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JoVE Journal Genetics
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Genetics

ShARN regroupée écran pour la réactivation de MeCP2 sur le Chromosome X inactif

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1,4
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Summary

Nous rapportons une petite épingle à cheveux RNA (shARN) et le protocole axée sur le séquençage de prochaine génération pour identifier les responsables de la réglementation de l’inactivation du chromosome x dans une lignée de cellules murines avec luciférase firefly et gènes de résistance à l’hygromycine fusionnée à la méthyl CpG binding protein 2 ((en anglais seulement) MeCP2) gène sur le chromosome X inactif.

Abstract

Avancer les écrans génétiques à l’aide de gènes rapporteurs insérées dans l’hétérochromatine ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes de contrôle épigénétique dans organismes modèles. Technologies, y compris les ARN en épingle à cheveux courts (interférents) et cluster régulièrement dois‑je répétitions courtes palindromiques (CRISPR) ont permis à ces écrans dans des cellules de mammifères diploïdes. Nous décrivons ici un écran de shARN à grande échelle pour les régulateurs de l’inactivation de chromosome x (XCI), avec une lignée de cellules murines luciférase de firefly et de gènes de résistance à l’hygromycine frappa dans à l’extrémité C-terminale de la protéine liant le CpG de méthyle 2 gène (MeCP2) sur le chromosome de x inactif (Xi). Réactivation de la construction dans la lignée de cellules de journaliste conféré un avantage en survie sous sélection hygromycine B, nous permettant de cribler une banque de shARN grand et identifier les piques qui a réactivé le reporter en mesurant leur enrichissement postérieures à la sélection à l’aide séquençage de prochaine génération. Les épingles à cheveux enrichis ont été ensuite individuellement validés en testant leur capacité à activer le Rapporteur de la luciférase sur Xi.

Introduction

Une formes les plus courantes de la déficience mentale héréditaire chez les femmes, le syndrome de Rett, est causée par des mutations hétérozygotes MeCP2, un gène du chromosome x codant pour une protéine essentielle pour la fonction neuronale normale1. Une approche potentielle au traitement de ce trouble serait la réactivation de l’allèle sauvage de MeCP2 sur le Xi, comme le rétablissement de MeCP2 expression montre pour inverser les déficits neurologiques dans un modèle murin de cette maladie1, 2 , 4. Toutefois, silençage épigénétique de l’un des deux chromosomes dans les cellules femelles X est solidement maintenu tout au long de la durée de vie d’un organisme3,4, et robuste réactivation d’un gène Xi exigerait un important perturbation dans les multiples voies de régulation épigénétiques.

Pour identifier des facteurs nécessaires pour la maintenance de MeCP2 faire taire, nous avons d’abord développé un modèle de souris transgénique portant une fusion de gène MeCP2- luciférase - hygromycine résistance (MeCP2-LUC-HR) sur l’un des deux chromosomes X (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Bien que le MeCP2 exprimée à partir de la construction de la fusion s’est avéré pour être instable et a résulté en une perte de fonction, phénotypiquement imitant MeCP2 suppression chez les mâles hémizygotes (X/y deMeCP2-LUC-HR), l’expression des gènes de journaliste est facilement décelable dans un modèle conforme à l’expression d’endogène MeCP25. Nous avons ensuite généré des clones de fibroblastes immortalisé par la construction sur le chromosome x soit active ou inactive et a confirmé que les anciens ont exprimé type sauvage MeCP2 et pas le concept de journaliste ; l’inverse est vrai pour ce dernier. Lorsqu’il est exposé à un ADN demethylation agent connu pour abroger le silençage génique, 5-azacytidine (5-AZA), cellules avec le reporter sur le Xi (« cellules de journaliste ») a acquis l’activité dans un test de bioluminescence, indiquant que notre construction pourrait être réactivée et donc utilisés pour le dépistage génétique.

Ensuite, nous avons développé un dépistage génétique de haut débit pour les régulateurs de MeCP2 mise sous silence. La lignée cellulaire de journaliste était tout d’abord infectée par un rétrovirus bibliothèque contenant > 60 000 différents interférents ciblant > 25 000 gènes tout au long de la souris du génome5,6et ensuite soumis à la sélection de l’hygromycine B. Fréquence en épingle à cheveux a été comparée au préalable et post-sélection échantillons de prochaine génération séquençage, comme reporter réactivation avantageait la croissance sous l’hygromycine B sélection et a donné lieu à l’enrichissement des épingles à cheveux responsables. En utilisant cette approche, nous avons identifié 30 gènes impliqués en MeCP2 silencieux et par la suite ont confirmé les conclusions de la transduction des cellules de journaliste avec des épingles à cheveux et à mesurer leur activité de la luciférase.

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Protocol

Toutes les étapes impliquant des animaux ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le Fred Hutchinson Cancer Research Center Institutional Animal Care et le Comité d’utilisation (IACUC). Sans réactifs utilisés ici sont connues pour poser des risques importants pour la santé humaine à l’exception de la 5-azacytidine (5-AZA).

1. génération d’une lignée de cellules de journaliste avec transgène - LUC-HR MeCP2sur le Xi

  1. Préparation des fibroblastes de souris tendon d’une femelle XMeCP2-LUC- HR/x sourisMeCP2
    1. Euthanasier un jour 10-12-femme XMeCP2-LUC-HR/x sourisMeCP2 .
    2. À l’aide de ciseaux de dissection droites, pratiquer une incision circonférentielle à travers la peau de la portion proximale de queue.
    3. Tenant la carcasse près de la base de la queue, tirer la peau de la souris pour exposer la partie fibrocartilagineuse de la queue. Retirer et couper la borne 10 mm sur les tissus exposés dans 1 mm longs fragments à l’aide d’un bistouri.
    4. Transfert le tissu fragmenté dans un 15 mL conique tube contenant 5 mL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 1 U/mL la pénicilline, 1 µg/mL de streptomycine et collagénase de 1,5 mg/mL, préalablement filtré sur 0,45 µm et les filtres puis 0,2 µm. Incuber pendant 3-4 h à 37 ° C, avec une rotation continue.
    5. Centrifuger l’échantillon à la température ambiante à 500 x g pendant 10 min. Resuspendre le culot dans 10 mL de DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 1 U/mL de pénicilline et 1 µg/mL de streptomycine (DMEM-10) et plaque sur une plaque de culture de tissu de 6 puits. Les cellules de passage une fois et étendre sur une plaque de 10 cm avant de passer à l’étape suivante.
    6. Immortaliser les cellules en effectuant une transduction avec un vecteur d’expression transportant des oncogènes virus contre le VPH-16 (E6/E7), comme décrit plus haut7.
  2. Sélection de clones de cellules du même et de caractériser l’expression du Rapporteur MeCP2
    1. Moissonner les cellules d’une plaque de 10 cm. Tout d’abord, aspirer les médias, ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et incuber pendant 2 à 5 min à 37 ° C. Étancher avec 9 mL de DMEM-10 et de recueillir les cellules resuspendues dans un tube conique de 15 mL.
    2. Diluer les cellules avec DMEM-10 à une concentration finale de 1 cellule/100 µL. transmettre à plaques à 96 puits par pipetage 100 µL de la suspension dans chaque puits.
    3. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les puits soient anastomosé, qui peut prendre jusqu'à 2-3 semaines. Remplacer les médias avec frais DMEM-10 tous les 3-5 jours. Lorsque confluentes, mobiliser les cellules avec 20 µL de 0.05 % trypsine-EDTA / puits et divisez-les en deux ensembles en double des plaques de 96 puits.
    4. Utilisez un jeu de plaques d’analyser pour l’activité de la luciférase. Utiliser un kit de dosage de luciférase firefly homogène qui ne nécessite pas de suppression de médias. Suivre le protocole fourni avec le kit.
    5. Les résultats de l’étape 1.2.4 permet de sélectionner des clones avec aucune activité de la luciférase détectables dans le jeu restant des plaques. Développez ces clones aux plaques 24 puits et ensuite 6 puits.
    6. Effectuer la même chose pour un clone avec la plus forte activité de la luciférase ; Ceci servira comme un contrôle positif à des fins de validation.
    7. Récolter une partie aliquote de chaque puits de la plaque 6 puits pour un Western blot. Mobiliser les cellules avec 200 µL de 0.05 % trypsine-EDTA. Incuber pendant 2 à 5 min à 37 ° C. Étancher avec 2 mL de DMEM-10 et la moitié des cellules de transfert à tube à centrifuger de 1,5 ml. Laver les cellules une fois avec du PBS avant lyse pour Western blot. Par ailleurs, la moitié des cellules transférer à une autre plaque 6 puits. Lorsque les cellules s’attachent au fond de la plaque, rincer avec du PBS et lyse de Western blot.
    8. Effectuer un Western blot avec anticorps anti-MeCP2 pour confirmer que les cellules négatives luciférase expriment, tandis que les cellules de la luciférase séropositifs n’expriment pas de MeCP2 sauvage du chromosome X actif ; Suivez le protocole décrit précédemment8. Utilisez des tissus cérébraux lysat de toute souris de type sauvage comme témoin positif.
    9. Plaque de plusieurs clones négatifs à 2 x 105 cellules/puits dans une plaque 6 puits. Traiter une fois avec 10 µM 5-AZA, incuber pendant 72 heures sans changer les médias et dosage de l’activité de la luciférase, tel que décrit à l’étape 1.2.3.
    10. Choisissez un clone négatif (clone de Xi) qui a acquis l’activité de la luciférase avec 5-AZA et commence son expansion aux multiples plaques de 10 cm. Congeler les autres clones négatifs dans l’azote liquide comme une sauvegarde. Le clone positif (Xa clone) peut être maintenu dans la culture de tissus ou gelé jusqu'à une utilisation ultérieure.

2. la bibliothèque de réactivation à l’aide de l’hygromycine B sélection de dépistage

  1. Infectant le clone de test, la sélection et la récolte d’ADN pour le séquençage
    1. Obtenez virales concentrés de rétrovirues constructions exprimant les piques d’une bibliothèque de shARN ou produire des concentrés surnageant viral en utilisant le protocole fourni avec la bibliothèque souhaitée.
    2. Avant de procéder à l’écran, titrer la bibliothèque (en utilisant un marqueur GFP, si disponible). Viser une multiplicité d’infection entre 0,3 et 0,5.
      Remarque : Effectuer au moins quatre écrans indépendants pour minimiser le taux de faux positifs. 20 plaques par écran permet d’obtenir 100 fois la couverture de la bibliothèque pour maintenir une représentation adéquate des épingles à cheveux et éviter les abandons au hasard9. Toutefois, compte tenu de l’écran sélection positive et une taille de la grande bibliothèque, il est probable qu’une couverture inférieure serait suffisant.
    3. Dans la matinée, plaque de 1 x 106 cellules de Xi sur des plaques de culture de tissu de 10 cm.
    4. Dans l’après-midi, infecter les plaques en remplaçant les médias avec frais DMEM-10 contenant un surnageant viral et 5 à 10 µg/mL de polybrene. Utilisez la quantité de liquide surnageant viral, déterminé à l’étape 2.1.2.
    5. Après 18 à 24 heures, aspirer les médias et ajouter 10 mL de frais DMEM-10 pour chaque plaque. Culture pour encore 48 h.
    6. Dans la matinée, mobiliser les cellules en utilisant 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA par plaque et étancher avec 9 mL de DMEM-10 par plaque. Exécutez la suspension à travers un filtre à tamis 100 µm. Regrouper les suspensions filtrées et deux jeux de plaques de 10 cm à 1 x 106 cellules/plaque des graines.
    7. Dans l’après-midi, remplacez les médias dans un ensemble de plaques par DMEM-10 contenant 15 µg/mL de hygromycine B (jour 0). Dans l’autre groupe, remplacer les médias avec frais DMEM-10 seulement.
    8. Après 48 heures, mobiliser les cellules non traitées ensemble de plaques en utilisant 1 ml de 0.05 % trypsine-EDTA. Incuber pendant 2 à 5 min à 37 ° C. Étancher avec 9 mL de DMEM-10. Les cellules de transfert pour tubes coniques 15 ml et centrifuger à 500 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant et procéder immédiatement à extraire l’ADN à partir des granulés. Alternativement, mettre en commun les cellules dans les plus grands tubes avant l’étape de centrifugation.
    9. Extraire l’ADN à l’aide d’un mélange de phénol et chroroform et précipiter l’ADN avec sodium acétate et froid l’éthanol comme décrit précédemment10. Mettre en commun les échantillons d’ADN de présélection individuelles et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    10. Continuer la sélection hygromycine B pendant plus de 4 jours de culture. Reconstituer les médias de sélection avec frais 10-DMEM contenant hygromycine B après 2 jours.
    11. Jour 7, remplacez les médias sélection fraîches DMEM-10 seulement. Permettent de 2 à 4 jours pour la récupération et ensuite récolter les cellules comme indiqué au point 2.1.8. Procéder à l’extraction d’ADN comme décrit à l’étape 2.1.9.
  2. Identifier les piques enrichies dans les échantillons de post-sélection
    1. Contexte d’utilisation 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') et 3' inverser les apprêts de la boucle (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') pour amplifier la moitié-barettes de pré- et post sélection des échantillons d’ADN. Utiliser tout extraire l’ADN dans les réactions de PCR séparées avec 100-200 ng d’ADN par la réaction.
      Remarque : Ces contexte primer de 5' et 3' boucle de retournement amorces correspondent à la séquence de contexte miR-30 en amont de l’insert de shARN et la séquence à la boucle de shARN, respectivement. Différentes bibliothèques nécessitera différentes oligos. Ajuster les étapes de purification afin d’isoler les différents formats selon les besoins.
    2. Perles de taille-sélection utilisation pour enlever des amorces et l’ADN génomique et récupérer les produits PCR entre 100 et 200 BP. suivent le protocole fourni avec les perles.
    3. Préparer une bibliothèque de séquençage à séquencer les moitié-épingles à cheveux. Générer au moins 50 millions de lectures par écran. Suivre le protocole approprié pour le kit de séquençage et l’équipement.
      Remarque : 50 millions de lectures par écran fournit 1000 fois représentation de chaque shARN dans la bibliothèque et environ 10 fois la couverture de chaque infection indépendante (effectuée 100 fois la représentation de chaque shARN), qui assure une représentation adéquate des chaque événement de l’infection.
    4. Énumérez chaque shARN en utilisant un script Perl qui compte des séquences avec des allumettes parfaits. A choisi interférents qui avait au moins 10 lectures dans la piscine présélection pour une analyse plus approfondie. Calculer les enrichissements que les ratios de post à présélection compte et déterminer le taux de fausse découverte (FDR) sur la base de 1000 permutations. A choisi des gènes ciblés par interférents avec < 5 % RAD comme « hits » pour des tests supplémentaires.

3. valider les épingles à cheveux identifiés (« hits »)

  1. Lentivirus emballage contenant interférents identifiés dans l’écran
    1. Semences 8 x 106 FT 293 cellules / plaque sur des plaques de 10 cm.
    2. Le jour suivant, remplacer les médias avec 9 mL de DMEM-10 sans antibiotique par plaque ; faire ce 30 minutes avant la transfection.
    3. Pendant l’intervalle de 30 minutes, préparer deux mixages pour la transfection :
      1. Préparer le mélange 1 (par plaque/shRNA ; suffisante selon le nombre total d’interférents) : 10 µL de 2 mg/mL polyéthylènimine (PEI) dans 0,5 mL de média essentiel minimum optimal. La composition de pipetage et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      2. Préparer le mélange 2 (par shARN) : 4 µg du vecteur shARN à emballer, 1,5 µg du vecteur enveloppe VSV-G (pMD2.G) et 2,5 µg du vecteur emballage (psPAX2), mélangés dans 0,5 mL de média essentiel minimum optimal.
        NOTE : Inclure un vecteur lentiviral vide dans l’emballage à utiliser dans les infections plus tard comme témoin négatif.
    4. Ajouter 0,5 mL de mélange 1 à chaque portion du mélange 2 et mélanger doucement en pipettant également. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 min.
    5. Appliquer le mélange sur chaque plaque de l’étape 3.1.2 de manière goutte à goutte ; agiter la plaque doucement pour mélanger.
    6. Le jour suivant, remplacer les médias avec 5 mL de frais DMEM-10.
    7. 48 heures après la transfection initiale, récupérer le surnageant et exécutez-le à travers un filtre de 0,22 µm. Pré mouillage le filtre avec DMEM-10 pour optimiser la récupération.
    8. Aliquoter le surnageant filtré en quantités idéales pour infecter une plaque 6 puits bien.
    9. Geler les aliquotes à-80 ° C pour une utilisation ultérieure, ou procéder immédiatement à la transduction.
  2. Transduction et essais de barettes individuelles pour la réactivation du rapporteur luciférase et réactivation du gène MeCP2 sauvage sur le Xi.
    1. Dans la matinée, plaque de 1 x 105 Xi cellules/puits dans 6 assiettes bien.
    2. Dans l’après-midi, infecter les plaques en remplaçant les médias avec 2 mL de DMEM-10 frais contenant des gènes surnageant et 5 à 10 µg/mL de polybrene. Infecter un contrôle bien avec le surnageant viral produite à partir d’un vecteur lentiviral vide.
    3. Le jour suivant, remplacer les médias avec 2 mL de puromycine de 1 mg/mL contenant DMEM-10. Culture pendant quatre jours.
    4. Replacer les médias avec 2 mL de DMEM-10 frais et laisser 48-72 h pour la récupération.
    5. Mobiliser les cellules avec 150 µL de 0.05 % trypsine-EDTA. Incuber pendant 2 à 5 min à 37 ° C. Étancher avec 1,5 mL de DMEM-10. Les cellules de transfert pour tubes coniques 15 ml et centrifuger à 500 x g pendant 10 minutes à température ambiante.
    6. Retirez le support et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de lyse fourni dans le kit de dosage de luciférase. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Transférer les lysats dans un blanc plaque à 96 puits et le dosage de l’activité de la luciférase en utilisant le protocole fourni avec le kit. Utiliser les cellules Xa comme témoin positif et cellules Xi infectées par un vecteur lentiviral vide comme témoin négatif.
      Remarque : Évitez d’exposer les plaques blanches à lumière fluorescente avant l’essai ; Cela réduira l’arrière-plan et augmenter la sensibilité du test. Le protocole fourni dans le kit de test s’est avéré plus efficace si effectué dans l’obscurité lorsque cela est possible.
    7. Pour déterminer si l’épingle a eu un effet sur le niveau d’expression de MeCP2 sur le chromosome x actif, isoler l’ARN des cellules Xi tranduced et mesurer MeCP2 d’ARNm par quantitative PCR avec des amorces conçues pour amplifier uniquement le type sauvage MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R : 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. Facultatif : Augmenter la sensibilité du dosage en ajoutant 5-AZA à une concentration finale de 0,2 µM, après que les cellules se sont remises de sélection puromycine. La culture des cellules pendant 72 h sans remplacer les médias et puis de dosage pour l’activité de la luciférase à l’aide de la trousse commerciale luciférase.
    9. Mesurer la réactivation de la MeCP2 sauvage réduits au silence. Infecter les cellules Xa, qui abritent le type sauvage MeCP2 sur le Xi, avec le vecteur contenant des épingles à cheveux, suivant les étapes du protocole 3.2.1. -3.2.4. Isoler l’ARN des cellules et mesurer MeCP2 d’ARNm par quantitative PCR avec des amorces conçues pour amplifier uniquement le type sauvage MeCP2 (f : 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r : 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

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Representative Results

Les fibroblastes de tendon de souris ont été récoltés d’un précédemment décrits XMeCP2-LUC-HR/x souris femelleMeCP2 , immortalisée par transduction rétrovirale des oncogènes E6 et E7 du VPH-16 virus7, clonés à l’aide de dilution limite et testés pour activité de la luciférase et expression de la protéine MeCP2 de type sauvage (Figure 1 a et 1 b). Activité de la luciférase a été robuste si le journaliste effectuait Xa et indétectable si sur Xi ; l’expression de MeCP2 indigène présentait un patron réciproque. Nous avons sélectionné un clone avec aucune activité de la luciférase (Xi-8) et un clone avec activité robuste (Xa-3) d’autres expériences. Quand Xi-8 cellules ont été traitées avec la 5-AZA, une induction dose-dépendante de l’activité de la luciférase a été observée (Figure 1).

La sensibilité des cellules Xi-8 et Xa-3 à l’hygromycine B a été testée en effectuant des sélections de journée de 3 et 6. Comme prévu depuis le modèle d’expression de la journaliste de la luciférase, Xi-8 cellules sont plus sensibles à l’hygromycine B que Xa-3 cellules, même si ce dernier a indiqué sensibilité à des doses plus élevées (Figure 2 a). Après qu’un mélange de 1/100 de Xa-3 aux Xi-8 cellules a été exposé à différentes concentrations de l’hygromycine B, une augmentation dépendant du temps en activité de la luciférase a été observée, indiquant des concours de Xa-3 cellules au Xi-8 cellules (Figure 2 b). Dose et la durée de la sélection de l’hygromycine B ont été choisis pour les autres expériences inhibition préférentielle de Xi-8 sur Xa-3 cellules.

Quatre écrans indépendants ont été effectuées pour identifier les régulateurs de MeCP2 silencieux à l’aide de la lignée cellulaire de Xi-8 et une miR Biosystems Open-30-shARN base bibliothèque contenant 64 159 barettes différentes cloné dans un MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP rétrovirale Vector. Dans chaque écran, vingt plaques de 10 cm abritaient des interférents regroupées, ciblant environ 100 fois la couverture de la bibliothèque. Hygromicin B a été menée pendant 6 jours, jusqu'à ce qu’on a observé des petites parcelles acellulaires ; les cellules continuent à se damner supplémentaires 24 à 48 heures. Lorsque récupérées, les cellules ont été récoltées pour l’extraction d’ADN à l’aide d’une technique de phénol-chloroforme. Le rendement total d’ADN par écran était autour de 20 µg/plaque, ce qui a été mis en commun et divisé entre 100 réactions de PCR utilisant des amorces conçues pour amplifier la moitié-épingles à cheveux. Les produits PCR sont ensuite purifiés par perle et soumises à séquençage à haut débit.

Avant et après sélection des échantillons ont été comparés pour déterminer l’enrichissement en épingle à cheveux, comme nous l’espérions que tout en épingle à cheveux présent à des niveaux élevés dans l’échantillon après sélection ciblée gènes réactivé Xi et ainsi conféré résistance hygromycine. Seulement les piques enrichies en au moins 2 des quatre écrans ont été examinées pour la validation. Les épingles à cheveux plus enrichis dans toutes les répétitions de notre écran étaient quatre épingles à cheveux ciblant XIST, conforme à son rôle crucial en XCI11.

La partie de la validation de l’écran a été réalisée par tester individuellement les épingles à cheveux qui inscrit comme des grands succès pour l’activation du reporter luciférase dans les cellules de Xi-8. Bien que l’écran a été réalisée en utilisant une bibliothèque retroviral axée sur la MSCV, la validation a été réalisée en utilisant un vecteur lentiviral (clones individuels pGIPZ avec shARN) pour éviter la détection possible d’artefacts induite sur les rétrovirus.

Chacun des gènes candidats a été ciblé par au moins deux séquences différentes en épingle à cheveux, et l’inactivation du gène cible a été vérifiée par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). En dosant jusqu'à 1 x 106 cellules au format 6 puits et en diminuant la luminescence du fond (Figure 2), nous avons été en mesure de détecter les événements de réactivation de très basse fréquence, dont on estime que pour être de l’ordre de 1/20 000.

Une analyse plus approfondie à l’aide d’épingles à cheveux individuels conduit à l’identification de 30 gènes dont knockdown a abouti à la réactivation du reporter sur le Xi. La médiane de luminescence pour ces 30 gènes était 2,8 fois au-dessus de la ligne de base, qui s’est encore amplifié à 7.1-fold après un traitement 5-AZA. Les épingles à cheveux mêmes ont été retestés, conjointement avec la 5-AZA, avec les cellules de Xa-3 pour confirmer la réexpression du type sauvage MeCP2 de la Xi. Ceci a été réalisé en effectuant la RT-qPCR en utilisant des amorces conçues pour amplifier seulement la transcription de type sauvage de MeCP2.

Figure 1
La figure 1. Isolement des clones avec le gène MeCP2-Luc-HR de reporter sur le Xi.
A) analyse de luciferase firefly représentatives sur les fibroblastes de tendon immortalisé les clones (1-9). Fibroblastes primaires non transgéniques (NT) et les femmes hétérozygotes transgéniques (F) ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. B) représentant Western blot de montrant l’expression de la protéine MeCP2 des cellules (a). Notez que l’activité de la luciférase (Figure 1 a) et l’expression de MeCP2 pièce modèle d’expression réciproque. C) induction de l’activité de la luciférase firefly Xi-8 cellules avec 5-AZA. XA-3 cellules avec le gène rapporteur sur la Xa, servent de témoin positif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
La figure 2. Caractérisation de la résistance à l’hygromycine Xi-8 et Xa-3 cellules.
A) la croissance relative des cellules Xi-8 et Xa-3 traités par différents hygromycine B schémas (3D = 3 jours ; 6 = 6 jours), par rapport aux cellules non traitées. B) enrichissement d’activité luciférase après avoir exposé un total de 10 000 cellules Xa-3 et Xi-8 (mélangé au ratio de 1/100) à hygromicin B (25 µg/mL) pour indiqué le nombre de jours. Activité de la luciférase post-exposition est divisée par le niveau d’exposition avant de calculer l’enrichissement. C) firefly activité de la luciférase dans les cellules de Xi-8, dosée au format 96 - et 6-bien, avec et sans la 5-AZA (10 µM). Les fibroblastes (NT) non-transgéniques ont été utilisés comme contrôle négatif. 5-AZA a augmenté l’activité de la luciférase 7.2 et 86 fois sur la ligne de base au format 96 - et 6-bien, respectivement. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001 par t-test comparant 5-AZA élève traitées et non traitées Xi-8 cellules.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans notre étude récente6, nous avons généré une lignée de cellules murines avec luciférase et gènes de résistance à l’hygromycine fondues à MeCP2 sur le Xi et il transduites avec une bibliothèque de > 60 000 interférents ciblant > 25 000 gènes. Nous avons trouvé 30 gènes dont un avantage en survie conféré de précipitation sous sélection hygromycine B, suggérant leur rôle dans le contrôle de MeCP2 et silencieux du chromosome x. Ces résultats ont été validés en transduction de la lignée de cellules rapportées avec des épingles à cheveux et en évaluant la réactivation du reporter luciférase silencieuse.

La constatation que les épingles à quatre cheveux albums dans toutes les répétitions de notre écran cible XIST fourni une validation interne solide pour notre méthode, étant donné le rôle crucial de XIST XCI11. En dehors de la superfamille TGFβ, dont le rôle réglementaire dans XCI n’avait pas été décrit précédemment, les autres gènes identifiés tous appartenaient aux familles fonctionnelles avec les attaches à régulation épigénétique, servant ainsi une validation supplémentaire pour notre méthode12 , 13 , 14. en outre, nous avons également découvert 4 sur 13 gènes identifiés antérieurement dans un autre écran, à l’aide d’un CMV GFP insérée au hasard sur le Xi15pilotée par promoteur.

Établir la dose appropriée et la durée de l’hygromycine sélection B était essentielle pour optimiser les conditions de dépistage. La sensibilité de notre lignée cellulaire a été fortement tributaire de la densité de semis et a été compromise par une infection rétrovirale. Une augmentation des doses ou la longueur de sélection aussi inhibé la croissance des cellules avec le reporter sur Xa, considérant que la sélection plus douce réduit la sensibilité pour l’enrichissement de l’épingle à cheveux. Multiples schémas posologiques hygromycine B et cellule de reporter les densités de semis ont ainsi été testés avant la projection finale. En outre, bien que le vecteur rétroviral MSCV dans notre bibliothèque de shARN a permis d’utiliser la sélection de la puromycine et enrichir des cellules avec succès transduits, puromycine ne servait pas dans nos expériences, comme l’utilisation séquentielle de puromycine et hygromyin B a entraîné une toxicité excessive, même après la désescalade dose appropriée de ces deux antibiotiques.

Toutes les épingles à cheveux dans notre étude aussi réactivé le rapporteur luciférase silencieuse, quoiqu’à un degré plus modeste. Détection de ces événements rares a été activée par la grande sensibilité de notre écran, nous avons estimé, issu des essais adjuvants des cellules Xi et Xa, d’être un événement de réactivation dans 2 x 104 cellules. Ces faibles niveaux de réactivation, a augmenté avec la demande conjointe de la 5-AZA, témoignent des difficultés décrites précédemment en perturbant serré contrôle transcriptionnel XCI12,13,16,17, et implique que la perturbation des mécanismes régulateurs multiples serait nécessaires pour atteindre la réactivation significative.

Noter que toutes les épingles à 30 cheveux identifiés dans notre écran réactivé aussi un gène de journaliste pilotée par le CMV localisé à un locus différent du chromosome x, indiquant leur impact plus large sur la dé-répression de Xi. D’autres études sont nécessaires pour vérifier si MeCP2 spécifique « été » existe, que leur manipulation pharmacologique ou génétique pourrait s’avérer extrêmement utile dans le traitement du syndrome de Rett.

Notre système de dépistage offre plusieurs avantages sur les journalistes décrites précédemment utilisés pour le chromosome x réactivation écrans12,17. Au lieu de conduit par un promoteur de CMV, notre cassette journaliste est frappé dans à l’extrémité C-terminale de MeCP2 et est donc entraînée par le promoteur natif liée à le X. Cette conception peut aider à identifier les régulateurs spécifiques d’un locus de MeCP2 , plus pertinents dans le contexte de recherche de syndrome de Rett, avec une mise en garde que les conclusions dans les fibroblastes immortalisées devraient être récapitulées dans les neurones, le site désiré de MeCP2 réactivation. L’utilisation d’un gène de résistance à l’hygromycine permet la sélection positive des événements de réactivation et robuste augmente la sensibilité de l’écran. Par ailleurs, la cassette contenant les gènes de luciférase de firefly et résistance à l’hygromycine permet aussi bien à grande échelle de dépistage à l’aide de sélection positive avec l’hygromycine B et tests/dépistage individuels barettes utilisant le Rapporteur de la luciférase.

En résumé, nous présentons une méthode de dépistage génétique robuste et sensible pour l’identification des organismes de réglementation de MeCP2 et chromosome x silencieux dans les cellules de mammifères. Cette méthodologie pourrait être adaptée pour les petits ARN interférents (siARN), CRISPR, de dépistage ou de petites molécules. Ces tests pourraient s’avérer utiles pour établir des approches thérapeutiques qui dépendent de la réactivation de l’allèle fonctionnel d’un gène silencieux, comme dans le cas de syndrome de Rett.

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Disclosures

Dr. Leko a contribué à cet article comme un employé de la Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Les opinions exprimées sont les siennes et ne représentent pas nécessairement les vues de la National Institutes of Health ou le gouvernement des États-Unis

Acknowledgments

Nous remercions Ross Dickins de l’Université de Melbourne pour offrir gracieusement la bibliothèque de shARN utilisée dans l’écran. Ce travail a été financé par la Rett Syndrome Research Trust (dossier d’appel).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

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References

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Numéro 133 inactivation du chromosome x génétique épigénétique MeCP2 Rett syndrome XIST shRNA dépistage
ShARN regroupée écran pour la réactivation de MeCP2 sur le Chromosome X inactif
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Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. … More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

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