Summary
Vi rapporterar en liten hårnål RNA (shRNA) och nästa generations sekvensering-baserat protokoll för att identifiera regulatorer av x-kromosomen inaktivering i en murin cellinje med firefly luciferas och hygromycin antibiotikaresistensgener smält till metyl CpG bindande protein 2) MeCP2) gen på inaktiva X-kromosomen.
Abstract
Framåt genetiska skärmar använder reporter generna infogas i Heterokromatin har använts i stor utsträckning att undersöka mekanismer för epigenetisk kontroll i modellorganismer. Teknik inklusive kort hårnål RNAs (shRNAs) och klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) har aktiverat sådana skärmar i diploida däggdjursceller. Beskriver här vi en storskalig shRNA skärm för regulatorer av x-kromosomen inaktivering (XCI), med en murin cellinje med firefly luciferas och hygromycin antibiotikaresistensgener knackade i på C-terminus av metyl CpG-bindande protein 2 (MeCP2) genen på inaktiva x-kromosomen (Xi). Reaktivering av konstruktionen i reporter cell linje som tilldelats överlevnadsfördel under hygromycin B urval, så att vi kan skärmen stora shRNA bibliotek och identifiera hårnålar som återaktiveras reportern genom att mäta deras efter urval berikning med hjälp nästa generations sekvensering. De berikade hårnålar validerades sedan individuellt genom att testa sin förmåga att aktivera luciferas reportern på Xi.
Introduction
En de vanligaste formerna av ärftlig psykisk funktionsnedsättning hos kvinnor, Rett syndrom, orsakas av heterozygota mutationer i MeCP2, en x-kromosom gen som kodar för ett protein som är nödvändigt för normal nervcellernas funktion1. En potentiell metod för behandling av denna sjukdom skulle vara reaktivering av vildtyp MeCP2 allelen på Xi, som återställandet av MeCP2 uttryck visades att vända neurologiska bortfall i en musmodell av denna sjukdom1, 2 , 4. dock tätt epigenetiska Tystande av en av de två X-kromosomer i kvinnliga celler upprätthålls under hela livslängden för en organism3,4, och robust reaktivering av en Xi-gen skulle sannolikt kräva ett större störningar i flera epigenetiska rättsliga vägar.
För att identifiera faktorer som är nödvändiga för underhåll av MeCP2 ljuddämpning, vi först utvecklades en transgen musmodell som bär en MeCP2- luciferas - hygromycin motstånd gen fusion (MeCP2-LUC-HR) på en av de två X-kromosomer (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Även om den MeCP2 uttryckt från den fusion konstruktionen visade sig vara instabil och resulterade i en förlust av funktion, fenotypiskt symtom liknande MeCP2 borttagning i hemizygous män (XMeCP2-LUC-HR/y), uttrycket av generna som reporter var lätt upptäckas i ett mönster som överensstämmer med uttrycket av endogena MeCP25. Vi sedan genereras förevigade fibroblast kloner med konstruktionen på antingen inaktiv eller aktiv x-kromosom, och bekräftade att före detta uttryckte vildtyp MeCP2 och inte den reporter bygga; inversen var sant för den senare. När de utsätts för en DNA demethylating agent känd att upphäva nedtystning, 5-azacytidine (5-AZA), celler med reporter på Xi (”reporter cellerna”) fick aktivitet i en Mareld-analys, som visar att vår konstruktion kan återaktiveras och därför används för genetisk screening.
Därefter utvecklade vi en hög genomströmning genetisk skärm för tillsynsmyndigheter att MeCP2 tysta. Reporter cell linjen var först infekterad med en retrovirala bibliotek som innehåller > 60.000 olika shRNAs inriktning > 25000 gener i hela musen genomet5,6, och sedan genomgå hygromycin B urval. Hårnål frekvens jämfördes i före och efter urval exempel med nästa generations sekvensering, som reporter reaktivering tillväxt fördel under hygromycin B urval och resulterade i berikning av ansvarig hårnålar. Använder denna metod, vi identifierat 30 gener inblandade i MeCP2 ljuddämpning, och därefter bekräftade resultaten genom transducing reporter cellerna med enskilda hårnålar och mäta deras luciferas aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla åtgärder som inbegriper djur genomfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC). Inga reagenser som används här är kända för att utgöra betydande mänskliga hälsorisker med undantag för 5-azacytidine (5-AZA).
1. generera en reporter cellinje med MeCP2- LUC-HR transgenens på Xi
-
Förbereda mus senan fibroblaster från en hona XMeCP2-LUC- HR/xMeCP2 mus
- Avliva en 10-12 dag-gammal hona XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 mus.
- Med raka dissektion sax, göra en omkretsriktningen snitt genom huden av proximala svansen delen.
- Håll kadavret nära basen av svansen, dra huden från musen för att exponera den fibrocartilaginous delen av svansen. Ta ut och skär terminalen 10 mm av den exponerade vävnaden i 1 mm långa fragment med en kirurgisk skalpell.
- Överföring fragmenterade vävnaden till en 15 mL koniska rör innehållande 5 mL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 1 U/mL penicillin 1 µg/mL streptomycin och 1,5 mg/mL kollagenas, pre filtreras genom 0.45 µm och sedan 0,2 µm Nätfiltren. Inkubera under 3-4 timmar vid 37 ° C med kontinuerlig rotation.
- Centrifugera provet vid rumstemperatur vid 500 x g i 10 min. återsuspendera pelleten i 10 mL DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1 U/mL penicillin, och 1 µg/mL streptomycin (DMEM-10) och plattan på en 6-väl vävnadsodling tallrik. Passagen cellerna en gång och utöka till en 10 cm platta innan du fortsätter till nästa steg.
- Föreviga cellerna genom att utföra en transduktion med ett uttryck vektor transporterar HPV 16 viral onkgener (E6/E7), som tidigare beskrivits7.
-
Att välja enskild cell kloner och karaktärisera MeCP2 reporter uttryck
- Skörda cellerna från en 10 cm platta. Först aspirera media, tillsätt 1 mL 0,05% trypsin-EDTA och Inkubera under 2-5 minuter vid 37 ° C. Släcka med 9 mL DMEM-10 och samla återsuspenderade cellerna i en 15 mL koniska rör.
- Späd cellerna med DMEM-10 till en slutlig koncentration på 1 cell/100 µL. överför till 96 brunnar genom pipettering 100 µL av suspensionen i varje brunn.
- Inkubera vid 37 ° C tills brunnarna är konfluenta, vilket kan ta upp till 2-3 veckor. Ersätta media med färska DMEM-10 var 3-5 dagar. När konfluenta, mobilisera cellerna med 20 µL av 0,05% trypsin-EDTA per brunn och dela dem till två dubbla uppsättningar med 96 brunnar.
- Använd en uppsättning tallrikar till assay för luciferas aktivitet. Använd en homogen firefly luciferas assay kit som inte kräver media borttagning. Följ det protokoll som medföljer kitet.
- Använd resultatet från steg 1.2.4 för att välja kloner med ingen påvisbar luciferas aktivitet från den återstående uppsättningen tallrikar. Expandera dessa kloner till 24-väl och sedan 6-väl plattor.
- Utföra samma för en klon med högsta luciferas verksamheten. Detta kommer att användas som en positiv kontroll för validering.
- Skörda en alikvot av varje brunn i 6-väl plattan för en Western blot. Mobilisera cellerna med 200 µL 0,05% trypsin-EDTA. Inkubera under 2-5 minuter vid 37 ° C. Släcka med 2 mL DMEM-10 och överföra hälften av cellerna till 1,5 ml centrifugrör. Tvätta cellerna en gång med PBS innan lyseringslösning för Western blot. Alternativt överföra hälften av cellerna till en annan 6-väl tallrik. När cellerna fäster till botten av plattan, skölj med PBS och lyse för Western blot.
- Utföra en Western blot med anti-MeCP2 antikropp att bekräfta att luciferas-negativa celler uttrycker, medan luciferas-positiva celler inte uttrycker vildtyp MeCP2 från active X-kromosomen; Följ de tidigare beskrivna protokollet8. Använd hjärnvävnad lysat från någon vildtyp mus som positiv kontroll.
- Tallrik flera negativa kloner på 2 x 105 celler per brunn i en 6-bra platta. Behandla en gång med 10 µM 5-AZA, inkubera i 72 h utan att ändra media och analys för luciferas verksamhet som beskrivs i steg 1.2.3.
- Välja en negativ klon (Xi klon) som fått luciferas aktivitet med 5-AZA och börja utöka det till flera 10 cm plattor. Frys återstående negativa kloner i flytande kväve som backup. Den positiva klonen (Xa klon) kan upprätthållas i vävnaden kultur eller frysta till vidare användning.
2. screening biblioteket för återaktivering med hygromycin B urval
-
Infekterar test klonen, tillämpa urval och skörd DNA för sekvensering
- Skaffa viral koncentrat av retrovirala konstruktioner uttrycker hårnålar från ett shRNA bibliotek, eller producera koncentrerade viral supernatanten med protokollet ingår med önskad biblioteket.
- Innan skärmen, titrera biblioteket (med GFP markör, om tillgängligt). Målet för en multiplicity av infektion mellan 0,3 och 0,5.
Obs: Utföra minst fyra oberoende skärmar för att minimera falska positiva priser. Använd 20 plattor per skärm för att få 100-faldig täckning av biblioteket för att upprätthålla tillräcklig representation av hårnålar och undvika slumpmässiga dropouts9. Dock är gett positiva urval skärm och ett stort bibliotek storlek, det sannolikt att en lägre täckning skulle räcka. - På morgonen, tallrik 1 x 106 Xi celler på 10 cm vävnadsodling plattor.
- På eftermiddagen, infektera plattorna genom att ersätta mediet med färska DMEM-10 som innehåller viral supernatanten och 5-10 µg/mL polybrene. Använd mängd viral supernatanten bestäms i steg 2.1.2.
- Efter 18-24 h, aspirera media och tillsätt 10 mL av färska DMEM-10 till varje platta. Kultur för en annan 48 h.
- På morgonen, mobilisera cellerna med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA per platta och släcka med 9 mL DMEM-10 per platta. Kör suspensionen genom en 100 µm mesh-filter. Sammanföra de filtrerade suspensioner och utsäde två uppsättningar av 10 cm plattor på 1 x 106 celler/platta.
- På eftermiddagen, ersätta media i en uppsättning av plattor med DMEM-10 som innehåller 15 µg/mL hygromycin B (dag 0). I andra set, ersätta mediet med färska DMEM-10 endast.
- Efter 48 timmar, mobilisera cellerna från obehandlade uppsättning tallrikar med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkubera under 2-5 minuter vid 37 ° C. Släck med 9 mL DMEM-10. Överföra cellerna till 15 ml koniska rör och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanterna och omedelbart gå vidare med att utvinna DNA från pellets. Alternativt, pool cellerna in större rören innan centrifugeringssteget.
- Extrahera DNA med en blandning av fenol och chroroform och fällningen DNA med natrium acetat och kalla etanol som tidigare beskrivits10. Slå samman de enskilda förval DNA-proverna och förvaras vid-20 ° C tills vidare användning.
- Fortsätta odla hygromycin B urval för 4 dagar. Fylla på val av media med färska DMEM-10 innehållande hygromycin B efter 2 dagar.
- Dag 7, ersätta urval media med färska DMEM-10 endast. Låt 2-4 dagar för återhämtning och sedan skörda cellerna som beskrivs i steg 2.1.8. Fortsätt med DNA-extraktion som beskrivs i steg 2.1.9.
-
Identifierande hårnålar berikad i efter urval prover
- Använd 5' sammanhang (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') och 3' reverse loop primers (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') att förstärka halv-hårnålar från före och efter urval DNA-prover. Använda alla extraherat DNA i separat PCR-reaktioner med 100-200 ng DNA per reaktion.
Obs: Dessa 5' sammanhang primer och 3' reverse loop primers motsvarar sekvensen miR-30 sammanhang uppströms shRNA införda sekvensen på shRNA slingan, respektive. Olika bibliotek kommer att kräva olika oligos. Justera reningssteg för att isolera olika produktstorlekar som behövs. - Använd storlek-urval pärlor ta bort primers och genomiskt DNA och återställa PCR-produkter mellan 100 och 200 bp. följa protokollet ingår med pärlor.
- Förbereda ett sekvensering bibliotek att sekvensera de halv-hårnålar. Generera minst 50 miljoner läsningar per skärm. Följ protokollet som är lämpliga för sekvensering kit och utrustning.
Obs: 50 miljoner läsningar per skärm ger 1000-fold representation av varje shRNA i biblioteket och ca 10-faldig täckning av varje oberoende infektion (utförs vid 100-faldig representation av varje shRNA), vilket säkerställer tillräcklig representation av varje infektion händelse. - Räkna upp varje shRNA använder ett Perl-skript som räknas sekvenser med perfekt matcher. Valde shRNAs som hade minst 10 läsningar i Landpreselection poolen för ytterligare analys. Beräkna rikedomar som nyckeltal efter att preselection räknar och avgöra falsk upptäckten hastighet (FDR) på grundval av 1000 permutationer. Valde gener riktade av shRNAs med < 5% FDR som ”träffar” för ytterligare tester.
- Använd 5' sammanhang (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') och 3' reverse loop primers (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') att förstärka halv-hårnålar från före och efter urval DNA-prover. Använda alla extraherat DNA i separat PCR-reaktioner med 100-200 ng DNA per reaktion.
3. validera de identifierade hårnålar (”hits”)
-
Förpackning lentiviruses innehållande shRNAs som identifierats i skärmen
- Utsäde 8 x 106 293 FT celler per platta på 10 cm tallrikar.
- Följande dag, ersätta mediet med 9 mL av antibiotikum-fri DMEM-10 per platta; göra detta 30 minuter innan transfection.
- Under 30 minuters intervall, Förbered två mixar transfection:
- Förbereda blanda 1 (per tallrik/shRNA; skala upp enligt det totala antalet shRNAs): 10 µL av 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) i 0,5 mL av optimal minsta nödvändiga media. Blanda genom pipettering och odla i rumstemperatur i 5 min.
- Förbereda blanda 2 (per shRNA): 4 µg shRNA vektorns paketeras, 1,5 µg VSV-G kuvert vektorns (pMD2.G) och 2,5 µg vektorns förpackning (psPAX2), blandad i 0.5 mL optimal minsta nödvändiga media.
Obs: Inkludera en tom lentiviral vector i förpackningen för att använda vid senare infektioner som en negativ kontroll.
- Tillsätt 0,5 mL blandning 1 till varje alikvot av mix 2 och blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 20 min.
- Applicera blandningen på varje tallrik från steg 3.1.2 i en droppvis mode; snurra plattan försiktigt för att blanda.
- Följande dag, ersätta mediet med 5 mL färsk DMEM-10.
- 48 timmar efter inledande transfection, samla supernatanten och köra det genom ett 0,22 µm filter. Pre våt filtret med DMEM-10 att maximera återhämtning.
- Alikvot filtrerade supernatanten i belopp idealisk för infekterar en 6-well platta väl.
- Frysa alikvoter vid-80 ° C för senare användning eller omedelbart gå vidare med transduktion.
-
Transduktion och provning av individuella hårnålar för luciferas reporter reaktivering och reaktivering av vildtyp MeCP2 gen på Xi.
- På morgonen, tallrik 1 x 105 Xi celler per brunn på 6 plattor.
- På eftermiddagen, infektera plattorna genom att ersätta mediet med 2 mL färsk DMEM-10 som innehåller lentiviral supernatanten och 5-10 µg/mL polybrene. Infektera en kontroll väl med viral supernatanten produceras från en tom lentiviral vector.
- Följande dag, ersätta mediet med 2 mL DMEM-10 innehållande 1 mg/mL puromycin. Kultur i fyra dagar.
- Ersätter media med 2 mL färsk DMEM-10 och tillåter 48-72 h för återhämtning.
- Mobilisera cellerna med 150 µL av 0,05% trypsin-EDTA. Inkubera under 2-5 minuter vid 37 ° C. Släck med 1,5 mL DMEM-10. Överföra cellerna till 15 ml koniska rör och centrifugera vid 500 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort media och resuspendera cellerna i 100 μl lyseringsbuffert i luciferas assay kit. Odla i rumstemperatur i 5 minuter. Överföring av lysates till en vit plattan med 96 brunnar och analys för luciferas aktivitet med hjälp av protokollet som medföljer kitet. Använda Xa celler som positiv kontroll och Xi celler infekterade med en tom lentiviral vektor som en negativ kontroll.
Obs: Undvik att utsätta de vita tallrikar till fluorescerande ljus före analysen; Detta kommer att minska bakgrunden och öka analysens känslighet. Protokollet i assay kit befanns vara mest effektiv om den utförs i mörkret när det är möjligt. - För att avgöra huruvida hårnål hade en effekt på uttrycket andelen MeCP2 på active x-kromosomen, isolera RNA från tranduced Xi celler och mäta MeCP2 mRNA-nivå med kvantitativ PCR med grundfärg avsedd att förstärka endast vildtyp MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
- Tillval: Öka känsligheten för analysen genom att lägga 5-AZA till en slutlig koncentration på 0,2 µM efter cellerna har återhämtat sig från puromycin urval. Odla cellerna för 72 h utan att ersätta media och sedan assay för luciferas aktivitet med hjälp av kommersiella luciferas assay kit.
- Mäta reaktivering av den tystade vildtyp MeCP2. Infektera Xa celler, som hyser den vilda typ MeCP2 på Xi, med vektorn som innehåller enskilda hårnålar, efter protokollstegen 3.2.1. -3.2.4. Isolera RNA från celler och mäta MeCP2 mRNA-nivå med kvantitativ PCR med grundfärg avsedd att förstärka endast vildtyp MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus senan fibroblaster skördades från en tidigare beskrivna XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 kvinnliga mus, förevigade av retrovirala transduktion av E6 och E7 onkogener från HPV-16 virus7, klonas med begränsande utspädning och testats för luciferas aktivitet och uttryck av vildtyp MeCP2 proteinet (figur 1A och 1B). Luciferas aktivitet var robust om reportern var på Xa och omätbara om på Xi; infödda MeCP2 uttrycket uppvisade ett reciprocal mönster. Vi valde en klon utan luciferas aktivitet (Xi-8) och en klon med robust aktivitet (Xa-3) för ytterligare experiment. När Xi-8 celler behandlades med 5-AZA, observerades en dosberoende induktion i luciferas aktivitet (figur 1 c).
Känslighet av Xi-8 och Xa-3 celler till hygromycin B testades genom att utföra 3 och 6 dagar långa markeringar. Som förväntat från uttrycksmönstret av luciferas reporter, var Xi-8 celler mer känsliga för hygromycin B än Xa-3 celler, även om den senare uppvisade känslighet att högre doser (figur 2A). Efter en 1: 100 blandning av Xa-3 till Xi-8 celler var utsatta för olika koncentrationer av observerades hygromycin B, en tidsberoende ökning i luciferas aktivitet, som visar framgångsrik konkurrens av Xa-3 celler över Xi-8 celler (figur 2B). Dos och behandlingstid hygromycin B urval valdes för ytterligare experiment baserat på förmånliga hämning av Xi-8 över Xa-3 celler.
Fyra oberoende skärmar utfördes för att identifiera regulatorer av MeCP2 ljuddämpning med raden Xi-8 cell och en Open Biosystems miR-30-baserade shRNA bibliotek som innehåller 64,159 olika hårnålar klonade in ett MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retrovirala vektor. I varje skärm, var tjugo 10 cm plattor infekterade med poolade shRNAs, inriktning på ca 100-faldig täckning av biblioteket. Hygromicin B genomfördes för 6 dagar, tills små acellulärt fläckar observerades; cellerna fortsätter att dö för ytterligare 24 till 48 timmar. När återvunna, skördades cellerna för DNA-extraktion med en fenol-kloroform teknik. Den totala DNA avkastningen per skärm var runt 20 µg/plattan, som var poolade och uppdelat mellan 100 PCR-reaktioner med grundfärg avsedd att förstärka halv-hårnålar. PCR-produkterna var sedan pärla-renat och utsätts för hög genomströmning sekvensering.
Före och efter urval prover jämfördes för att avgöra hårnål berikning, som vi förväntade oss att någon hårnål som är närvarande vid förhöjda nivåer i efter urval urvalet riktade gener som kan reaktiveras Xi och sålunda tilldelade hygromycin motstånd. Endast hårnålar berikad i minst 2 av fyra skärmar ansågs för validering. De mest berikat hårnålar i alla replikat av vår skärm var fyra hårnålar inriktning XIST, överensstämmer med dess avgörande roll i XCI11.
Den validering delen av skärmen genomfördes genom att individuellt testa de hårnålar som registrerad som träffar för aktivering av luciferas rapportören i Xi-8 celler. Även om skärmen utfördes med en MSCV-baserat retrovirala bibliotek, utfördes valideringen med en lentiviral vektor (individuella pGIPZ kloner med shRNA) att undvika möjliga upptäckt av retrovirus-inducerad artefakter.
Var och en av generna som kandidat riktades av minst två olika hårnål sekvenser, och överväldigande av målgenen verifierades med realtid kvantitativ PCR (RT-qPCR). Genom testmetoder upp till 1 x 106 celler i 6-väl format och minska den bakgrunden luminiscens (figur 2 c), har vi kunnat upptäcka mycket lågfrekventa reaktivering händelser, som vi beräknas vara i intervallet 1:20,000.
Ytterligare analys med hjälp av enskilda hårnålar ledde till identifiering av 30 gener vars knockdown resulterade i reaktivering av reporter på Xi. Median storleken på Luminiscens för dessa 30 gener var 2.8-fold ovanför baslinjen som förstärktes ytterligare till 7.1-fold följande 5-AZA behandling. De samma hårnålar var på nytt, tillsammans med 5-AZA, med Xa-3 celler att bekräfta nytt uttryck för vildtyp MeCP2 från Xi. Detta uppnåddes genom att utföra RT-qPCR med grundfärg avsedd att förstärka endast vildtyp avskriften av MeCP2.
Figur 1. Isolering av kloner med genen MeCP2-Luc-HR reporter på Xi.
(A) representativa firefly luciferas test på förevigade senan fibroblaster kloner (1-9). Primära fibroblaster från icke-transgena (NT) och transgena heterozygot hona (F) användes som negativa och positiva kontroller, respektive. (B) representant Western blot visar MeCP2 proteinuttryck från cellerna i (A). Observera att luciferas aktivitet (figur 1A) och MeCP2 uttryck uppvisar ömsesidiga uttryck mönster. (C) induktion av firefly luciferas aktivitet i Xi-8 celler med 5-AZA. XA-3 celler, med reporter gen på Xa, fungera som en positiv kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Karakterisering av hygromycin motståndet i Xi-8 och Xa-3 celler.
(A) relativ tillväxt av Xi-8 och Xa-3 celler behandlas med olika hygromycin B regimer (3D = 3 dagar; 6 d = 6 dagar), jämfört med obehandlad celler. (B) luciferas aktivitet anrikning efter utsätta sammanlagt 10.000 Xa-3 och Xi-8 celler (blandat i förhållandet 1: 100) till hygromicin B (25 µg/mL) för antal dagar som anges. Efter exponering luciferas aktivitet delades av nivån före exponeringen att beräkna anrikning. (C) firefly luciferas aktivitet i Xi-8 celler, analyseras i 96 - och 6-bra format, med och utan 5-AZA (10 µM). Icke-transgena (NT) fibroblaster användes som en negativ kontroll. 5-AZA ökade luciferas aktiviteten 7,2 och 86 gånger över baslinjen i 96 - och 6-bra format, respektive. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001 av Students t-test jämför 5-AZA behandlade och obehandlade Xi-8 celler.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår senaste studie6, genererade vi en murin cellinje med luciferas och hygromycin antibiotikaresistensgener smält till MeCP2 på Xi och sensorik det med ett bibliotek med > 60.000 shRNAs inriktning > 25000 gener. Vi hittade 30 gener vars knock-down tillerkänner överlevnadsfördel under Välj hygromycin B tyder på deras roll i kontrollen av MeCP2 och x-kromosomen tystar. Dessa resultat har validerats genom transducing den rapporterade cellinje med enskilda hårnålar och bedöma reaktivering av tyst luciferas reporter.
Konstaterandet att de översta fyra hårnålar i alla replikat av vår skärm riktad XIST föreskrivs en stark intern validering för vår metod, ges en nyckelroll för XIST i XCI11. Bortsett från TGFβ överfamiljen, vars reglerande roll i XCI inte hade beskrivits tidigare, tillhörde de andra identifierade generna som alla funktionella familjer med anknytning till epigenetisk reglering, således tjänstgör som en ytterligare validering för vår metod12 , 13 , 14. Dessutom vi också upptäckt 4 av 13 gener som tidigare identifierats i en annan skärm, använder en CMV arrangören-driven GFP slumpmässigt infogas på Xi15.
Om fastställande av lämplig dos och varaktigheten av hygromycin var B urval avgörande i optimera screening villkoren. Känsligheten hos våra cellinje var starkt beroende av sådd densitet, och påverkades negativt av retrovirala infektion. Ökade doser eller längden på urval också hämmade tillväxten av celler med reporter på Xa, medan mildare urval sänkte känsligheten för hårnål anrikning. Flera hygromycin B doseringsregimer och reporter cell sådd tätheter testades således innan sista visningen. Dessutom, även om den MSCV retrovirala vektorn i vårt shRNA bibliotek möjlighet att använda puromycin val och berika för framgångsrikt sensorik celler, puromycin användes inte i våra experiment, som sekventiell användning av puromycin och hygromyin B resulterade i överdriven toxicitet, även efter lämplig dos nedtrappning av båda antibiotika.
Alla de hårnålar som identifieras i vår studie återaktiveras också tyst luciferas reportern, om än i mer blygsam omfattning. Påvisande av dessa sällan händelser möjliggjordes av vår skärm, som vi beräknade, hög känslighet utifrån tester admixtures av Xi och Xa celler, att vara en reaktivering händelse i 2 x 104 celler. Sådana låga nivåer av reaktivering, ökade med samtidig tillämpning av 5-AZA, vittnar om tidigare beskrivna problem störa snäva transkriptionell kontroll XCI12,13,16,17, och innebär att störningar av flera reglerande mekanismer skulle behövas för att uppnå betydande reaktivering.
Notera återaktiveras alla 30 hårnålar identifieras i vår skärm också en CMV-driven reporter gen ligger på en annan x-kromosom locus, som anger deras bredare inverkan på Xi avinstallation förtryck. Ytterligare studier behövs för att testa huruvida MeCP2-specifika ”reactivators” existerar, eftersom deras farmakologiska eller genetisk manipulation kunde visa sig utomordentligt användbart vid behandling av den Rett syndromet.
Vår screening system erbjuder flera fördelar jämfört med de tidigare beskrivna reportrar som används för x-kromosom reaktivering skärmar12,17. I stället för att drivas av en CMV-promotor, vår reporter kassett är slogs i på C-terminus av MeCP2 och drivs alltså av infödda X-länkade arrangören. Denna design kan hjälpa till att identifiera MeCP2 locus-specifika tillsynsmyndigheter, mer relevant i samband med Rett syndrom forskning, med en varning att konstaterandena i förevigade fibroblaster bör vara återgetts i nervceller, önskad platsen för MeCP2 reaktivering. Användning av en hygromycin motstånd gen aktiverar positiva urval av reaktivering händelser och ökar kraftfullt skärmens känslighet. Dessutom kan kassett som innehåller hygromycin motstånd och firefly luciferas gener både storskalig screening med positiva urval med hygromycin B och testning/screening enskilda hårnålar med luciferas reportern.
Sammanfattningsvis kan rapportera vi en robust och känslig genetisk screeningmetod för identifiering av regulatorer av MeCP2 och x-kromosom ljuddämpning i däggdjursceller. Denna metod skulle kunna anpassas för screening små störande RNAs (siRNAs), CRISPR, eller små molekyler. Sådana analyser kan visa sig användbart att upprätta terapeutiska metoder som förlitar sig på återaktivera den funktionella allelen av en tyst gen, såsom vid Rett syndrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Leko bidragit till denna artikel som anställd för Fred Hutchinson Cancer Research Center. Åsikter är hans egna och representerar inte nödvändigtvis åsikter National Institutes of Health eller Förenta staternas regering
Acknowledgments
Vi tackar Ross Dickins av University of Melbourne för nådigt shRNA biblioteket används i skärmen. Detta arbete finansierades av den Rett syndrom forskning lita (A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
