Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1,4
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Summary

نحن تقرير الحمض النووي الريبي دبوس صغير (شرنا) والبروتوكول على أساس تسلسل الجيل القادم لتحديد الجهات التنظيمية للمنظمة إكستشروموسومي في خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وتنصهر فيها جينات مقاومة هيجروميسين الميثيل البد ملزمة البروتين 2 ( MeCP2) الجينات على كروموسوم X غير نشط.

Abstract

شاشات الجينية إلى الأمام باستخدام الجينات مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين قد استخدمت على نطاق واسع للتحقيق وآليات الرقابة جينية في نموذج الكائنات الحية. وقد مكنت التكنولوجيات بما في ذلك الكشف دبوس الشعر القصير (شرناس) ومجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هذه الشاشات في خلايا الثدييات مثنوية. هنا يمكننا وصف شاشة شرنا على نطاق واسع للمنظمين للمنظمة إكستشروموسومي (إكسسي)، باستخدام خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وطرقت جينات مقاومة هيجروميسين في ج-محطة الميثيل البد البروتين الجيني (MeCP2) 2 على إكستشروموسومي غير نشط (الحادي عشر). إعادة تنشيط بناء في خط الخلية مراسل تمنح ميزة البقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما مكننا من شاشة مكتبة كبيرة شرنا وتحديد دبابيس الشعر التي أعادت تنشيط المراسل بقياس التحديد بعد تخصيب اليورانيوم باستخدام تسلسل الجيل القادم. ثم التحقق من دبابيس الشعر المخصب على حدة عن طريق اختبار قدرتها على تنشيط لوسيفراس المراسل في الحادي عشر.

Introduction

أحد الأشكال الأكثر شيوعاً للإعاقة العقلية وراثية في الإناث، ومتلازمة ريت، بسبب الطفرات متخالف في MeCP2، جينات إكستشروموسومي الذي يقوم بترميز بروتين ضروري لوظيفة الخلايا العصبية الطبيعية1. اتباع نهج محتمل لعلاج هذا الاضطراب سيكون تنشيط اليل MeCP2 البرية من نوع الحادي عشر، كما تبين ذلك استعادة التعبير MeCP2 لعكس العجز العصبية في نموذج الفأر من هذا المرض1، 2 , 4-بيد إسكات جينية من واحد من اثنين من الكروموزومات في خلايا الإناث العاشر هو الإبقاء على أحكام طوال العمر الافتراضي لكائن حي3،4، والمرجح أن تتطلب تنشيط قوية من الجينات الحادي عشر رئيسية اضطراب في مسارات تنظيمية جينية متعددة.

تحديد العوامل اللازمة للصيانة لإسكات MeCP2 ، وضعنا أول نموذج ماوس المحورة وراثيا تحمل MeCP2-لوسيفراس-هيجروميسين مقاومة جينات انصهار (MeCP2-لوك-الموارد البشرية) على واحد من اثنين من الكروموزومات العاشر (س MeCP2-LUC-HRسMeCP2)5. على الرغم من أن MeCP2 أعرب عن بناء الانصهار أثبتت أنها غير مستقرة، وأسفرت عن فقدان وظيفة، محاكاة phenotypically MeCP2 الحذف في الذكور هيميزيجوس (X/YMeCP2-لوك-الموارد البشرية)، والتعبير عن الجينات مراسل كان من الممكن اكتشاف سهولة في نمط متسق مع التعبير عن الذاتية MeCP25. نحن ثم ولدت الحيوانات المستنسخة مخلدة تنتجها الخلايا الليفية مع البناء على إكستشروموسومي نشطة أو غير نشطة، وأكدت أن السابق أعرب عن نوع البرية MeCP2 ولا في بناء مراسل؛ معكوس كان صحيحاً لهذا الأخير. عندما تتعرض للحمض النووي ديميثيلاتينج عامل معروف أن تلغي إسكات الجينات، 5-أزاسيتيديني (5-عزة)، الخلايا مع المراسل في الحادي عشر ("خلايا مراسل") اكتسب النشاط في مقايسة الإضاءة الحيوية، مشيراً إلى أن لدينا بناء يمكن أن يعاد تنشيط وبالتالي وتستخدم للفحص الوراثي.

لقد طورنا التالية شاشة وراثية الفائق للمنظمين لإسكات MeCP2 . خط الخلية مراسل أول مصاب بالفيروس المكتبة التي تحتوي على > 60,000 شرناس مختلفة تستهدف > الجينات 25,000 طوال5،الماوس الجينوم6، وبعد ذلك تعرض لاختيار هيجروميسين ب. مقارنة تواتر دبوس في مرحلة ما قبل وما بعد اختيار العينات باستخدام تسلسل الجيل القادم، كمراسل تنشيط تمنح ميزة النمو ضمن التحديد هيجروميسين ب وأدت إلى إثراء المسؤولين دبابيس الشعر. باستخدام هذا النهج، حددنا 30 الجينات المتورطين في MeCP2 إسكات، وأكدت في وقت لاحق النتائج ترانسدوسينج الخلايا مراسل مع دبابيس الشعر الفردية وقياس نشاطها لوسيفراس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت كل الخطوات التي تنطوي على الحيوانات باستخدام بروتوكولات وافق "فريد هتشينسون بحوث مركز المؤسسية الحيوان العناية بالسرطان" واستخدام اللجنة (إياكوك). من المعروف لا والكواشف المستخدمة هنا تشكل مخاطر كبيرة على صحة الإنسان باستثناء 5-أزاسيتيديني (5-عزة).

1-توليد خط خلية مراسل مع MeCP2لوك-HR التحوير في الحادي عشر

  1. إعداد الماوس الأربطة الليفية من أنثى س سلوك MeCP2 ساعة الماوسMeCP2
    1. Euthanize يوم 10-12-أنثى القديمة س سلوك MeCP2 ساعةالماوسMeCP2 .
    2. باستخدام مقص تشريح مستقيم، جعل شق كفافى عن طريق الجلد من الجزء الذيل الدانية.
    3. عقد الذبيحة القرب من قاعدة الذيل، سحب الجلد بعيداً عن الماوس لفضح الجزء فيبروكارتيلاجينوس من الذيل. إزالة وقطع المحطة 10 ملم الأنسجة المعرضة إلى 1 ملم أجزاء طويلة باستخدام مشرط جراحة.
    4. نقل الأنسجة مجزأة إلى 15 مل مخروطية أنبوب يحتوي على 5 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 1 يو/مليلتر البنسلين 1 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وكولاجيناز 1.5 ملغ/مل، قبل تصفيتها عن طريق 0.45 ميكرومتر ومرشحات الشبكة ثم 0.2 ميكرون. احتضانها ح 3-4 في 37 درجة مئوية مع التناوب المستمر.
    5. أجهزة الطرد المركزي العينة في درجة حرارة الغرفة في 500 x ز للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في 10 مل دميم تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1 يو/مليلتر البنسلين، و 1 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (دميم-10) وطبق على طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا. مرور الخلايا مرة واحدة وتوسيع لصفيحة 10 سم قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    6. تخليد الخلايا عن طريق إجراء توصيل مع متجه تعبير يحمل فيروس الورم الحليمي البشري-16 المسرطنة الفيروسية (E6/E7)، كما هو موضح سابقا7.
  2. تحديد خلية مفردة الحيوانات المستنسخة وتميز MeCP2 المراسل التعبير
    1. حصاد الخلايا من صفيحة 10 سم. أولاً، نضح وسائط الإعلام، وإضافة 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا، واحتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع مل 9 من دميم-10 وجمع الخلايا ريسوسبينديد في أنبوب مخروطي 15 مل.
    2. تمييع الخلايا مع دميم-10 إلى تركيز نهائي للخلية 1/100 ميليلتر. نقل إلى لوحات 96-جيدا قبل بيبيتينج ميليلتر 100 تعليق في كل بئر.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى الآبار هي روافد، الذي يمكن أن يستغرق فترة تصل إلى 2-3 أسابيع. استبدال وسائط الإعلام مع 10 دميم جديدة كل 3-5 أيام. عندما المتلاقية، تعبئة الخلايا مع 20 ميليلتر من 0.05% التربسين-يدتا كل بئر وتقسيمها إلى مجموعتين مكررة من لوحات 96-جيدا.
    4. استخدام مجموعة واحدة من ألواح للاعتداء للنشاط لوسيفراس. استخدام أدوات تحليل لوسيفراس اليراع متجانسة التي لا تتطلب إزالة الوسائط. يتبع البروتوكول المضمنة مع هذه المجموعة.
    5. استخدام النتائج من الخطوة 1.2.4 لتحديد الحيوانات المستنسخة مع أي نشاط لوسيفراس القابلة للاكتشاف من مجموعة اللوحات الباقية. قم بتوسيع هذه الحيوانات المستنسخة إلى لوحات 24-جيدا وثم 6-جيدا.
    6. أداء نفس لاستنساخ مع النشاط لوسيفراس أعلى؛ سيتم استخدام هذا كعنصر إيجابي لأغراض التحقق من الصحة.
    7. الحصاد قاسمة لكل بئر في لوحة 6-جيدا لوصمة عار غربية. تعبئة الخلايا مع 200 ميليلتر التربسين-يدتا 0.05%. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع 2 مل 10 دميم، ونقل نصف عدد الخلايا إلى 1.5 مل أنبوبة الطرد المركزي. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني قبل ليسينج للطخة غربية. وبدلاً من ذلك، نقل نصف عدد الخلايا إلى آخر لوحة 6-جيدا. عند إرفاق الخلايا إلى الجزء السفلي من اللوحة، شطف مع برنامج تلفزيوني للطخة غربية.
    8. أداء الغربية وصمة عار مع جسم MeCP2 المضادة للتأكد من أن الخلايا السلبية لوسيفراس express، بينما الخلايا لوسيفراس-الإيجابية لا تعبر عن MeCP2 البرية من نوع من كروموسوم X النشطة؛ اتبع البروتوكول هو موضح سابقا8. استخدام أنسجة المخ من أي ماوس نوع البرية كعنصر إيجابي.
    9. لوحة استنساخ سلبية عدة على 2 × 105 خلايا/بئر في لوحة 6-جيدا. علاج مرة واحدة مع 10 ميكرون 5-عزة واحتضانها ح 72 دون تغيير وسائط الإعلام، والاعتداء للنشاط لوسيفراس كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
    10. اختر استنساخ سلبي واحد (استنساخ الحادي عشر) الذي اكتسب النشاط لوسيفراس مع 5-عزة والبدء بتوسيع نطاقه إلى عدة لوحات 10 سم. تجميد المستنسخين السلبية المتبقية في النتروجين السائل كنسخة احتياطية. يمكن الاحتفاظ بها في زراعة الأنسجة استنساخ الإيجابية (Xa استنساخ) أو مجمدة حتى استخدامها مرة أخرى.

2-فرز المكتبة لتنشيط استخدام التحديد هيجروميسين ب

  1. إصابة استنساخ التجارب وتطبيق التحديد وحصاد الحمض النووي للتسلسل
    1. الحصول على مركزات الفيروسية للفيروسات الرجعية بنيات الإعراب عن دبابيس الشعر من مكتبة شرنا، أو إنتاج المادة طافية الفيروسية يتركز استخدام بروتوكول المضمنة مع المكتبة المطلوبة.
    2. قبل المتابعة مع الشاشة، تيتراتي المكتبة (باستخدام علامة التجارة والنقل، إذا كان متوفراً). هدف لعدد وافر عدوى بين 0.3 و 0.5.
      ملاحظة: أداء شاشات مستقلة على الأقل أربعة للتقليل من معدلات إيجابية كاذبة. استخدام لوحات 20 كل الشاشة للحصول على تغطية 100-fold مكتبة للحفاظ على التمثيل الكافي من دبابيس الشعر وتجنب التسرب عشوائي9. ومع ذلك، نظراً لشاشة التحديد الإيجابي ومكتبة كبيرة حجم، فمن المحتمل أن يكفي تغطية أقل.
    3. في الصباح، لوحة 1 × 106 الحادي عشر خلايا على لوحات زراعة الأنسجة 10 سم.
    4. في فترة ما بعد الظهر، تصيب اللوحات بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع دميم-10 الطازجة التي تحتوي على المادة طافية الفيروسية و 5-10 ميكروغرام/مل من بوليبريني. استخدام الكمية من المادة الفيروسية طافية تحديد في الخطوة 2.1.2.
    5. بعد 18-24 ساعة، نضح وسائط الإعلام وإضافة 10 مل من جديد دميم-10 لكل لوحة. الثقافة لآخر 48 ساعة.
    6. في الصباح، وتعبئة الخلايا باستخدام مل 1 0.05% التربسين-يدتا للوحة الواحدة واخماد مع مل 9 من 10 دميم للوحة الواحدة. تشغيل التعليق من خلال عامل تصفية شبكة 100 ميكرومتر. تجميع المعلقات التي تمت تصفيتها، والبذور مجموعتين من لوحات 10 سم في 1 × 106 خلايا/لوحة.
    7. في فترة ما بعد الظهر، استبدال وسائط الإعلام في مجموعة واحدة من لوحات دميم-10 تحتوي على 15 ميكروغرام/مل من هيجروميسين ب (يوم 0). في مجموعة أخرى، استبدال الوسائط مع 10 دميم الطازجة فقط.
    8. بعد 48 ساعة، تعبئة الخلايا من دون علاج مجموعة من لوحات استخدام مل 1 0.05% التربسين-يدتا. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع مل 9 من 10 دميم. نقل الخلايا إلى 15 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في supernatants والشروع فورا في استخراج الحمض النووي من الكريات. وبدلاً من ذلك، تجمع الخلايا في أنابيب أكبر قبل خطوة الطرد المركزي.
    9. استخراج الحمض النووي باستخدام خليط من الفينول وتشروروفورم ويعجل بالحمض النووي مع إيثانول صوديوم اسيتات والباردة كما هو موضح سابقا10. تجمع عينات الحمض النووي الاختيار الفردية وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    10. مواصلة استزراع هيجروميسين ب التحديد تعيين لمدة 4 أيام أخرى. تجديد اختيار وسائل الإعلام مع دميم-10 الطازجة التي تحتوي على هيجروميسين ب بعد يومين.
    11. في يوم 7، استبدال الوسائط التحديد مع 10 دميم الطازجة فقط. تسمح 2 إلى 4 أيام للشفاء، ومن ثم حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.1.8. المضي قدما في استخراج الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 2.1.9.
  2. تحديد دبابيس الشعر أثري في عينات ما بعد التحديد
    1. استخدام 5 'السياق (5'-أتكجتجككتجكاكاتكتج-3 ') و 3' عكس حلقة كبسولة تفجير (5 '-أكاتكتجتجكتكاكتا-3') تضخيم النصف-دبابيس الشعر من عينات الحمض النووي ما قبل وما بعد التحديد. استخدام جميع استخراج الحمض النووي في ردود الفعل PCR منفصلة مع 100-200 نانوغرام من الحمض النووي لرد الفعل.
      ملاحظة: هذه السياق التمهيدي 5 '3' حلقة عكس كبسولة تفجير تطابق وتسلسل سياق مير-30 المنبع لإدراج شرنا والتسلسل في حلقة شرنا، على التوالي. وسيتطلب مكتبات مختلفة أوليجوس مختلفة. ضبط خطوات تنقية لعزل أحجام مختلفة من المنتجات حسب الضرورة.
    2. استخدام التحديد حجم الخرز إزالة أجهزة الإشعال والحمض النووي، واسترداد المنتجات بكر بين 100 و 200 هناك يتبع البروتوكول المضمنة مع الخرز.
    3. إعداد مكتبة تسلسل تسلسل النصف-دبابيس الشعر. إنشاء على الأقل 50 مليون على ما يلي في الشاشة. يتبع البروتوكول المناسب لتسلسل مجموعة أدوات ومعدات.
      ملاحظة: يوفر 50 مليون على ما يلي في الشاشة 1000-fold تمثيل كل شرنا في المكتبة وتقريبا إذ التغطية لكل عدوى مستقلة (نفذت في تمثيل كل شرنا 100-fold)، مما يضمن التمثيل الكافي كل حدث العدوى.
    4. تعداد كل شرنا استخدام برنامج نصي Perl التي تهم تسلسل مع مباريات مثالية. اختيار شرناس الذي كان يقرأ على الأقل 10 في تجمع الاختيار الأولى لمزيد من التحليل. حساب الإثراء كنسب من بعد للاختيار الأولى بحساب وتحديد معدل اكتشاف كاذبة (FDR) على أساس التباديل 1000. اختيار الجينات المستهدفة التي شرناس مع < 5% فرانكلين روزفلت ك "هيتس لإجراء مزيد من التجارب.

3-التحقق من دبابيس الشعر التي تم تحديدها ("يضرب")

  1. لينتيفيروسيس العبوة التي تحتوي على شرناس التي تم تحديدها في الشاشة
    1. بذور 8 × 106 خلايا 293 مترا كل لوح على لوحات 10 سم.
    2. في اليوم التالي، استبدال الوسائط مع مل 9 10 دميم خالية من المضادات الحيوية في اللوحة؛ هذا 30 دقيقة قبل تعداء.
    3. أثناء الفاصل الزمني لمدة 30 دقيقة، إعداد يمزج اثنين تعداء:
      1. إعداد مزيج 1 (كل لوحة/شرنا؛ رفع مستوى وفقا لإجمالي عدد شرناس): 10 ميليلتر من 2 مغ/مل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) في 0.5 مل وسائط الأساسية الحد الأدنى الأمثل. مزيج من بيبيتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. إعداد مزيج 2 (لكل شرنا): 4 ميكروغرام ناقل شرنا تعبئتها، 1.5 ميكروغرام من ناقلات المغلف ز منظمة (pMD2.G)، و 2.5 ميكروغرام ناقل التعبئة والتغليف (psPAX2)، مختلطة في 0.5 مل وسائط الأساسية الحد الأدنى الأمثل.
        ملاحظة: تشمل موجه لينتيفيرال فارغ في التعبئة والتغليف لاستخدامها في التهابات فيما بعد كعنصر سلبي.
    4. إضافة 0.5 مل مزيج 1 لكل قاسمة ميكس 2، وتخلط بلطف بيبيتينج. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    5. تطبيق هذا الخليط على كل لوح من الخطوة 3.1.2 بطريقة دروبويسي؛ دوامة اللوحة برفق لخلط.
    6. في اليوم التالي، استبدال الوسائط مع 5 مل 10 دميم الطازجة.
    7. 48 ساعة بعد تعداء الأولية، جمع المادة طافية وتشغيله من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. قبل الرطب عامل التصفية مع دميم-10 تحقيق أقصى قدر من الانتعاش.
    8. قاسمة المادة طافية المصفاة إلى المبالغ مثالية لإصابة لوحة 6-جيدا جيدا.
    9. تجميد مختبرين في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، أو الشروع فورا في توصيل.
  2. توصيل واختبار دبابيس الشعر الفردية لتنشيط مراسل لوسيفراس وإعادة تنشيط الجين MeCP2 البرية من نوع في الحادي عشر.
    1. في الصباح، لوحة 1 × 105 الحادي عشر خلايا/بئر على 6 لوحات جيدا.
    2. في فترة ما بعد الظهر، تصيب اللوحات بالاستعاضة عن وسائل الإعلام مع 2 مل من دميم-10 الطازجة التي تحتوي على المادة طافية لينتيفيرال و 5-10 ميكروغرام/مل من بوليبريني. تصيب تحكم تماما مع المادة الفيروسية طافية تنتج من موجه لينتيفيرال فارغ.
    3. في اليوم التالي، استبدال الوسائط مع 2 مل من دميم-10 تحتوي على 1 ملغ/مل بوروميسين. الثقافة لمدة أربعة أيام.
    4. استبدال وسائط الإعلام مع 2 مل 10 دميم الطازجة وتسمح ح 48-72 للانتعاش.
    5. تعبئة الخلايا مع 150 ميليلتر من 0.05% التربسين-يدتا. احتضان لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. آرو مع 1.5 مل 10 دميم. نقل الخلايا إلى 15 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. قم بإزالة الوسائط والخلايا الموجودة في المخزن المؤقت تحلل ميليلتر 100 قدم في أدوات التحليل لوسيفراس ريسوسبيند. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نقل ليساتيس إلى أبيض 96-جيدا لوحة ومقايسة لنشاط لوسيفراس باستخدام البروتوكول المضمنة مع هذه المجموعة. استخدام خلايا Xa كعنصر إيجابي والحادي عشر الخلايا المصابة مع موجه لينتيفيرال فارغ كعنصر سلبي.
      ملاحظة: تجنب تعريض لوحات بيضاء على ضوء الفلورسنت قبل الفحص؛ وهذا الحد من الخلفية وزيادة حساسية المقايسة. تم العثور على البروتوكول بتوفيرها في أدوات التحليل لتكون أكثر فعالية إذا كان أداؤها في الظلام كلما كان ذلك ممكناً.
    7. لتحديد ما إذا دبوس كان لها تأثير على مستوى التعبير MeCP2 على X-chromosome النشطة، عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الحادي عشر تراندوسيد وقياس مستوى مرناً MeCP2 باستخدام PCR الكمي مع الإشعال تهدف إلى تضخيم فقط نوع البرية MeCP2 (f: --تككاتجككاجككااكاج 5 '-3', R: 5 '-كككاتاجاجاجاجاكاكاجك-3').
    8. الاختياري: زيادة حساسية المقايسة بإضافة 5-العزة لتركيز 0.2 ميكرون نهائي بعد أن شُفي الخلايا من التحديد بوروميسين. الثقافة الخلايا ح 72 دون استبدال وسائط الإعلام، والاعتداء ثم لنشاط لوسيفراس باستخدام طقم الإنزيم لوسيفراس التجارية.
    9. تدبير إعادة تنشيط MeCP2 البرية من نوع كاتم. تصيب الخلايا Xa، التي تأوي نوع البرية MeCP2 في الحادي عشر، مع الموجه التي تحتوي على دبابيس الشعر الفردية، اتباع الخطوات بروتوكول 3.2.1. -3.2.4. عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا وقياس مستوى مرناً MeCP2 باستخدام PCR الكمي مع الإشعال تهدف إلى تضخيم فقط نوع البرية MeCP2 (5 واو: '-تككاتجككاجككااكاج-3', r: 5 '-كككاتاجاجاجاجاكاكاجك-3').

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت تحصد الماوس الأربطة الليفية من سبق وصفها س سMeCP2-لوك-الموارد البشريةالمستنسخة باستخدام إضعاف الحد الماوسMeCP2 الإناث، خلدها بتوصيل النسخ العكسي المسرطنة E6 و E7 من virus7 فيروس الورم الحليمي البشري-16، واختبار ل نشاط لوسيفراس والتعبير عن البروتين MeCP2 البرية من نوع (الشكل 1A و 1B). وكان النشاط لوسيفراس قوية إذا كان المراسل على شي، ولا يمكن الكشف عنها إذا كانت في الحادي عشر؛ التعبير MeCP2 الأصلية معروضة على نمط المعاملة بالمثل. نحن نخبة من استنساخ مع أي نشاط لوسيفراس (الحادي عشر-8) واستنساخ مع نشاط قوي (Xa-3) لإجراء مزيد من التجارب. عندما كانت تعامل الخلايا الحادي عشر-8 مع 5-عزة، لوحظ تحريض تعتمد على الجرعة في نشاط لوسيفراس (الشكل 1).

تم اختبار حساسية الخلايا الحادي عشر-8 و Xa-3 إلى هيجروميسين ب بإجراء تحديدات استغرقت 3 و 6. حادي عشر-8 خلايا كما هو متوقع من نمط التعبير لمراسل لوسيفراس، كانت أكثر حساسية هيجروميسين ب من الخلايا Xa-3، على الرغم من أن هذه الأخيرة أظهرت حساسية لجرعات أعلى (الشكل 2A). بعد مزيج من 1: 100 Xa-3 للحادي عشر-8 خلايا كانت تركيزات التعرض لمختلف لوحظ هيجروميسين ب، زيادة بنسبة تعتمد على الوقت في النشاط لوسيفراس، مشيراً إلى المنافسة الناجحة للخلايا Xa-3 على الحادي عشر-8 خلايا (الشكل 2). تم اختيار الجرعة والمدة لاختيار هيجروميسين ب للمزيد من التجارب استناداً إلى تثبيط تفضيلية للحادي عشر-8 خلايا Xa-3.

وأجريت أربع شاشات مستقلة لتحديد المنظمين لإسكات MeCP2 استخدام خط الخلية الحادي عشر-8 ومير "النظم البيولوجية مفتوحة"-30-شرنا استناداً إلى المكتبة التي تحتوي على دبابيس الشعر مختلفة 64,159 المستنسخة في مسكفشرنابجكبورويريسجفب للفيروسات الرجعية ناقلات الأمراض. في كل شاشة، كانوا مصابين بعشرين سم 10 لوحات شرناس المجمعة، استهداف حوالي 100-fold تغطية للمكتبة. وأجرى هيجروميسين ب 6 أيام حتى لوحظت بقع اللاخلوي الصغيرة؛ وواصل الخلايا للموت من أجل إضافية 24 إلى 48 ساعة. عند استردادها، وكان حصاد الخلايا لاستخراج الحمض النووي باستخدام تقنية فينول كلوروفورم. وكان إجمالي العائد الحمض النووي كل شاشة حوالي 20 ميكروغرام/اللوحة، التي تجمع ومقسمة بين 100 ردود PCR باستخدام كبسولة تفجير تهدف إلى تضخيم النصف-دبابيس الشعر. منتجات PCR ثم تنقيته حبة ويخضع لتسلسل إنتاجية عالية.

كانت مقارنة عينات ما قبل وما بعد التحديد لتحديد دبوس تخصيب اليورانيوم، كما كنا نتوقع أن تستهدف أي دبوس الحالي في مستويات مرتفعة في العينة بعد اختيار الجينات التي أعادت تنشيط الحادي عشر، وهكذا منحت المقاومة هيجروميسين. واعتبرت فقط دبابيس الشعر أثري في 2 على الأقل من أربع شاشات للتحقق من الصحة. دبابيس الشعر المخصب الأكثر في جميع replicates من الشاشة بأربعة دبابيس الشعر استهداف إكسيست، تمشيا مع دورها الحاسم في إكسسي11.

نفذ الجزء التحقق من الشاشة بشكل فردي اختبار دبابيس الشعر التي سجلت كمرات للتنشيط لمراسل لوسيفراس في الحادي عشر-8 خلايا. على الرغم من أن الشاشة تم باستخدام مكتبة الفيروسات التراجعية على أساس مسكف، أجريت التحقق من الصحة باستخدام ناقل لينتيفيرال (استنساخ بجيبز الفردية مع شرنا) لتجنب إمكانية الكشف عن التحف المستحثة بلفي.

كان هدفا لكل من الجينات المرشحة تسلسلين دبوس مختلفة على الأقل، وتم التحقق من ضربة قاضية للجين المستهدف بالوقت الحقيقي PCR الكمي (RT-قبكر). بالمعايرة تصل إلى 1 × 106 خلايا في الشكل 6-جيدا وتقليص التﻷلؤ الخلفية (الشكل 2)، كنا قادرين على الكشف عن الأحداث ذات التردد المنخفض جداً إعادة تنشيط، الذي قدرنا أن يكون في نطاق 1:20,000.

مزيد من التحليل باستخدام دبابيس الشعر الفردية أدت إلى تحديد الجينات 30 الذي ضربة قاضية أدت إلى تنشيط المراسل الخاص بالحادي عشر. وكان متوسط حجم التﻷلؤ لهذه الجينات 30 حققت أعلاه الأساس، الذي كان وسع للعلاج 5-عزة التالية 7.1-fold. دبابيس الشعر نفس تم اختبارها، بالاقتران مع 5-العزة، مع الخلايا Xa-3 لتأكيد إعادة التعبير عن نوع البرية MeCP2 من الحادي عشر. وقد تحقق ذلك عن طريق إجراء RT-قبكر استخدام كبسولة تفجير تهدف إلى تضخيم فقط نص نوع البرية MeCP2.

Figure 1
الشكل 1. عزل الحيوانات المستنسخة مع الجين MeCP2-لوك-HR مراسل في الحادي عشر.
A) استنساخ الإنزيم لوسيفراس اليراع الممثل على وتر مخلدة الليفية (1-9). الليفية الأولية من غير المعدلة وراثيا (NT) والإناث متخالف المحورة وراثيا (و) استخدمت كعناصر سلبية وإيجابية، على التوالي. ب) الممثل الغربية وصمة عار عرض التعبير البروتين MeCP2 من الخلايا الموجودة في (أ). ملاحظة أن نشاط لوسيفراس (الشكل 1A) والتعبير MeCP2 معرض نمط التعبير المتبادل. ج) تحريض اليراع لوسيفراس النشاط في الخلايا الحادي عشر-8 مع 5-عزة. خلايا Xa-3، مع الجين المراسل في Xa، كعنصر إيجابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2. توصيف المقاومة هيجروميسين في خلايا الحادي عشر-8 و Xa-3.
أ) نمو الخلايا الحادي عشر-8 و Xa-3 النسبية تعامل مع أنظمة مختلفة هيجروميسين ب (3D = 3 أيام؛ 6 = 6 أيام)، بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة. ب) لوسيفراس نشاط تخصيب اليورانيوم بعد تعريض مجموعة 10,000 Xa-3 والحادي عشر-8 خلايا (المختلطة بنسبة 1: 100) إلى هيجروميسين ب (25 ميكروغرام/مل) أشارت إلى عدد من الأيام. وقسمت النشاط بعد التعرض لوسيفراس بمستوى ما قبل التعرض لحساب الإثراء. ج) اليراع لوسيفراس النشاط في الحادي عشر-8 خلايا، جزيئي في تنسيق جيد 96 و 6، مع أو بدون 5-عزة (10 ميكرون). عدم وراثيا (NT) الليفية استخدمت كعنصر سلبي. 5-عزة زيادة النشاط لوسيفراس 7.2 و 86 ضعفا فوق خط الأساس في شكل جيد 96 و 6، على التوالي. (N = 3، * p < 0.001، * * ف < 0.0001 بالاختبار t مقارنة 5-العزة الطالب تعامل ودون علاج الخلايا الحادي عشر-8.) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في مؤخرا دراسة6ونحن إنشاء خط خلية مورين مع لوسيفراس وجينات مقاومة هيجروميسين تنصهر فيها MeCP2 في الحادي عشر، وترانسدوسيد أنه مع مكتبة > استهداف شرناس 60,000 > 25,000 الجينات. وجدنا 30 الجينات التي ميزة تدق لأسفل الممنوحة للبقاء على قيد الحياة تحت هيجروميسين ب التحديد، مما يوحي بدورها في مراقبة MeCP2 وإسكات X-chromosome. تم التحقق من صحة هذه النتائج ترانسدوسينج خط الخلية المبلغ عنها مع دبابيس الشعر الفردية وتقييم تنشيط المراسل لوسيفراس الصمت.

وقدمت الاستنتاج أن تستهدف دبابيس الشعر الأربعة الأعلى في جميع replicates من الشاشة إكسيست التحقق من صحة داخلية قوية لأسلوبنا، نظراً للدور المحوري إكسيست في إكسسي11. وبصرف النظر عن فوق عائلة TGFβ، دورها التنظيمي في إكسسي لا الموصوفة سابقا، الجينات المحددة الأخرى كافة ينتمون إلى عائلات وظيفية مع الروابط للائحة جينية، وبالتالي تخدم إضافي للتحقق من صحة لدينا أسلوب12 , 13 , 14-وعلاوة على ذلك، نحن أيضا الكشف عن 4 من أصل 13 الجينات التي سبق تحديدها في شاشة مختلفة، استخدام CMV بروتينات فلورية خضراء عشوائياً بإدراجه في الحادي عشر15يحركها المروج.

تحديد الجرعة المناسبة ومدة هيجروميسين ب التحديد كان عاملاً حاسما في تحسين شروط الفحص. حساسية لدينا خط الخلية تعتمد اعتماداً كبيرا على بذر الكثافة، وتأثر سلبا بالإصابة بالفيروس. زيادة الجرعات أو طول التحديد أيضا تثبيط نمو الخلايا مع المراسل في Xa، حين اختيار أكثر اعتدالا خفض الحساسية لإثراء دبوس. وبالتالي تم اختبار أنظمة الجرعات هيجروميسين ب وخلية مراسل البذر كثافات متعددة قبل الفرز النهائي. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن مسكف ناقل للفيروسات الرجعية في مكتبتنا شرنا فرصة لاستخدام التحديد بوروميسين وإثراء للخلايا ترانسدوسيد بنجاح، بوروميسين لم يستخدم في تجاربنا، كاستخدام متسلسلة من بوروميسين وهيجروميين ب نتج عن السمية المفرطة، حتى بعد التصعيد الجرعة المناسبة من المضادات الحيوية على حد سواء.

أيضا تنشيط كافة دبابيس الشعر تم تحديدها في دراستنا المراسل لوسيفراس الصمت، أن كان ذلك بدرجة أكثر تواضعا. تمكين الكشف عن هذه الأحداث نادرة كان بحساسية عالية للشاشة، التي قمنا بتقدير، استناداً إلى التجارب إضافات الخلايا الحادي عشر و Xa، حدث تنشيط واحد في 2 × 104 خلايا. هذه المستويات المنخفضة لإعادة تنشيط، زادت مع التطبيق المشارك من 5-عزة، وتشهد على الصعوبات التي سبق وصفها في تعطيل التحكم النسخي ضيق إكسسي12،13،،من1617، و ينطوي على ضرورة تعطيل آليات تنظيمية متعددة لتحقيق إعادة تنشيط كبيرة.

من المذكرة، تنشيط كل دبابيس الشعر 30 تم تحديدها في شاشة لدينا أيضا جين مراسل يحركها CMV الموجود محور X-chromosome مختلفة، مما يشير إلى تأثيرها أوسع نطاقا على القمع دي الحادي عشر. يلزم إجراء مزيد من الدراسات لاختبار ما إذا كانت توجد MeCP2 الخاصة "ريكتيفاتورس"، كما يمكن أن تثبت التلاعب بهم دوائية أو الوراثية مفيدة للغاية في علاج متلازمة ريت.

لدينا نظام الفحص يوفر العديد من المزايا للصحفيين تم وصفه مسبقاً المستخدمة ل X-chromosome تنشيط شاشات12،17. بدلاً من يقودها أحد المروجين CMV، لدينا كاسيت مراسل هو طرقت في ج-المحطة من MeCP2 وهكذا تحركها المروج ترتبط X أصلي. هذا التصميم تساعد في التعرف على MeCP2 الخاصة بمحور المنظمين، أكثر أهمية في سياق البحوث متلازمة ريت، مع تحذير لخص النتائج في الخلايا الليفية مخلدة في الخلايا العصبية، في الموقع المطلوب من MeCP2 إعادة التنشيط. يتيح التحديد الإيجابي لإحداث إعادة تنشيط استخدام الجينات المقاومة هيجروميسين ويزيد من قوة حساسية الشاشة. وعلاوة على ذلك، تمكن الكاسيت التي تحتوي على جينات لوسيفراس اليراع والمقاومة هيجروميسين سواء على نطاق واسع الفحص باستخدام التحديد الإيجابي مع هيجروميسين ب، والاختبار والفرز الفردية باستخدام المحرر لوسيفراس دبابيس الشعر.

وباختصار، نحن تقرير أسلوب فحص الوراثي قوية وحساسة للتعرف على المنظمين MeCP2 و X-chromosome إسكات في خلايا الثدييات. هذه المنهجية يمكن تكييفها لفحص الكشف التدخل الصغيرة (سيرناس)، كريسبر، أو الجزيئات الصغيرة. مثل هذه الاختبارات يمكن أن تكون مفيدة في تحديد النهج العلاجية التي تعتمد على إعادة تنشيط اليل الوظيفية الجينات الصامتة، كما هو الحال في حالة متلازمة ريت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور ليكو ساهمت هذه المادة كموظف بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان.  الآراء التي أعرب عنها هي بلده ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو المعاهد الوطنية للصحة

Acknowledgments

ونحن نشكر ديكينس روس من جامعة ملبورن تكرم توفير مكتبة شرنا المستخدمة في الشاشة. تم تمويل هذا العمل من ريت متلازمة البحوث الثقة (أتال بيهاري).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).

Tags

علم الوراثة، العدد 133، المنظمة إكستشروموسومي، التخلق، MeCP2، شرنا متلازمة، زيست، ريت، فحص
شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. … More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter