Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fagocytoseanalyse for apoptotiske celler i doi: 10.3791/56352 Published: August 3, 2017

Summary

Her beskrives en fagocytoseanalyse ved bruk av de dispergerte embryonale celler av Drosophila . Det gjør det mulig for oss å enkelt og nøyaktig kvantifisere fagfaktocytosnivåer in vivo , og å identifisere nye molekyler som kreves for fagocytose av apoptotiske celler.

Abstract

De molekylære mekanismene som ligger til grund for fagocytosen til apoptotiske celler, må bli belyst i større detalj på grunn av sin rolle i immun- og inflammatoriske uopprettelige sykdommer. Her har vi utviklet en eksperimentell metode for å undersøke fagocytose kvantitativt ved bruk av fruktfluen Drosophila , hvor gennettverket som styrer engulferingsreaksjoner, evolusjoneres konservert fra pattedyr. For å nøyaktig oppdage og telle innfylling og unngulfing av fagocytter under anvendelse av hele dyr, ble Drosophila- embryoer homogenisert for å oppnå dispergerte celler, inkludert fagocytter og apoptotiske celler. Bruken av dispergerte embryonceller gjør det mulig for oss å måle in vivo fagocytose nivåer som om vi utførte en in vitro fagocytose-analyse der det er mulig å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer og nøyaktig kvantifisere nivået av fagocytose. Vi bekreftet at denne metoden gjengir dem fra tidligere studierSom identifiserte genene som kreves for fagocytose av apoptotiske celler. Denne metoden tillater at engulfering av døde celler analyseres, og når de kombineres med den kraftige genetikken til Drosophila , vil det avsløre de komplekse fagocytiske reaksjoner som består av migrasjon, anerkjennelse, engulfering og nedbrytning av apoptotiske celler av fagocytter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I metazoan dyr, for eksempel nematoden Caenorhabditis elegans , fruktflugten Drosophila melanogaster og mus og mennesker, gjennomgår et stort antall celler apoptose under utvikling for å forme kroppene deres og i voksen alder for å opprettholde homøostasis 1 , 2 . Apoptotiske celler må fjernes raskt fordi de induserer betennelse i det omgivende vev ved å frigjøre immunogene intracellulære materialer hvis de ikke er helt fjernet 3 . For å lette rask fjerning presenterer apoptotiske celler såkalte spise-meg-signaler som er anerkjent av engulferingsreceptorene av fagocytter, og elimineres av fagocytose 3 , 4 , 5 , 6 . Fagocytose spiller således en avgjørende rolle i opprettholdelsen av vertshemostasen, og dermed utheve molekylen Lar mekanismer som ligger til grunn for fagocytose av apoptotiske celler er av betydning.

Mekanismene som er ansvarlige for fagocytose av apoptotiske celler, synes å være evolusjonelt konserverte blant arter i nematoder, fluer og mus 7 . Flere fagocytoseanalyser er for tiden tilgjengelige for å vurdere engulfering av apoptotiske celler i disse modelldyrene. I C. elegans gjennomgår 131 somatiske celler programmert celledød under utvikling, og cellekropper blir fagocytosed av nabo-celler, som er ikke-profesjonelle fagocytter 8 . Således teller antall gjenværende cellekropper i C. elegans indikerer nivået av fagocytose in vivo . Ved å lete etter nematode mutanter som viser et økt antall døde celler, har flere gener som kreves for fagocytose blitt identifisert og genetisk karakterisert 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .

Eks vivo fagocytose-analyser med primære kultur fagocytter, vanligvis makrofager, benyttes ofte i mus. Apoptotiske celler fremstilles ved bruk av cellelinjer som Jurkat-celler, og blandes med primære fagocytter. Etter en inkubasjon i flere timer, teller det totale antall fagocytter og engulfing fagocytter for å vurdere nivået av fagocytose. Som en sofistikert modifikasjon av denne metoden utviklet Nagatas gruppe en eks vivo fagocytose-analyse med celler som uttrykker en caspase-resistent ICAD (inhibitor av kaspas-aktivert DNase), hvor apoptotiske celler ikke gjennomgår apoptotisk DNA-fragmentering, men DNA spaltes fortsatt når Celler er fagocytosed. Når disse cellene blir brukt som apoptotiske mål i en fagocytoseanalyse, fragmenteres kun DNA fra engulferte apoptotiske celler og farves med TdT-mediert DUTP nick end-merking (TUNEL). Derfor lever deL av apoptotisk celleoppfylling måles ved å telle TUNEL-signaler i en blanding av fagocytter og apoptotiske celler 13 .

I D. melanogaster er faglige fagocytter som heter hemocytter, Drosophila- makrofager, ansvarlige for fagocytose av apoptotiske celler 14 , 15 . I tillegg til in vitro fagocytose-analyser med kulturcellelinjer er in vivo fagocytose-analyser med hele Drosophila- embryoer tilgjengelige. Drosophila- embryoer er et kraftig verktøy for å undersøke nivået av apoptotisk celleoppfylling fordi mange celler gjennomgår apoptose og fagocytteres av hemocytter under embryonisk utvikling 14 , 15 , 16 . Et eksempel på en in vivo fagocytoseanalyse er metoden utviklet av Francs gruppe. I deres metode er hemocytter deAntistoffert ved immunostaining av peroksidasin, en hemocytmarkør, blir apoptotiske celler farget ved bruk av det nukleære fargestoffet, 7-aminoaktinomycin D i hele Drosophila- embryoer, og antall doble positive celler teller som et signal av fagocytose 17 . Et annet eksempel på en fagocytoseanalyse på embryoer er basert på begrepet Nagatas metode beskrevet ovenfor; Imidlertid evalueres fagocytose in vivo ved bruk av embryoene av dCAD ( Drosophila caspase-aktivert DNase) mutantfluer 18 , 19 . Disse in vivo fagocytose-analysene er nyttige for direkte å observere fagocytose in situ . Imidlertid er vanskeligheter forbundet med å utelukke eventuell forspenning i trinnet med å telle fagocytoserende celler fordi det er vanskelig å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer på grunn av dens tykkelse.

For å overvinne denne begrensningen utvikler viUtgitt en ny fagocytoseanalyse i Drosophila- embryoer. I vår metode, for å enkelt telle fagocytoserende hemocytter, blir hele embryoer homogenisert for å fremstille dispergerte embryonale celler. Fagocytter detekteres ved immunfarging av en fagocytmarkør, og apoptotiske celler påvises av TUNEL med disse dispergerte embryonale celler. Bruken av dispergerte embryonceller gjør det mulig for oss å måle in vivo fagocytose nivåer som om vi utførte en in vitro fagocytoseanalyse som nettopp kvantifiserer nivået av fagocytose. Alle genotyper av fluer kan benyttes i denne analysen hvis de utvikler seg til stadium 16 av embryoer 20 , utviklingsstadiet hvor apoptotisk celleklarering ved fagocytose er den mest omfattende. Denne metoden har fordelen av å vurdere nivået av fagocytose kvantitativt, og kan således bidra til identifisering av nye molekyler involvert i fagocytose av apoptotiske celler in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling

  1. Tilberedning av friske druesaft-agarplater
    1. Tilsett 100 ml vann til 4,4 g agar, og oppvarm blandingen i en mikrobølgeovn for å oppløse agar.
    2. Tilsett 80 ml frisk druesaft, 5 ml eddiksyre og 5 ml etanol til agaroppløsning.
    3. Hell ca 1,5 ml av oppløsningen med en pipette på hver glidelås, og la den størkne.
  2. Fremstilling av 6 cm parabolen agaroseplater
    1. Tilsett 50 ml vann til 0,5 g agarose, og oppvarm blandingen i en mikrobølgeovn for å oppløse agarose.
    2. Hell ca 2,5 ml agaroseoppløsning på en 6 cm tallerken med pipette.

2. Fase 16 Embryo Collection

  1. Samle voksne fluer, og legg til 200 kvinner og 200 hanner i et 50 ml konisk rør.
  2. Sett en tallerken med frisk druesaft agar på gjær i 50 ml rør, og lukk med en svamp cas.
  3. Inkuber fluene ved 16 ° C i lyset i 2 - 3 dager. Skift plate en gang om dagen.
  4. Flytt fluene til mørket ved 25 ° C i 1 time.
  5. Bytt den gamle platen til en ny uten gjær. Tillat fluer å legge egg i 2 timer.
  6. Samle platen og inkuber ved 16 ° C i 26 timer.
  7. Samle embryoer fra platen med en pensel inn i 1 ml PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100.
  8. Vask embryoer to ganger med 1 ml PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100.
  9. For å fjerne korionen, legg 1,2 ml natriumhypoklorittoppløsning (2,2 - 3,4% Cl) til embryoer i 3 minutter.
  10. Vask embryoer 4 ganger med 1 ml PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100.
  11. Legg embryoer på 6-cm fat agaroseplater. Plukk opp 16 embryoer under et mikroskop som beskrevet av Roberts 20 . Samle ca. 50 embryoer i et 1,5 ml Treff mikro-testrør med en mikropipette.

3. PrepaRasjon av embryonale celler

  1. Vask embryoer to ganger med 150 μL PBS.
  2. Homogeniser embryoer 30 ganger i et 1,5 ml mikrotestrør og pelletsblander i nærvær av 200 ul kollagenase (0,25% (vekt / volum)) i PBS.
  3. Disperse embryonale celler ved pipettering 10 ganger, og flytt cellesuspensjonen til et 1,5 ml rør. Inkubér celler ved 37 ° C i 1 min i et vannbad. Gjenta dette trinnet to ganger.
  4. Tilsett 800 μL PBS til cellesuspensjonen og sentrifuger ved 1400 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
  5. Fjern supernatanten og tilsett 200 μL trypsin (0,25% (w / v)) i PBS til cellene. Disperse embryonale celler ved pipettering 50 ganger.
  6. Filtrer cellesuspensjonen med en 70 μm Cell Strainer.
  7. For å stoppe trypsinaktiviteten, tilsett 40 μl varmeinaktivert føtalt bovint serum til den filtrerte cellesuspensjonen. Tilsett 800 μL PBS og sentrifuger ved 1400 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
  8. Fjern supernataNt, suspendere utfelt celler i 200 μl PBS og sentrifuge ved 1400 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
  9. Fjern supernatanten og suspendere utfelt celler i 30 μl PBS.
  10. Monter den preparerte cellesuspensjonen på aminopropyltrietoksysilanbelagte glassglass, og vent i 10-15 minutter til celler festes til glassruten.
  11. Fjern den gjenværende løsningen på glassruten med en pipette. Monter 60-70 μl PBS som inneholder 4% (w / v) PFA (paraformaldehyd) på celler i 10-15 minutter for fiksering.
  12. Fjern fikseringsløsningen, og legg glassrørene i PBS i mer enn 1 min.

4. Farging av hemocytter

  1. Immunostaining med et anti-Croquemort antistoff
    1. Serielt suge glassglass i metanol i 10 minutter, i PBS som inneholder 0,2% (vol / vol) Triton X-100 i 10 minutter, og deretter i PBS i 10 minutter.
    2. Monter 20 μl 5% (v / v) hele svineserum i PBS-innholdNg 0,2% (v / v) Triton X-100 på celler for blokkering. Inkubér lysbilder ved romtemperatur i 20 minutter.
    3. Fjern løsningen fra glassglass, og monter 20 μL anti-Croquemort antiserum 19 , 21 (0,1% (volum / volum)) i PBS som inneholder 0,2% (volum / volum) Triton X-100 på celler. Inkubér lysbilder ved 4 ° C over natten.
    4. Soak glass lysbilder i PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 ganger.
    5. Soak glass lysbilder i PBS i 10 minutter.
    6. Monter 20 μl alkalisk fosfatasemerket anti-rotte-IgG (0,5% (vol / vol)) i PBS som inneholder 0,2% (volum / volum) Triton X-100 og 5% (volum / volum) hele svineserum på celler i rom Temperatur i 1 time.
    7. Soak glass lysbilder i PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 ganger.
    8. Sug glass i buffer inneholdende 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, og 50 mM MgCl2 i 10 minutter.
    9. Monofosfatasubstratoppløsning inneholdende 0,23 mg / ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP), 0,35 mg / ml nitroblått tetrazolium (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, og 50 mM MgCl2 på celler.
    10. Vær oppmerksom på celler under et mikroskop for riktig farging. Når sterke lilla signaler opptrer i hemocyternes granuler, fjern substratløsningen og bløt glassglidene i buffer bestående av 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 og 1 mM EDTA. Farging i ca. 5 - 10 min anbefales.
  2. Immunostaining med et anti-GFP antistoff (et annet alternativ for farging av hemocytter)
    1. Serielt suge glassglass i metanol i 10 minutter, PBS inneholdende 0,2% (vol / vol) Triton X-100 i 10 minutter og PBS i 10 minutter.
    2. Monter 20 μl 5% (v / v) hele svineserum i PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100 på celler for blokkering. Inkubér lysbilder ved romtemperatur i 20 minutter.
    3. Fjern løsningen på glassglass, og monter 20 μL av mus anti-GFP antistoff (1% (v / v)) / PBS cOppnå 0,2% (volum / volum) Triton X-100 på celler. Inkubér lysbilder ved romtemperatur over natten.
    4. Soak glass lysbilder i PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 ganger.
    5. Soak glass lysbilder i PBS i 10 minutter.
    6. Monter 20 μl alkalisk fosfatase-merket anti-mus IgG (0,5% (vol / vol)) i PBS som inneholder 0,2% (volum / volum) Triton X-100 og 5% (volum / volum) hele svineserum på celler i rom Temperatur i 1 time.
    7. Soak glass lysbilder i PBS som inneholder 0,2% (v / v) Triton X-100 i 10 minutter 5 ganger.
    8. Sug glassplater i en buffer bestående av 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, og 50 mM MgCl2 i 10 minutter.
    9. Monter fosfatasesubstrat oppløsning inneholdende 0,23 mg / ml BCIP, 0,35 mg / ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, og 50 mM MgCl2 på celler.
    10. Vær oppmerksom på celler under et mikroskop for riktig farging. Når lilla signaler vises i hele hemocytter, fjern substratløsningen og suge lysbildene i buffer som bestårAv 10 mM Tris-HCl, pH8,5 og 1 mM EDTA. Farging i ca. 10-15 min anbefales.

5. Vev apoptotiske celler av TUNEL

  1. Soak glass lysbilder i PBS i 5 min.
  2. Gjenta med nye PBS.
  3. Monter Equilibration buffer (Se Material Table) på celler i 10 minutter.
  4. Fjern løsningen fra glassglass, og monter 20 μl TdT-løsning som inneholder 5 μl terminal deoksynukleotidyltransferase og 15 μl reaksjonsbuffer på celler ved 37 ° C i 1 time.
  5. Fjern løsningen fra glassrør og suge lysbilder i buffer bestående av 0,5 ml STOP / Vask buffer og 17 ml vann.
  6. Soak lysbilder i PBS i 5 minutter 3 ganger.
  7. Monter 20 μl anti-digoksigenin-peroksidase på celler ved romtemperatur i 30 minutter.
  8. Soak glass lysbilder i PBS i 5 minutter 4 ganger.
  9. Sug glassglass i peroksidasubstratoppløsning bestående av 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH7,5 containinga fullstendig mikro spatel av 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrichloride (DAB), og 0,002% (v / v) H 2 O 2 i 30 sek.
  10. Gjenta trinn 5.9 til apoptotiske celler er farget brunt. Soak glass lysbilder i vann for å stoppe peroxidase reaksjonen.
  11. Vedlegg celler med vann for observasjon.

6. Mål nivået av fagocytose av apoptotiske celler

  1. Følg prøver under et lysmikroskop for å vurdere nivået av fagocytose. Count Croquemort-positive celler eller GFP-positive celler som hemocytter, TUNEL-positive celler som apoptotiske celler, og doble positive celler som fagocytoserende hemocytter.
  2. Den fagocytiske indeksen er definert som antall dobbelt positive celler til totalt antall Croquemort-positive celler eller GFP-positive celler. Det anbefales at mer enn 300 hemocytter blir observert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å undersøke fagocytosen av apoptotiske celler ble Drosophila- embryoer fra utviklingsstadiet 16 oppsamlet og fremstilt som dispergerte celler. Hemocytter, Drosophila- makrofager, ble farget ved immunocytokjemi for hemocytmarkøren "Croquemort" 17 , 22 ved bruk av et spesifikt antistoff 19 , 21 og apoptotiske celler ble farget av TUNEL i dispergerte embryonale celler ( Figur 1A ). Croquemort, en Drosophila CD36-relatert reseptor, uttrykkes spesifikt på alle embryonale hemocytter 22 , og har blitt vist genetisk for å være involvert i klaring av apoptotiske celler i Drosophila- embryoer 17 . Croquemort-positive celler har lilla signaler i de små granulene i deres celler. TUNEL-positive celler viser abRown signal i hele corpuses. TUNEL-positive celler er mindre enn andre celler, og noen er inne i Croquemort-positive celler, som anses å være fagocyttede dødceller. Mellom 2 og 10% observeres Croquemort-positive celler og 1 - 5% TUNEL-positive celler i alle embryonale celler.

I Drosophila er det to signalveier for innvolving av apoptotiske celler. To fagocytose-reseptorer for de tilsvarende veiene, Draper og integrin α PS3 β v, identifiserer selvstendig døde celler 19 , 21 , 23 , 24 , 25 . Draper er et transmembranprotein som besitter atypiske epidermale vekstfaktor (EGF) -lignende sekvenser i den ekstracellulære regionen og de to fosforylerbare motivene NPxY og YxxL i INtracellulær del 26 . Integrin α PS3 β v er også en transmembranreseptor bestående av en heterodimer av a og p- underenheter 25 . Figur 1B viser forholdet mellom fagocytoserende hemocytter til totale hemocytter i vill-type eller drpr- eller Itgbn-enkeltmutantembryoer . Ved å telle alle Croquemort-positive celler (totale hemocytter) og Croquemort- og TUNEL-dobbelt positive celler (fagocytoserende hemocytter), beregnet vi fagocytisk indeks som antall fagocytoserende hemocytter til totalt antall hemocytter. Den fagocytiske indeksen var lavere i drpr- eller Itgbn- mutanten enn i villtype, mens antall hemocytter og apoptotiske celler var liknende ( figur 1C- D ), hvilket indikerer at disse to gener er nødvendige for apoptotisk celleoppfylling som tidligere reported.

Når et anti-Croquemort-antistoff ikke er tilgjengelig eller mutantlinjer med endret Croquemort-ekspresjon undersøkes, må vi velge et annet alternativ for å oppdage hemocytter. Embryoer med en GAL4-driver styrt av en hemocyt-spesifikk promotor ( srpHemo-GAL4 ) og GFP-genet som er kontrollert av en oppstrøms aktiveringssekvens (UAS), inkludert GAL4-bindingsstedet ( UAS-EGFP ), har GFP-merkede hemocytter 27 , Som gjør at vi kan oppdage hemocytter ved hjelp av anti-GFP. Figur 2A viser et bilde oppnådd etter detektering av hemocytter og apoptotiske celler med immunfarging ved bruk av et anti-GFP-antistoff og TUNEL i embryonale celler med srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Mens et anti-Croquemort-antistoff flekker små granuler i celler, sperrer et anti-GFP antistoff hele hemocytter. I likhet med figur 1A er 2 - 6% GFP-positive celler og 1 - 5% TUNEL-positive Celler observeres i alle embryonale celler. Noen TUNEL-positive celler oppdages innenfor GFP-positive celler, som anses å være fagocyttede dødceller. RNAi-mediert knockdown blir lett brukt for å vurdere noen gener for deres involvering i fagocytose ved å krysse fluer med UAS-dsRNA fra kandidatgenene med srpHemo-GAL4UAS-EGFP . Den RNAi-medierte knockdownen av drpr eller Itgbn reduserte fagocytisk indeks ( Figur 2B ), mens antall hemocytter og apoptotiske celler i embryonale celler var sammenlignbare ( Figur 2C -2D ), hvilket igjen viser at disse fagocytose-reseptorene er involvert i fagocytose av Apoptotiske celler. Lignende fagocytiske indekser oppnås fra begge hemocytdeteksjonsmetoder, hvilket antyder at begge er kompatible.

G "/>
Figur 1 : Farging av embryonale celler ved hjelp av et anti-Croquemort-antistoff og TUNEL. ( A ) Lysfeltbilder av dispergerte embryonale celler fra w 1118- stammen ved immunfarging med et anti-Croquemort-antistoff og TUNEL. Forsterkede visninger av representativ positivt eller negativt beiset celler (topp 4 paneler) og et lav-effektfelt (bunnpanel) vises. Skalestenger, 5 μm (topp); 50 μm (bunn). ( B ) Forholdet mellom Croquemort-positive hemocytter med TUNEL-signalet til alle Croquemort-positive hemocytter i drpr- eller Itgbn- mutanten ble analysert med dispergerte embryonale celler. ( C ) Forholdet mellom Croquemort-positive hemocytter til alle celler i drpr- eller Itgbn- mutanten ble analysert med dispergerte embryonale celler. ( D ) Forholdet mellom TUNEL-positive apoptotiske celler til alle celler i drpr ellerItgbn- mutant ble analysert med dispergerte embryonale celler. genotyper; W 1118 (wild-type kontroll), drpr Δ5 ( drpr mutant) og Itgbn 2 (integrin β v mutant). Data var representativ for tre uavhengige eksperimenter og analysert ved Studentens t- test. Omtrent 300 Croquemort-positive hemocytter ble observert i hvert eksperiment, og verdier representerer gjennomsnittet ± SD av tre mikroskopiske felt. *; p <0,05, ns; Forskjellen er ikke signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Farging av embryonale celler av AntI-GFP og TUNEL. ( A ) Lysfeltbilder av dispergerte embryonale celler fra srpHemo-GAL4UAS-EGFP / + -stammen ved immunfarging med et anti-GFP-antistoff og TUNEL. Forsterkede visninger av representativ positivt eller negativt beiset celler (topp 4 paneler) og et lav-effektfelt (bunnpanel) vises. Skalestenger = 5 μm (topp); 50 μm (bunn). ( B ) Forholdet mellom GFP-positive hemocytter med TUNEL-signalet til alle GFP-positive hemocytter i RNAi-medierte knockdownflyr av drpr eller Itgbn ble analysert med dispergerte embryonale celler. ( C ) Forholdet mellom GFP-positive hemocytter til alle celler i RNAi-medierte knockdownflyr av drpr eller Itgbn ble analysert med dispergerte embryonale celler. ( D ) Forholdet mellom TUNEL-positive apoptotiske celler til alle celler i RNAi-medierte knockdownflyr av drpr eller Itgbn ble analysert med dispergerte embryonale celler. genotyper; RNAi -: Yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + , RNAi drpr: yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +, RNAi Itgbn : yw / w; SrpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + . Data var representativ for tre uavhengige eksperimenter og analysert ved Studentens t- test. Omtrent 300 GFP-positive hemocytter ble observert i hvert eksperiment, og verdier representerer middel ± SD av tre mikroskopiske felt. *; P <0,05, ns; Forskjellen er ikke signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her beskrives en fagocytoseanalyse ved bruk av Drosophila- embryoer. Ved å bruke dispergerte embryonale celler for å måle fagocytose kvantitativt, hemocytter, Drosophila profesjonelle fagocytter, immunostained for hemocytmarkøren Croquemort eller srpHemo- driven GFP, og apoptotiske celler påvises av TUNEL i denne protokollen. Nivået av fagocytose uttrykkes som en fagocytisk indeks ved å telle totalt antall hemocytter og fagocytoserende hemocytter. Bruken av dispergerte embryonale celler gjør det mulig for oss å observere alle fagocytter og apoptotiske celler i hele embryoer og nøyaktig kvantifisere nivået av fagocytose. I tillegg oppdager vår metode hemocytter og apoptotiske celler med fargestoffer som er observerbare under et lysmikroskop, ikke et fluorescensmikroskop. Dette letter vurderingen av fagocytose nivåer fordi det er mulig å observere hemocytter og apoptotiske celler samtidig uten å endre noe filter.

Ve_content "> Følgende punkter er avgjørende for farging av embryonale celler. I fikseringstrinnet av embryonale celler må fersk PFA forberedt innen to uker brukes. I immunfarging av Croquemort må inkubasjonen av celler med anti-Croquemort utføres Ved 4 ° C. Ved TUNEL-farging må inkubasjonen av celler med DAB utføres ved nøye å sjekke under et mikroskop for å unngå overdreven farging. TUNEL visualiserer fragmentert DNA ved å detektere 3'-OH, som er rikelig i apoptotiske celler. Normale celler har også 3'-OH i DNA'ens 3'-terminal, men på et lavere nivå enn i apoptotiske celler. Derfor vil en inkubasjon av celler med DAB for lang tid ikke bare flekke apoptotiske celler, men også normale celler . Observasjon av celler hver 15. eller 30 s under DAB-farging anbefales for å forhindre dette.

I denne protokollen, selv om kvantifisering av nivået av fagocytose er rask og presis, vil noen opplysninger suCh som stedet for engulfment eller distribusjon av hemocytter går tapt. Vi har tidligere vist at denne analysen og en in situ fagocytose-analyse ved bruk av hele embryoer ga lignende resultater i form av fagocytisk indeks 21 . Derfor anbefaler vi at du utfører en in situ fagocytoseanalyse parallelt for å nøyaktig tolke de oppnådde resultatene i noen tilfeller.

Drosophila har en annen profesjonell fagocyt, glialceller, i sentralnervesystemet. Selv om vi ikke beskriver hvordan man vurderer fagocytose av apoptotiske nevroner med glialceller i embryoer i denne protokollen, anvendes samme protokoll for å kvantifisere nivået av engulfment som det rapportert av Kuraishi et al. , EMBO.J 21 . På samme måte antyder denne analysen at TUNEL-positive celler i Drosophila- embryoer sannsynligvis vil bli fagocytosed av ikke-profesjonelle fagocytter. Fagocytose av de uidentifiserte phAgocytter med ukjente engulferingsreseptorer kan forklare resultatet ( figur 1D ) at det totale antall apoptotiske celler i embryonale celler ikke synes å økes i en fagocytosegenmutant.

Som konklusjon har denne protokollen med suksess ført til oppdagelsen av gener som kreves for fagocytose av apoptotiske celler av profesjonelle fagocytter. 24 , 25 , 28 . Basert på evolusjonær bevaring av de molekylære mekanismene som ligger til grund for fagocytose 7 , kan avslørende genfunksjoner i Drosophila- embryoer som involverer komplekse fagocytosereaksjoner gi meningsfylt innsikt i fagocytisk clearance av døde celler, som er relatert til inflammatoriske lidelser og autoimmune sykdommer hos pattedyr 29 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Kaz Nagaosa og Akiko Shiratsuchi for deres råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
whole swine serum MP Biomedicals 55993 For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL TreffLab 96. 4625. 9. 01 For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL TreffLab 96. 7339. 9. 03 For  homogenization
Collagenase Sigma-Aldrich C-0130 For preparation of embryonic cells
Trypsin Thermo Fisher SCIENTIFIC 27250-018 For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP KPL 475-1612 secondary antibody for
stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-phosphate
Roche 11383221001 BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium Roche 11383213001 NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody described previously in Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
 Anti-GFP
from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) 
Roche 11814460001 For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate Bio-Rad 170-6520 secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100 For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine
tetrahydrichloride
nacalai tesque 11009-41 DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name Stock center Stock ID Comments
w1118 Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5 drpr mutant, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
Itgbn2 Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR VDRC 4833 -
UAS-Itgbn-IR NIG-fly 1762R-1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, (2), 205-219 (2004).
  2. Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96, (2), 245-254 (1999).
  3. Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407, (6805), 784-788 (2000).
  4. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14, (3), 277-287 (2004).
  5. Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7, (12), 964-974 (2007).
  6. Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35, (4), 445-455 (2011).
  7. Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53, (2), 149-160 (2011).
  8. Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
  9. Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220, (4603), 1277-1279 (1983).
  10. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129, (1), 79-94 (1991).
  11. Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107, (1), 27-41 (2001).
  12. Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20, (6), 477-486 (2010).
  13. Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417, (6885), 182-187 (2002).
  14. Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, (7), 1829-1837 (1994).
  15. Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
  16. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, (1), 29-43 (1993).
  17. Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284, (5422), 1991-1994 (1999).
  18. Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16, (20), 2662-2671 (2002).
  19. Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279, (46), 48466-48476 (2004).
  20. Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).
  21. Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28, (24), 3868-3878 (2009).
  22. Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4, (5), 431-443 (1996).
  23. Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313, (3), 500-510 (2007).
  24. Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286, (29), 25770-25777 (2011).
  25. Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288, (15), 10374-10380 (2013).
  26. Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6, (6), 291-297 (2012).
  27. Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, (1), 73-84 (2004).
  28. Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292, (19), 8059-8072 (2017).
  29. Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304, (5674), 1147-1150 (2004).
Fagocytoseanalyse for apoptotiske celler i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).More

Nonaka, S., Hori, A., Nakanishi, Y., Kuraishi, T. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56352, doi:10.3791/56352 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter