 바꾸지 않고 혈구와 세포 사멸 세포를 동시에 관찰 할 수 있기 때문에 식균 작용 수준의 평가를 용이하게합니다.

ve_content "> 배아 세포 염색에 중요한 것은 다음과 같다 : 배아 세포의 고정 단계에서 2 주 이내에 준비된 신선한 PFA를 사용해야한다 .Crequemort의 면역 염색에서 항 Croquemort와 세포 배양이 수행되어야한다 TUNEL 염색법에서 DAB와 세포의 배양은 과도한 염색을 피하기 위해 현미경으로주의 깊게 검사해야한다 .TUNEL은 세포 사멸 세포에 풍부한 3'-OH를 검출하여 분열 된 DNA를 시각화하지만, 정상 세포도 DNA의 3 '말단에 3'-OH를 가지고 있지만 세포 자살 세포보다 낮은 수준이다. 따라서 DAB와 함께 세포를 배양하면 세포 자멸 세포뿐만 아니라 정상 세포도 염색된다 이를 막기 위해 DAB 염색시 15 또는 30 초마다 세포 관찰이 권장됩니다.

이 프로토콜에서는 식균 작용의 수준을 정량화하는 것이 빠르고 정확하지만 몇 가지 정보가 such는 hemocytes의 engulment 또는 분포의 사이트로 손실됩니다. 우리는 이전에 전체 배아를 사용 하여이 분석 및 현장 phagocytosis 분석은 phagocytic 지수 21 측면에서 비슷한 결과를 생산 것을 보여 주었다. 따라서 우리는 일부 경우에서 얻은 결과를 정확하게 해석하기 위해 병행하여 in situ 식균 작용을 수행 할 것을 권장합니다.

Drosophila 에는 중추 신경계에서 다른 전문적인 식세포 인 glial 세포가 있습니다. 우리는이 프로토콜에서 배아의 glial 세포에 의해 apoptotic 뉴런의 phagocytosis을 평가하는 방법을 설명하지 않지만, 동일한 프로토콜은 Kuraishi 이보고 한 것과 같은 engulfment의 수준을 계량하기 위해 적용됩니다 . , EMBO.J 21 . 마찬가지로,이 분석은 Drosophila 배아의 TUNEL 양성 세포가 비 전문가 식세포에 의해 식균 될 가능성이 있음을 시사한다. 그 미확인 ph에 의한 식균 작용숙취 수용체가 알려지지 않은 agocytes는 배아 세포에서 아폽토시스 세포의 총 수가 phagocytosis 유전자 돌연변이에서 증가하지 않는 것으로 보이는 결과를 설명 할 수있다 ( 그림 1D ).

결론적으로,이 프로토콜은 성공적으로 전문 phagocytes에 의해 apoptotic 세포의 phagocytosis에 필요한 유전자의 발견으로 이끌었습니다. 24 , 25 , 28 . 염증성 질환 및 포유류 (29)자가 면역 질환과 관련되어 죽은 세포의 탐식 간극으로 의미있는 통찰을 제공 할 수있다 복잡한 식세포 반응을 수반 초파리 배아에서 유전자 기능을 드러내는 식세포 (7)의 기초가되는 분자 기전의 진화 적 보전 기준.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

그들의 조언에 대해 Kaz Nagaosa와 Akiko Shiratsuchi에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

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References

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에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아
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Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

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