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Genetics

निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर MeCP2 के पुनः सक्रिय करने के लिए परित shRNA स्क्रीन

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1,4
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Summary

हम एक छोटी सी hairpin आरएनए (shRNA) और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण-आधारित प्रोटोकॉल की पहचान के लिए एक murine सेल लाइन में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियण के साथ-जुगनू luciferase और hygromycin प्रतिरोध के साथ जुड़े जीन मिथाइल CpG बाध्यकारी प्रोटीन 2 ( MeCP2) निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर जीन ।

Abstract

फॉरवर्ड आनुवंशिक रिपोर्टर heterochromatin में डाला जीन का उपयोग कर बड़े पैमाने पर मॉडल जीवों में epigenetic नियंत्रण के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । लघु hairpin RNAs (shRNAs) और संकुल नियमित रूप से प्रतिस्थानित लघु palindromic दोहराव (CRISPR) सहित प्रौद्योगिकियों को द्विगुणित स्तनधारी कोशिकाओं में ऐसी स्क्रीनों को सक्षम किया गया है. यहां हम X-गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) के नियामकों के लिए एक बड़े पैमाने पर shRNA स्क्रीन का वर्णन, जुगनू luciferase और hygromycin प्रतिरोध जीन के साथ एक murine सेल लाइन का उपयोग कर सी में दस्तक दी-मिथाइल CpG बाध्यकारी प्रोटीन 2 (MeCP2) जीन की टर्मिनस निष्क्रिय X गुणसूत्र (Xi) पर । रिपोर्टर सेल लाइन में निर्माण के पुनर्सक्रियन hygromycin बी चयन के तहत जीवन रक्षा लाभ, हमें सक्षम करने के लिए एक बड़ी shRNA पुस्तकालय स्क्रीन और hairpins की पहचान है कि उनके बाद चयन संवर्धन का उपयोग करके रिपोर्टर सक्रिय अगली पीढ़ी के अनुक्रमण । तब समृद्ध hairpins व्यक्तिगत रूप से उनकी क्षमता का परीक्षण करके ग्यारहवीं पर luciferase रिपोर्टर को सक्रिय करने के लिए मान्य थे.

Introduction

एक महिलाओं में वंशानुगत मानसिक हानि का सबसे आम रूप, Rett सिंड्रोम, MeCP2में heterozygous उत्परिवर्तनों के कारण होता है, एक एक्स गुणसूत्र जीन है कि एक सामांय ंयूरॉन समारोह1के लिए आवश्यक प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना । इस विकार के इलाज के लिए एक संभावित दृष्टिकोण पर वंय-प्रकार MeCP2 एलील की पुनर्क्रियाशीलता होगा Xi, MeCP2 अभिव्यक्ति की बहाली के रूप में इस रोग के एक माउस मॉडल में स्नायविक घाटे रिवर्स करने के लिए दिखाया गया था1, 2 , 4. हालांकि, महिला कोशिकाओं में दो एक्स गुणसूत्रों में से एक के epigenetic मुंह बंद करने कसकर एकजीव3, 4, और एक ग्यारहवीं जीन की मजबूत पुनर्क्रियाशीलता की संभावना एक प्रमुख की आवश्यकता होती है भर में बनाए रखा जाता है एकाधिक epigenetic विनियामक रास्ते में व्यवधान ।

MeCP2 मुंह बंद करने के रखरखाव के लिए आवश्यक कारकों की पहचान करने के लिए, हम पहले एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल एकMeCP2-luciferase-hygromycin प्रतिरोध जीन संलयन(MeCP2-ल्यूक-HR) ले जाने के दो एक्स गुणसूत्रों में से एक पर विकसित (एक्स MeCP2-ल्यूक-HR/XMeCP2)5. हालांकि फ्यूजन निर्माण से व्यक्त MeCP2 अस्थिर और समारोह का एक नुकसान में परिणाम के परिणामस्वरूप साबित हो गया, phenotypically MeCP2 विलोपन में hemizygous पुरुषों (एक्सMeCP2-ल्यूक-एचआर/Y), रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति अंतर्जात MeCP2 की अभिव्यक्ति के अनुरूप एक पैटर्न में आसानी से detectable था5। हम तो निष्क्रिय या सक्रिय एक्स गुणसूत्र पर निर्माण के साथ अमर fibroblast क्लोन उत्पंन है, और पुष्टि की है कि पूर्व व्यक्त जंगली प्रकार MeCP2 और नहीं रिपोर्टर का निर्माण; व्युत्क्रम के बाद के लिए सच था । जब एक डीएनए demethylating एजेंट को उजागर जीन मुंह बंद करने, 5-azacytidine (5-AZA), ग्यारहवीं पर रिपोर्टर के साथ कोशिकाओं ("रिपोर्टर सेल") एक bioluminescence परख में गतिविधि प्राप्त की, यह दर्शाता है कि हमारे निर्माण और सक्रिय हो सकता है इसलिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया ।

हम अगले MeCP2 मुंह बंद करने के नियामकों के लिए एक उच्च प्रवाह आनुवंशिक स्क्रीन विकसित की है । रिपोर्टर सेल लाइन पहले एक retroviral > 60, 000 विभिंन shRNAs लक्ष्यीकरण > 25, 000 चूहे के जीनोम5भर में जीन,6, और फिर hygromycin बी चयन के अधीन युक्त पुस्तकालय से संक्रमित था । Hairpin आवृत्ति hygromycin बी चयन के तहत रिपोर्टर पुनर्क्रियाशीलता लिटरेचर के रूप में और जिंमेदार hairpins के संवर्धन के परिणामस्वरूप, अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग करते हुए पूर्व और बाद चयन नमूनों में तुलना की गई थी । इस दृष्टिकोण का उपयोग कर, हम 30 MeCP2 मुंह बंद करने में फंसा जीन की पहचान की है, और बाद में व्यक्तिगत hairpins के साथ रिपोर्टर कोशिकाओं transducing और उनके luciferase गतिविधि को मापने के निष्कर्षों की पुष्टि की ।

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Protocol

सभी जानवरों को शामिल कदम बाहर फ्रेड Hutchinson कैंसर अनुसंधान केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया । यहां इस्तेमाल किए गए कोई रिएजेंट 5-azacytidine (5-AZA) के अलावा महत्वपूर्ण मानव स्वास्थ्य जोखिम पैदा करने के लिए जाने जाते हैं ।

1. MeCP2के साथ एक रिपोर्टर सेल लाइन पैदा-ल्यूक-एचआर transgene पर ग्यारहवीं

  1. एक महिला एक्सMeCP2-ल्यूक-एचआर /XMeCP2 माउस से माउस पट्टा fibroblasts की तैयारी
    1. Euthanize एक 10-12 दिन वृद्ध महिला एक्सMeCP2-ल्यूक-एचआर/XMeCP2 माउस ।
    2. सीधे विच्छेदन कैंची का प्रयोग, समीपस्थ पूंछ भाग की त्वचा के माध्यम से एक circumferential चीरा बनाते हैं ।
    3. पूंछ के आधार के पास लोथ होल्डिंग, त्वचा की पूंछ के fibrocartilaginous हिस्से को बेनकाब करने के लिए माउस से दूर खींच । निकालें और एक शल्य स्केलपेल का उपयोग कर 1 मिमी लंबे टुकड़े में उजागर ऊतक के टर्मिनल 10 मिमी कटौती ।
    4. खंडित ऊतक एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 1 U/एमएल पेनिसिलिन, 1 µ g/एमएल streptomycin, और १.५ मिलीग्राम/एमएल collagenase, पूर्व के माध्यम से फ़िल्टर ०.४५ µm और फिर ०.२ µm मेष फिल्टर के साथ पूरक के 5 मिलीलीटर युक्त । सतत रोटेशन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3-4 ज के लिए मशीन ।
    5. 10 मिनट के लिए ५०० x जी पर कमरे के तापमान पर नमूना केंद्रापसारक । 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 U/एमएल पेनिसिलिन, और 1 µ g/ml streptomycin (DMEM-10) और प्लेट पर एक 6-well टिशू कल्चर प्लेट के साथ पूरक DMEM के 10 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड । एक बार और अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले एक 10 सेमी प्लेट के लिए विस्तार कोशिकाओं को पारित ।
    6. अमर एक अभिव्यक्ति वेक्टर ले जाने के साथ एक transduction प्रदर्शन करके कोशिकाओं को एचपीवी-16 वायरल oncogenes (E6/E7), के रूप में पहले से वर्णित7।
  2. एकल सेल क्लोन और निस्र्पक MeCP2 रिपोर्टर व्यंजक का चयन करना
    1. एक 10 सेमी प्लेट से कोशिकाओं को फसल । सबसे पहले, मीडिया महाप्राण, ०.०५% trypsin-EDTA और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए गर्मी की 1 मिलीलीटर जोड़ें । DMEM-10 के 9 मिलीलीटर के साथ बुझाने और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में reसस्पैंड कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    2. DMEM-10 के साथ कोशिकाओं को पतला 1 सेल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए/100 µ एल स्थानांतरण ९६-अच्छी तरह से प्लेटें pipetting १०० निलंबन के µ एल द्वारा एक अच्छी तरह से ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी जब तक कुओं धाराप्रवाह हैं, जो 2-3 सप्ताह तक लग सकते हैं । ताजा DMEM-10 हर 3-5 दिनों के साथ मीडिया बदलें । जब धाराप्रवाह, ०.०५% trypsin के 20 µ एल के साथ कोशिकाओं को जुटाने-EDTA प्रति अच्छी तरह से और उंहें ९६ के दो डुप्लिकेट सेट में विभाजित-अच्छी तरह से प्लेटें ।
    4. luciferase गतिविधि के लिए प्लेटों के एक सेट का प्रयोग करें परख । एक सजातीय जुगनू luciferase परख किट जो मीडिया हटाने की आवश्यकता नहीं है का प्रयोग करें । किट के साथ शामिल प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    5. प्लेटों के शेष सेट से कोई जासूसी luciferase गतिविधि के साथ क्लोन का चयन करने के लिए कदम 1.2.4 से परिणामों का उपयोग करें । इन क्लोनों का विस्तार करने के लिए 24 अच्छी तरह से और फिर 6 अच्छी तरह से प्लेटें ।
    6. उच्चतम luciferase गतिविधि के साथ एक क्लोन के लिए एक ही प्रदर्शन; यह मांयता प्रयोजनों के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    7. एक पश्चिमी दाग के लिए 6 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से एक aliquot फसल । ०.०५% trypsin-EDTA के २०० µ l के साथ कोशिकाओं को जुटाना. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए मशीन । DMEM-10 के 2 मिलीलीटर के साथ बुझाने, और 1.5 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं के आधे हस्तांतरण । वेस्टर्न ब्लाट के लिए lysing से पहले पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । वैकल्पिक रूप से, एक और 6 अच्छी तरह से प्लेट के लिए कोशिकाओं के आधे हस्तांतरण । जब कोशिकाओं थाली के नीचे करने के लिए देते हैं, पश्चिमी दाग के लिए पंजाबियों और लाइसे के साथ कुल्ला ।
    8. एंटी-MeCP2 एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी दाग की पुष्टि करें कि luciferase-नकारात्मक कोशिकाओं व्यक्त करते हैं, जबकि luciferase-सकारात्मक कोशिकाओं जंगली प्रकार MeCP2 सक्रिय एक्स गुणसूत्र से व्यक्त नहीं करते हैं; पहले वर्णित प्रोटोकॉल8का पालन करें । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किसी भी जंगली प्रकार माउस से मस्तिष्क ऊतक lysate का प्रयोग करें ।
    9. प्लेट 2 x 105 कोशिकाओं में कई नकारात्मक क्लोन एक 6 अच्छी तरह से थाली में/। 10 µ एम 5 के साथ एक बार समझो-AZA, मीडिया को बदलने के बिना ७२ ज के लिए मशीन, और luciferase गतिविधि के लिए परख के रूप में कदम 1.2.3 में वर्णित है ।
    10. एक नकारात्मक क्लोन (ग्यारहवीं क्लोन) है कि 5-AZA के साथ luciferase गतिविधि प्राप्त की और यह कई 10 सेमी प्लेटों के विस्तार शुरू चुनें । शेष नकारात्मक क्लोन तरल नाइट्रोजन में एक बैकअप के रूप में फ्रीज । सकारात्मक क्लोन (Xa क्लोन) ऊतक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है या आगे उपयोग तक जमे हुए ।

2. पुनर्क्रियाशीलता के लिए पुस्तकालय स्क्रीनिंग hygromycin बी चयन का उपयोग

  1. परीक्षण क्लोन को संक्रमित करना, चयन लागू करना, और अनुक्रमण के लिए कटाई डीएनए
    1. प्राप्त वायरल retroviral का ध्यान केंद्रित एक shRNA पुस्तकालय से hairpins व्यक्त का निर्माण, या केंद्रित वायरल supernatant वांछित पुस्तकालय के साथ शामिल प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन ।
    2. स्क्रीन के साथ आगे बढ़ने से पहले, लाइब्रेरी को अनुमापन (यदि उपलब्ध हो तो GFP मार्कर का उपयोग करके). ०.३ और ०.५ के बीच संक्रमण की बहुलता के लिए निशाना लगाओ ।
      नोट: झूठी धनात्मक दरों को कम करने के लिए ंयूनतम चार स्वतंत्र स्क्रीन निष्पादित करें । hairpins के पर्याप्त प्रतिनिधित्व बनाए रखने और यादृच्छिक ड्रॉपआउट्स से बचने के लिए पुस्तकालय की १०० गुना कवरेज प्राप्त करने के लिए प्रति स्क्रीन 20 प्लेट का उपयोग करें9। हालांकि, सकारात्मक चयन स्क्रीन और एक बड़े पुस्तकालय का आकार दिया, यह संभावना है कि एक कम कवरेज पर्याप्त होगा ।
    3. सुबह में, प्लेट 1 x 106 ग्यारहवीं कोशिकाओं 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेटों पर ।
    4. दोपहर में, मीडिया के साथ ताजा DMEM-10 युक्त वायरल supernatant और 5-10 µ जी/polybrene के एमएल के साथ प्लेटों को संक्रमित । स्टेप 2.1.2 में निर्धारित वायरल supernatant की मात्रा का प्रयोग करें ।
    5. 18-24 एच के बाद, मीडिया महाप्राण और प्रत्येक प्लेट के लिए 10 मिलीलीटर ताजा DMEM-10 जोड़ें । संस्कृति के लिए एक और ४८ एच.
    6. सुबह में, ०.०५% trypsin-थाली प्रति EDTA की 1 मिलीलीटर का उपयोग कर कोशिकाओं को जुटाने और DMEM के 9 मिलीलीटर के साथ बुझाना-10 प्रति थाली । एक १०० µm मेष फ़िल्टर के माध्यम से निलंबन चलाते हैं । पूल फ़िल्टर सस्पेंशन एक साथ, और बीज 10 सेमी प्लेट्स के दो सेट में 1 x 106 कोशिकाओं/
    7. दोपहर में, DMEM के साथ प्लेटों के एक सेट में मीडिया की जगह-10 युक्त 15 µ g/एमएल hygromycin बी (दिन 0) । दूसरे सेट में, मीडिया ताजा DMEM-10 के साथ ही बदलें ।
    8. ४८ घंटे के बाद, ०.०५% trypsin-EDTA की 1 मिलीलीटर का उपयोग कर प्लेटों के अनुपचारित सेट से कोशिकाओं को जुटाने । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए मशीन । DMEM-10 के 9 मिलीलीटर के साथ बुझाना । 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । महाप्राण supernatants और छर्रों से डीएनए निकालने के साथ तुरंत आगे बढ़ना । वैकल्पिक रूप से, बड़े ट्यूबों में कोशिकाओं के केंद्रापसारक कदम से पहले पूल ।
    9. phenol और chroroform का एक मिश्रण का उपयोग कर डीएनए निकालें और सोडियम एसीटेट और ठंड इथेनॉल के साथ डीएनए हाला के रूप में पहले10वर्णित है । व्यक्तिगत पूर्व चयन डीएनए नमूने और दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग तक पूल ।
    10. जारी संवर्धन hygromycin B चयन 4 अधिक दिनों के लिए सेट करें । 2 दिनों के बाद ताजा DMEM-10 युक्त hygromycin बी के साथ चयन मीडिया की भरपाई ।
    11. 7 दिन पर, केवल ताजा DMEM-10 के साथ चयन मीडिया की जगह । रिकवरी के लिए 2 से 4 दिन की अनुमति दें, और फिर चरण 2.1.8 में वर्णित के रूप में फसल कोशिकाओं । चरण 2.1.9 में वर्णित के रूप में डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें ।
  2. चयन उपरांत नमूनों में hairpins समृद्ध की पहचान
    1. पूर्व और बाद में चयन डीएनए नमूनों से आधा-hairpins बढ़ाना के लिए 5 ' प्रसंग (5 '-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3 ') और 3 ' रिवर्स लूप प्राइमरी (5 '-ACATCTGTGGCTTCACTA-3 ') का प्रयोग करें । प्रतिक्रिया प्रति डीएनए के 100-200 एनजी के साथ अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं में सभी निकाले डीएनए का प्रयोग करें ।
      नोट: इन 5 ' संदर्भ प्राइमर और 3 ' रिवर्स पाश प्राइमर मीर के अनुरूप-30 shRNA डालने के संदर्भ अनुक्रम और shRNA लूप पर अनुक्रम, क्रमशः के ऊपर । विभिंन पुस्तकालयों अलग ओलिगोस्पर्मिया की आवश्यकता होगी । विभिन्न उत्पाद आकारों को अलग करने के लिए शुद्धि चरणों को आवश्यकतानुसार समायोजित करें.
    2. प्राइमरों और जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए आकार-चयन मोतियों का उपयोग करें, और १०० और २०० बीपी के बीच पीसीआर उत्पादों की वसूली । मोतियों के साथ शामिल प्रोटोकॉल का पालन करें ।
    3. हाफ-hairpins अनुक्रम के लिए एक sequencing लायब्रेरी तैयार करें । उत्पंन कम से ५०,०००,००० प्रति स्क्रीन पढ़ता है । sequencing किट और उपकरणों के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल का पालन करें ।
      नोट: ५०,०००,००० पढ़ता है स्क्रीन प्रति पुस्तकालय में प्रत्येक shRNA के १०००-गुना प्रतिनिधित्व प्रदान करता है और लगभग 10 गुना प्रत्येक स्वतंत्र संक्रमण की कवरेज (१००-प्रत्येक shRNA के गुना प्रतिनिधित्व पर किया जाता है), जो पर्याप्त प्रतिनिधित्व सुनिश्चित प्रत्येक संक्रमण घटना ।
    4. एक पर्ल स्क्रिप्ट है कि सही मैचों के साथ अनुक्रम गिना जाता है का उपयोग कर प्रत्येक shRNA गणना । पुलिसिया shRNAs जो आगे के विश्लेषण के लिए अचयनित पूल में कम से 10 पढ़ता था । संवर्धनों की गणना के रूप में पद के अनुपात को अचयनित करने के लिए मायने रखता है और झूठी खोज दर (एफडीआर) के आधार पर निर्धारित १००० परिवर्तन । आगे के परीक्षण के लिए "हिट" के रूप में < 5% एफडीआर के साथ shRNAs द्वारा लक्षित जीन चुना गया ।

3. पहचाने hairpins को मान्य करना ("हिट")

  1. पैकेजिंग lentiviruses युक्त shRNAs स्क्रीन में पहचान
    1. 10 सेमी प्लेट्स पर सीड 8 x 106 293FT सेल प्रति प्लेट ।
    2. अगले दिन, मीडिया की जगह 9 मिलीलीटर एंटीबायोटिक मुक्त DMEM-10 प्रति प्लेट के साथ; अभिकर्मक से पहले इस 30 मिनट करें ।
    3. 30 मिनट के अंतराल के दौरान, अभिकर्मक के लिए दो घोला जा सकता है तैयार:
      1. मिश्रण तैयार 1 (प्रति प्लेट/shRNA; स्केल अप shRNAs की कुल संख्या के अनुसार): 10 µ एल के 2 मिलीग्राम/एमएल polyethylenimine (पी) इष्टतम ंयूनतम आवश्यक मीडिया के ०.५ मिलीलीटर में । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर pipetting और गर्मी से मिश्रण ।
      2. मिश्रण 2 तैयार करें (प्रति shRNA): shRNA वेक्टर के 4 µ g को पैक किया जाना, VSV-g लिफ़ाफ़ा सदिश का १.५ µ g (pMD2. g), और २.५ µ g को पैकेजिंग वेक्टर (psPAX2), इष्टतम ंयूनतम आवश्यक मीडिया के ०.५ मिलीलीटर में मिलाया गया है ।
        नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बाद में संक्रमण में उपयोग करने के लिए एक खाली lentiviral वेक्टर पैकेजिंग में शामिल करें ।
    4. मिश्रण 2 के प्रत्येक aliquot के लिए मिश्रण 1 के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में मशीन ।
    5. एक dropwise फैशन में 3.1.2 कदम से प्रत्येक थाली पर मिश्रण लागू करें; थाली धीरे भंवर मिश्रण करने के लिए ।
    6. अगले दिन, ताजा DMEM के 5 मिलीलीटर के साथ मीडिया की जगह-10 ।
    7. ४८ घंटे के बाद प्रारंभिक अभिकर्मक, supernatant इकट्ठा और यह एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से चला रहे हैं । वसूली को अधिकतम करने के लिए DMEM-10 के साथ फिल्टर पूर्व गीला ।
    8. एक 6-अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्लेट को संक्रमित करने के लिए आदर्श मात्रा में फ़िल्टर supernatant Aliquot ।
    9. aliquots पर-८० ° c बाद में उपयोग के लिए फ़्रीज़ करें, या transduction के साथ तुरंत आगे बढ़ें ।
  2. Transduction और luciferase रिपोर्टर पुनर्सक्रियन के लिए व्यक्तिगत hairpins का परीक्षण और ग्यारहवीं पर जंगली प्रकार के MeCP2 जीन की पुनः क्रियाशीलता ।
    1. सुबह में, प्लेट 1 x 105 ग्यारहवीं कोशिकाओं पर अच्छी तरह से 6 प्लेटें ।
    2. दोपहर में, मीडिया की जगह के साथ 2 मिलीलीटर ताजा DMEM-10 युक्त lentiviral supernatant और 5-10 µ जी/polybrene के एमएल से संक्रमित । एक खाली lentiviral वेक्टर से उत्पादित वायरल supernatant के साथ अच्छी तरह से एक नियंत्रण को संक्रमित ।
    3. अगले दिन, DMEM-10 युक्त 1 मिलीग्राम/एमएल puromycin के 2 मिलीलीटर के साथ मीडिया की जगह । चार दिनों के लिए संस्कृति ।
    4. ताजा DMEM के 2 मिलीलीटर के साथ मीडिया की जगह-10 और वसूली के लिए 48-72 एच अनुमति देते हैं ।
    5. ०.०५% trypsin-EDTA के १५० µ l के साथ कोशिकाओं को जुटाना. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए मशीन । DMEM-10 के १.५ मिलीलीटर के साथ बुझाना । 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और ५०० एक्स जी में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    6. मीडिया निकालें और १०० µ l lysis luciferase परख किट में प्रदान की बफर में कोशिकाओं reसस्पेंड । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । luciferase गतिविधि के लिए एक सफेद ९६-अच्छी तरह से थाली और परख के लिए lysates स्थानांतरण किट के साथ शामिल प्रोटोकॉल का उपयोग कर । एक सकारात्मक नियंत्रण और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक खाली lentiviral वेक्टर से संक्रमित ग्यारहवीं कोशिकाओं के रूप में Xa कोशिकाओं का उपयोग करें ।
      नोट: फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए सफेद प्लेटों को उजागर करने से पहले परख करने से बचें; इस पृष्ठभूमि को कम करने और परख संवेदनशीलता में वृद्धि होगी । परख किट में उपलब्ध कराई गई प्रोटोकॉल के लिए सबसे प्रभावी अगर अंधेरे में प्रदर्शन किया जब भी संभव पाया गया था ।
    7. hairpin सक्रिय एक्स गुणसूत्र पर MeCP2 की अभिव्यक्ति स्तर पर एक प्रभाव था कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, tranduced ग्यारहवीं कोशिकाओं से आरएनए को अलग और MeCP2 mRNA स्तर केवल जंगली प्रकार बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन प्राइमरों के साथ मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग माप MeCP2 (एफ: 5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3 ', आर: 5 '-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ') ।
    8. वैकल्पिक: कोशिकाओं puromycin चयन से बरामद किया है के बाद 5-AZA ०.२ µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़कर परख की संवेदनशीलता बढ़ाएं । संस्कृति मीडिया की जगह के बिना ७२ ज के लिए कोशिकाओं, और फिर luciferase गतिविधि के लिए परख वाणिज्यिक luciferase परख किट का उपयोग कर ।
    9. मौन जंगली प्रकार MeCP2 के सक्रियकरण उपाय । Xa कोशिकाओं को संक्रमित, जो MeCP2 ग्यारहवीं पर जंगली प्रकार के बंदरगाह, सदिश वाले व्यक्ति hairpins के साथ, प्रोटोकॉल कदम 3.2.1 का पालन । 3.2.4. कोशिकाओं से आरएनए अलग और माप MeCP2 mRNA स्तर केवल जंगली प्रकार बढ़ाना करने के लिए डिजाइन प्राइमरों के साथ मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग कर MeCP2 (एफ: 5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3 ', आर: 5 '-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ').

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Representative Results

माउस पट्टा fibroblasts एक पहले वर्णित एक्सMeCP2-ल्यूक-HR/XMeCP2 महिला माउस से काटा गया था, retroviral और transduction E6 से एचपीवी-16 E7 से अमर, कमजोर पड़ने वाले सीमित का उपयोग कर क्लोन, और के लिए परीक्षण luciferase गतिविधि और वंय-प्रकार MeCP2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति (चित्र 1a और 1b) । Luciferase गतिविधि मजबूत था अगर रिपोर्टर Xa पर था, और undetectable अगर ग्यारहवीं पर; मूल MeCP2 अभिव्यक्ति एक पारस्परिक स्वरूप का प्रदर्शन किया । हम कोई luciferase गतिविधि (Xi-8) और अधिक प्रयोगों के लिए मजबूत गतिविधि (Xa-3) के साथ एक क्लोन के साथ एक क्लोन का चयन किया । जब ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं 5-AZA के साथ इलाज किया गया, luciferase गतिविधि में एक खुराक पर निर्भर प्रेरण (चित्रा 1C) मनाया गया था ।

hygromycin बी करने के लिए ग्यारहवीं-8 और Xa-3 कोशिकाओं की संवेदनशीलता 3 और 6 दिन लंबी चयन प्रदर्शन करके परीक्षण किया गया था । luciferase रिपोर्टर की अभिव्यक्ति पैटर्न से अपेक्षा के अनुसार, ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं को और अधिक Xa-3 कोशिकाओं की तुलना में hygromycin बी के प्रति संवेदनशील थे, भले ही बाद उच्च खुराक (चित्रा 2a) के लिए संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया. Xa-3 से ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं के एक 1:100 मिश्रण के बाद hygromycin बी के विभिंन सांद्रता, luciferase गतिविधि में एक समय पर निर्भर वृद्धि को उजागर किया गया था, ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं पर Xa-3 कोशिकाओं की सफल प्रतियोगिता का संकेत (चित्रा 2 बी) । खुराक और hygromycin बी चयन की अवधि ग्यारहवीं के तरजीही निषेध पर आधारित आगे प्रयोगों के लिए चुना गया-8 Xa-3 कोशिकाओं पर.

चार स्वतंत्र स्क्रीन का प्रदर्शन किया गया के नियामकों की पहचान करने के लिए MeCP2 मुंह बंद करने का उपयोग कर ग्यारहवीं-8 सेल लाइन और एक खुला है कि कश् मीर-30-आधारित shRNA पुस्तकालय ६४,१५९ विभिंन hairpins क्लोन में एक MSCV-shRNA-pgk-पूरो-आयरेस-GFP retroviral वेक्टर. प्रत्येक स्क्रीन में, बीस 10 सेमी प्लेटें परित shRNAs से संक्रमित थीं, लगभग १०० को लक्षित कर रही हैं, पुस्तकालय की कवरेज गुना । Hygromicin बी 6 दिनों के लिए आयोजित किया गया था, जब तक छोटे acellular पैच मनाया गया; कोशिकाओं को अतिरिक्त 24 ४८ घंटे के लिए मरने के लिए जारी रखा । जब बरामद, कोशिकाओं डीएनए निष्कर्षण के लिए काटा गया एक phenol-क्लोरोफॉर्म तकनीक का उपयोग कर । स्क्रीन प्रति कुल डीएनए उपज 20 µ जी के आसपास था/प्लेट, जो परित और १०० पीसीआर के बीच विभाजित किया गया था आधे hairpins बढ़ाना डिजाइन प्राइमरों का उपयोग प्रतिक्रियाओं । पीसीआर उत्पादों तो मनका-शुद्ध थे और उच्च प्रवाह अनुक्रमण के अधीन ।

पूर्व और बाद के चयन के नमूने hairpin संवर्धन निर्धारित करने के लिए तुलना की गई, के रूप में हमें उंमीद है कि किसी भी hairpin के बाद चयन नमूना लक्षित जीन है कि ग्यारहवीं सक्रिय और इस प्रकार hygromycin प्रतिरोध में ऊंचा स्तर पर मौजूद । केवल hairpins चार स्क्रीन में से कम 2 में समृद्ध मांयता के लिए विचार किया गया । हमारे स्क्रीन के सभी प्रतिकृति में सबसे समृद्ध hairpins चार hairpins लक्ष्यीकरण XIST, XCI11में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के अनुरूप थे ।

स्क्रीन के मांयता भाग को अलग से hairpins कि ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं में luciferase रिपोर्टर के सक्रियकरण के लिए हिट के रूप में पंजीकृत परीक्षण द्वारा किया गया था । हालांकि स्क्रीन एक MSCV आधारित retroviral पुस्तकालय का उपयोग किया गया था, सत्यापन बाहर किया गया था एक lentiviral सदिश का उपयोग (shRNA के साथ व्यक्तिगत pGIPZ क्लोन) retrovirus प्रेरित कलाकृतियों का पता लगाने से बचने के लिए ।

प्रत् येक प्रत् येक प्रत् येक प्रत् येक प्रत् येक प्रत् येक प्रत् येक भिन् न hairpin अनुक्रम का लक्ष् य जीन के द्वारा लक्षित किया गया था और वास् तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR) द्वारा पछाड़ना किया गया था । 6 में 1 x 106 कोशिकाओं को परख द्वारा अच्छी तरह से प्रारूप और पृष्ठभूमि luminescence कम (चित्रा 2c), हम बहुत कम आवृत्ति पुनः सक्रिय करने की घटनाओं है, जो हम 1 में होने का अनुमान का पता लगाने में सक्षम थे: 20000 रेंज ।

इसके अलावा व्यक्तिगत hairpins का उपयोग कर विश्लेषण 30 जीन जिनकी पछाड़ना एकादश पर रिपोर्टर की पुनर्क्रियाशीलता के परिणामस्वरूप की पहचान के लिए नेतृत्व किया । इन 30 जीनों के लिए luminescence का औसत परिमाण २.८ था-आधार रेखा है, जो आगे ७.१ के लिए परिलक्षित किया गया था ऊपर गुना 5-AZA उपचार के बाद गुना । एक ही hairpins 5-AZA के साथ संयोजन के रूप में पुनर्परीक्षण किया गया, Xa-3 कोशिकाओं के साथ फिर से की पुष्टि करने के लिए-ग्यारहवीं से जंगली प्रकार MeCP2 की अभिव्यक्ति. यह RT-qPCR केवल MeCP2 के जंगली प्रकार प्रतिलिपि बढ़ाना डिजाइन प्राइमरों का उपयोग करके हासिल किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1. MeCP2 के साथ क्लोन का अलगाव-ल्यूक-एचआर रिपोर्टर जीन Xi पर ।
एक) अमर पट्टा fibroblasts क्लोन (1-9) पर प्रतिनिधि जुगनू luciferase परख । गैर ट्रांसजेनिक (NT) और ट्रांसजेनिक heterozygous महिला (एफ) से प्राथमिक fibroblasts क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । ख) प्रतिनिधि पश्चिमी (ए) में कोशिकाओं से MeCP2 प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखा दाग । ध्यान दें कि luciferase गतिविधि (चित्र 1a) और MeCP2 व्यंजक प्रदर्शन पारस्परिक अभिव्यक्ति प्रतिमान । ग) 5-AZA के साथ ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं में जुगनू luciferase गतिविधि की प्रेरण । Xa-3 कोशिकाओं, Xa पर रिपोर्टर जीन के साथ, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. ग्यारहवीं-8 और Xa-3 कोशिकाओं में hygromycin प्रतिरोध का लक्षण वर्णन ।
A) ग्यारहवीं-8 और Xa-3 विभिन्न hygromycin बी परहेजों के साथ इलाज कोशिकाओं के सापेक्ष वृद्धि (3 डी = 3 दिन; 6D = 6 दिन), अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में. ख) Luciferase गतिविधि संवर्धन के बाद कुल १०,००० Xa-3 और ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं (मिश्रित 1:100 अनुपात में) के लिए hygromicin B (25 µ g/एमएल) के दिनों की संकेत संख्या के लिए । पोस्ट-एक्सपोज़र luciferase गतिविधि संवर्धन की गणना करने के लिए पूर्व-एक्सपोज़र स्तर से विभाजित किया गया था । ग) जुगनू ग्यारहवीं में luciferase गतिविधि-8 कोशिकाओं, ९६ में परख-और 6 अच्छी तरह से प्रारूप, के साथ और बिना 5-AZA (10 µ एम) । नॉन-ट्रांसजेनिक (NT) fibroblasts का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया । 5-AZA वृद्धि luciferase गतिविधि ७.२-और ८६-९६ में आधार रेखा से अधिक गुना-और 6 अच्छी तरह से प्रारूप, क्रमशः । (N = 3, * p < ०.००१, * * p < ०.०००१ छात्र के t-परीक्षण द्वारा 5-AZA इलाज और अनुपचारित ग्यारहवीं-8 कोशिकाओं की तुलना.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हमारे हाल के अध्ययन में6, हम luciferase और hygromycin प्रतिरोध एकादश पर MeCP2 से जुड़े जीन के साथ एक murine सेल लाइन उत्पंन, और यह > 60, 000 transduced लक्ष्यीकरण > 25, 000 जीन के एक पुस्तकालय के साथ shRNAs । हमने पाया है 30 जीन जिनकी दस्तक नीचे hygromycin बी चयन के अंतर्गत लिटरेचर अस्तित्व लाभ, MeCP2 और एक्स गुणसूत्र मुंह बंद करने के नियंत्रण में अपनी भूमिका का सुझाव । ये परिणाम व्यक्तिगत hairpins के साथ रिपोर्ट की गई सेल लाइन transducing और मूक luciferase रिपोर्टर के पुनर्क्रियाशीलता का आकलन करके मान्य किए गए.

लग रहा है कि हमारे स्क्रीन के सभी प्रतिकृति में शीर्ष चार hairpins लक्षित XIST हमारे विधि के लिए एक मजबूत आंतरिक सत्यापन प्रदान की, XCI11में XIST की निर्णायक भूमिका दी । TGFβ superfamily, जिसका XCI में नियामक भूमिका के अलावा पहले नहीं बताया गया था, अंय की पहचान की जीन सभी संबंधों को epigenetic विनियमन के साथ कार्यात्मक परिवारों के थे, इस प्रकार हमारे विधि12 के लिए एक अतिरिक्त मांयता के रूप में सेवारत , 13 , 14. इसके अलावा, हम भी 13 पहले एक अलग स्क्रीन में पहचान की जीन से बाहर 4 का पता लगाया, एक सीएमवी प्रमोटर चालित GFP बेतरतीब ढंग से ग्यारहवीं15पर डाला का उपयोग कर ।

उपयुक्त खुराक और hygromycin बी चयन की अवधि की स्थापना स्क्रीनिंग शर्तों के अनुकूलन में महत्वपूर्ण था । हमारे सेल लाइन की संवेदनशीलता बीज घनत्व पर अत्यधिक निर्भर था, और retroviral संक्रमण से प्रतिकूल रूप से प्रभावित था । वृद्धि की खुराक या चयन की लंबाई भी Xa पर रिपोर्टर के साथ कोशिकाओं के विकास में बाधा है, जबकि मामूली चयन hairpin संवर्धन के लिए संवेदनशीलता को कम. एकाधिक hygromycin बी खुराक परहेजों और रिपोर्टर सेल सीडिंग घनत्व इस प्रकार अंतिम स्क्रीनिंग से पहले परीक्षण किया गया । इसके अलावा, हालांकि हमारे shRNA पुस्तकालय में MSCV retroviral वेक्टर एक को puromycin चयन का उपयोग करें और सफलतापूर्वक transduced कोशिकाओं के लिए समृद्ध अवसर प्रदान की, puromycin हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल नहीं किया गया था, puromycin और hygromyin बी के अनुक्रमिक उपयोग के रूप में अत्यधिक विषाक्तता के परिणामस्वरूप, दोनों एंटीबायोटिक दवाओं के उचित खुराक de-वृद्धि के बाद भी ।

सभी हमारे अध्ययन में पहचान hairpins भी मूक luciferase रिपोर्टर सक्रिय है, हालांकि एक और मामूली डिग्री के लिए । इन निराला घटनाओं का पता लगाने हमारी स्क्रीन की उच्च संवेदनशीलता द्वारा सक्षम किया गया था, जो हम अनुमान, ग्यारहवीं और Xa कोशिकाओं के परीक्षण admixtures के आधार पर, 2 एक्स 104 कोशिकाओं में एक पुनः सक्रियण घटना होने के लिए । पुनर्क्रियाशीलता के इस तरह के निंन स्तर, 5-AZA के सह-आवेदन के साथ वृद्धि हुई है, XCI के तंग transcriptional नियंत्रण को बाधित करने में पहले से वर्णित कठिनाइयों को attest12,13,16,17, और मतलब है कि कई विनियामक तंत्र के विघटन के लिए महत्वपूर्ण पुनर्सक्रियण प्राप्त करने की जरूरत होगी ।

ध्यान दें की, सभी 30 हमारे स्क्रीन में पहचान की hairpins भी एक सीएमवी संचालित रिपोर्टर जीन एक अलग एक्स गुणसूत्र लोकस पर स्थित सक्रिय, ग्यारहवीं de-दमन पर उनके व्यापक प्रभाव का संकेत है । आगे के अध्ययन के लिए परीक्षण की जरूरत है कि क्या MeCP2-विशिष्ट "reउत्प्रेरक" मौजूद हैं, के रूप में उनके औषधीय या आनुवंशिक हेरफेर Rett सिंड्रोम के इलाज में असाधारण उपयोगी साबित हो सकता है ।

हमारे स्क्रीनिंग प्रणाली पहले वर्णित एक्स गुणसूत्र पुनः सक्रियण स्क्रीन12,17के लिए इस्तेमाल किया पत्रकारों पर कई लाभ प्रदान करता है । के बजाय एक सीएमवी प्रमोटर द्वारा संचालित किया जा रहा है, हमारे रिपोर्टर कैसेट में सी पर खटखटाया है- MeCP2 की टर्मिनस और इस प्रकार देशी एक्स से प्रेरित-प्रवर्तक जुड़ा हुआ है । इस डिजाइन में मदद कर सकते है MeCP2 लोकस-विशिष्ट नियामकों की पहचान, Rett सिंड्रोम अनुसंधान के संदर्भ में और अधिक प्रासंगिक, एक चेतावनी के साथ कि अमर fibroblasts में निष्कर्षों ंयूरॉंस में recapitulated होना चाहिए, MeCP2 की वांछित साइट पुनर्सक्रियन. एक hygromycin प्रतिरोध जीन के उपयोग के सक्रियकरण की घटनाओं के सकारात्मक चयन में सक्षम बनाता है और मजबूती से स्क्रीन संवेदनशीलता बढ़ जाती है । इसके अलावा, hygromycin प्रतिरोध युक्त कैसेट और जुगनू luciferase जीन सक्षम बनाता है दोनों बड़े पैमाने hygromycin बी के साथ सकारात्मक चयन का उपयोग कर स्क्रीनिंग, और परीक्षण/luciferase रिपोर्टर का उपयोग कर व्यक्तिगत hairpins ।

संक्षेप में, हम स्तनधारी कोशिकाओं में MeCP2 और एक्स-गुणसूत्र मुंह बंद करने के नियामकों की पहचान के लिए एक मजबूत और संवेदनशील आनुवंशिक जांच पद्धति की रिपोर्ट करते हैं । इस पद्धति को स्क्रीनिंग छोटे हस्तक्षेप RNAs (siRNAs), CRISPR, या छोटे अणुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ऐसे परख चिकित्सीय दृष्टिकोण है कि एक मूक जीन के कार्यात्मक एलील को पुनः सक्रिय करने पर निर्भर स्थापित करने में उपयोगी साबित हो सकता है, जैसे Rett सिंड्रोम के मामले में ।

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Disclosures

Dr. लेको फ्रेड Hutchinson कैंसर अनुसंधान केंद्र के एक कर्मचारी के रूप में इस लेख के लिए योगदान दिया ।  विचारों को अपने ही व्यक्त कर रहे है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं

Acknowledgments

हम कृपा से shRNA स्क्रीन में इस्तेमाल किया पुस्तकालय प्रदान करने के लिए मेलबोर्न विश्वविद्यालय के रॉस Dickins धंयवाद । यह काम Rett सिंड्रोम रिसर्च ट्रस्ट (अटल बिहारी) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

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References

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आनुवंशिकी अंक १३३ एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता epigenetics MeCP2 Rett सिंड्रोम XIST shRNA स्क्रीनिंग
निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर MeCP2 के पुनः सक्रिय करने के लिए परित shRNA स्क्रीन
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Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. … More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

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