Summary
小さいヘアピン RNA (shRNA) とホタルのルシフェラーゼとマウス細胞における x 染色体不活性化のレギュレータを識別するの次世代シーケンス ベースのプロトコルについて報告して、メチル CpG 結合蛋白質 2 (hygromycin 抵抗性遺伝子融合MeCP2)不活性 X 染色体の遺伝子。
Abstract
前方遺伝スクリーン、ヘテロクロマチンに挿入されたレポーター遺伝子を使用しては、モデル有機体のエピジェネティックな調節機構を調査するため広く使用されています。短いヘアピン Rna (Shrna) とクラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) などの技術は、二倍体の細胞でこのような画面を有効にしています。ここで説明の x 染色体の不活性化 (嘲りながら)、レギュレータの大規模 shRNA 画面マウス細胞株を用いたホタルのルシフェラーゼとメチル CpG 結合タンパク質の C 末端で hygromycin 抵抗性遺伝子ノックアウト 2 (MeCP2) 遺伝子非アクティブな x 染色体 (Xi)。レポーター細胞ラインの構造の再授与 hygromycin B 選択で、大きな shRNA ライブラリを選別し、ヘアピン、事後選択濃縮を使用して測定することによって、記者を再アクティブ化する私たちを有効に存続の利点次世代シーケンス。豊かなヘアピンが Xi のルシフェラーゼ レポーターを有効にする能力をテストすることによって個別に検証されます。
Introduction
1 つ女性、レット症候群、遺伝性精神障害の最も一般的なフォームMeCP2、正常な神経機能1に不可欠なタンパク質をエンコードする x 染色体遺伝子のヘテロ変異が原因です。MeCP2表現の復元だったように病1,のマウスモデルで神経学的な欠損を逆に、この疾患の治療への潜在的なアプローチは、Xi に野生型のMeCP2遺伝子の再活性化になります。2,4しますただし、メスの細胞における染色体 X 2 つのエピジェネティックなサイレンシングはしっかりと生物3,4の場合は、生涯維持と Xi 遺伝子の強力な再活性化の主要な必要があります。複数のエピジェネティックな調節経路で中断。
MeCP2のサイレンシングのメンテナンスに必要な要因を識別するために我々 は最初にMeCP2- ルシフェラーゼ - hygromycin 抵抗遺伝子融合 (MeCP2 リュック HR) を乗せて X 染色体 2 つのトランスジェニック マウス モデルを開発 (XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5。不安定で機能、(XMeCP2 リュック HR/Y) hemizygous 男性で模倣した表現型のMeCP2削除、レポーター遺伝子の表現の損失で起因したことが分かったMeCP2融合コンストラクトの表現が内因性 MeCP25の式と一致するパターンで容易に検出されました。非アクティブまたはアクティブのいずれかの x 染色体の構築と不死化線維芽細胞クローンを生成し、その元表現野生型 MeCP2 およびない記者の構築; 確認逆は、後者の本当だった。Xi (「レポーター細胞」) のレポーター細胞が作成を再アクティブ化することができることを示す生物発光アッセイの活動を得られる DNA 遺伝子サイレンシング廃止に知られているエージェントを demethylating 5-アザシチジン (5 字) に露出されたとき、したがって遺伝学的スクリーニングに使用されます。
次にMeCP2のサイレンシングのレギュレータのハイスループット遺伝学的スクリーニングを行った。記者のセルライン レトロ ウイルス ライブラリを含む感染した最初 > 60,000 異なる Shrna ターゲット >6マウスのゲノム5,の中の 25,000 の遺伝子 hygromycin B 選択を。ヘアピン周波数を事前に比較したし、次世代シーケンシングによる事後選択サンプル、記者として再活性化 hygromycin B 選択成長の優位性を与えられる責任のヘアピンの濃縮の結果します。このアプローチを使用して、我々 は 30 遺伝子サイレンシング、 MeCP2の関与し、個々 のヘアピンのレポーター細胞の伝達と、ルシフェラーゼ活性測定による調査結果を確認後。
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Protocol
動物を含むすべての手順は、フレッド ・ ハッチンソンがん研究センター機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルを使用して行われました。5-アザシチジン (5 字) を除いて重大な健康リスクを引き起こす知られていますここで使用する試薬はありません。
1. Xi にMeCP2- リュック ・ HR 遺伝子レポーター細胞ラインを生成します。
-
MeCP2 リュック HR /X X 女性からマウス腱線維芽細胞を準備するMeCP2マウス
- 10-12 日を安楽死させる-MeCP2 リュック HR/X X 古い女性MeCP2マウス。
- ストレート解剖はさみを使って、近位のテール部分の皮膚を環状切開を作る。
- 尾の基盤の近くの死体を保持、尾の線維軟骨部分を公開するマウスから肌を引き出します。削除し、手術用のメスを使用して長いフラグメント 1 mm にターミナル公開される組織の 10 mm を切る。
- 断片化された組織を 15 mL の円錐管含む 5 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 1 U/mL ペニシリン、1 μ G/ml ストレプトマイシン、1.5 mg/mL コラゲナーゼ、転送済み 0.45 μ m とし、0.2 μ m のメッシュ フィルターでろ過します。連続回転で 37 ° C で 3-4 時間インキュベートします。
- 10 分間遠心室温 500 x gでサンプルは 10 mL と 10% 牛胎児血清、1 U/mL ペニシリン 1 μ G/ml ストレプトマイシン (DMEM-10) 6 ウェル培養プレート上にプレート DMEM にペレットを再懸濁します。一度セルを通過し、次のステップに進む前に 10 cm のプレートを展開します。
- 7を前述のように HPV 16 ウイルス遺伝子 (E6 ・ E7) を運ぶ表現のベクトルと、伝達を実行することによって、細胞を不死化します。
-
単一細胞のクローンを選択してMeCP2記者式を評価
- 10 cm のプレートから細胞を採取します。まず、メディアを吸引、0.05% トリプシン-EDTA の 1 つの mL を追加し、37 ° C で 2-5 分間インキュベートDMEM 10 9 mL で急冷し、15 mL の円錐管に再懸濁細胞を収集します。
- 細胞を希釈と 1 セル/100 の最終的な集中に DMEM 10 μ L。 96 ウェルのプレートにして転送の懸濁液 100 μ l 分注を各ウェルに。
- 井戸が合流、2-3 週を取ることができるまでは、37 ° C で孵化させなさい。すべての 3-5 日新鮮な DMEM 10 でメディアを置き換えます。合流、ウェルあたり 0.05% トリプシン-EDTA の 20 μ L で細胞を動員、96 ウェルのプレートの 2 つの重複したセットに分割します。
- ルシフェラーゼ活性アッセイ プレートの 1 つのセットを使用します。メディアの除去を必要としない均質なホタルのルシフェラーゼ アッセイ キットを使用します。キットに含まれているプロトコルに従ってください。
- 1.2.4 のステップからの結果を使用して、プレートの残りのセットから検出可能なルシフェラーゼ反応のないクローンを選択します。24 ウェルとし 6 ウェル プレートにこれらのクローンを展開します。
- 最高のルシフェラーゼ活性; クローンを同じように実行します。これは、検証のために肯定的な制御として使用されます。
- 西部のしみのため 6 ウェル プレートの各ウェルの因数を収穫します。0.05% トリプシン-EDTA の 200 μ L で細胞を動員します。37 ° C で 2-5 分間インキュベートします。DMEM-10、2 mL でクエンチし、セルの半分を 1.5 ml 遠心チューブに転送します。西部のしみのため溶解する前に PBS で 1 回洗浄します。あるいは、別の 6 ウェル プレートにセルの半分を転送します。セルはプレートの下に付ける、PBS で洗い、西部のしみのために分離します。
- 西部劇を行うアンチ MeCP2 ルシフェラーゼ陽性細胞はアクティブ X 染色体; から野生型 MeCP2 を表現しないとルシフェラーゼ陰性細胞が表現を確認する抗体のしみ前に説明したプロトコル8に従ってください。肯定的な制御として脳組織、野生型マウスから溶解液を使用します。
- 2 x 105 6 ウェル プレートで細胞/ウェルでいくつかの否定的なクローンをプレートします。10 μ M の 5 字で一度治療、72 時間インキュベートするメディアを変更することがなく、ルシフェラーゼ活性のアッセイの 1.2.3 のステップで説明したよう。
- 5 字でルシフェラーゼ活性を獲得し、複数の 10 cm の板に拡大を開始する 1 つの否定的なクローン (Xi クローン) を選択します。液体窒素で残りの負のクローンをバックアップとして凍結します。肯定的なクローン (Xa クローン) を組織培養で維持またはさらに使用まで冷凍できます。
2. スクリーニング hygromycin B 選択を使用して再活性化のためのライブラリ
-
テスト クローンに感染する、選択を適用してシーケンスの DNA の収穫
- ShRNA ライブラリからヘアピンを表現するレトロ ウイルスの構造のウイルス濃縮を取得または目的のライブラリに含まれているプロトコルを使用して濃縮ウイルス上清を生成します。
- 前の画面では、にライブラリ (使用可能な場合、GFP マーカーを使用して) 滴定しなさい。0.3 と 0.5 の間の感染症の多様性を目指してください。
注: は、偽陽性率を最小限に抑えるために、少なくとも 4 つの独立した画面を実行します。20 枚画面を使用して、ヘアピンの適切な表現を維持し、ランダム ドロップ アウト9を避けるのためのライブラリの 100 のカバレッジを取得します。しかし、下位のカバレッジが十分であること可能性が高い正の選択画面と大規模なライブラリのサイズを考えると、です。 - 朝は、1 x 106 Xi 細胞培養プレート 10 cm をプレートします。
- 午後は、新鮮な DMEM 10 5 10 μ G/ml polybrene のウイルス上清を含むメディアを置き換えることによってプレートに感染します。2.1.2 ステップで決定したウイルス上清の量を使用します。
- 18-24 h 後メディアを吸引し、新鮮な DMEM 10 の 10 mL を各プレートに追加します。さらに 48 時間培養。
- 朝は、0.05% トリプシン-EDTA プレートごとの 1 つの mL を使用して細胞を動員し、プレートごと DMEM 10 の 9 ml を癒やします。懸濁液を 100 μ m のメッシュ フィルターを実行します。フィルター処理された懸濁液を一緒にプール、種子 1 x 106セル/プレート 10 cm プレートの 2 セット。
- 午後は、15 μ g/mL hygromycin B (0 日) を含む DMEM 10 で板の 1 セットのメディアを置き換えます。その他のセットで、メディアを新鮮な DMEM 10 だけに置き換えます。
- 48 時間後に 0.05% トリプシン-EDTA の 1 ml を用いた平板の未処理のセットから細胞を動員します。37 ° C で 2-5 分間インキュベートします。DMEM 10 の 9 ml を癒します。室温で 5 分間 15 ml の円錐管 500 × g で遠心分離し細胞を転送します。培養上清を吸引し、ペレットからの DNA の抽出をすぐに続行します。また、遠心分離のステップの前に大きなチューブに細胞をプールします。
- フェノールと chroroform の混合物を用いた DNA を抽出し、前述10としてナトリウム酢酸と冷エタノールと DNA の沈殿物します。個々 の事前選択 DNA サンプルをプールし、さらに使用するまで-20 ° C で保存します。
- Hygromycin B 選択 4 日間セットを培養を続けます。2 日後新鮮な DMEM 10 含む hygromycin B に選択メディアを補充します。
- 7 日には、新鮮な DMEM 10 のみで選択メディアを置き換えます。2 〜 4 日間、回復を許可し、2.1.8 の手順で説明するようセルを収穫します。2.1.9 の手順で説明するよう、DNA の抽出を続行します。
-
ヘアピン後の選択サンプルの濃縮を識別します。
- 使用 5' コンテキスト (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') と 3' をループのプライマーを逆に (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') 事前と事後選択の DNA サンプルから半分ヘアピンを増幅します。抽出した DNA を別の PCR 反応反応ごとの DNA の 100-200 ng を使用すべて。
注: これらの 5' コンテキスト プライマーおよび 3' リバース ループ プライマー ミール 30 コンテキスト シーケンス shRNA 挿入の上流と shRNA ループ シーケンスにそれぞれ対応します。異なるライブラリは、異なる oligos を必要があります。必要に応じてサイズの異なる製品を分離精製工程を調整します。 - プライマーと DNA、削除し、100 と 200 の跪くの PCR の製品を回復使用サイズ選択ビーズ ビーズに含まれているプロトコルに従います。
- 半分ヘアピンをシーケンスにシーケンス ライブラリを準備します。画面ごとの少なくとも 5000 万の読み取りを生成します。シーケンス キットおよび装置に適したプロトコルに従ってください。
注: 各 shRNA ライブラリ内の 1000-fold の表現との適切な表現を保証する、独立した感染 (各 shRNA を 100 形式で実施) の約 10 倍報道画面あたり 5000 万の読み取りを提供します各感染症のイベントです。 - 完璧な試合でシーケンスをカウントする Perl スクリプトを使用して各 shRNA を列挙します。少なくとも 10 の読み取りは、さらなる分析のために予選プール Shrna を選んだ。予備選択後の比件数 1000 順列に基づいて虚偽の発見率 (FDR) の決定など、濃縮を計算します。Shrna の標的遺伝子を選んだ < 5% として FDR「ヒット」さらにテストするため。
- 使用 5' コンテキスト (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') と 3' をループのプライマーを逆に (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') 事前と事後選択の DNA サンプルから半分ヘアピンを増幅します。抽出した DNA を別の PCR 反応反応ごとの DNA の 100-200 ng を使用すべて。
3. 識別されたヘアピン (「ヒット」) を検証します。
-
画面で識別される Shrna を含むパッケージ レンチ
- シード 8 x 106 293 FT 細胞あたり 10 cm のプレート上にプレート。
- 9 ml の抗生物質無料 DMEM 10 プレートあたりのメディアを交換して次の日、トランスフェクション前にこの 30 分を行います。
- 30 分間隔の間に transfection のため 2 つのミックスを準備します。
- ミックス 1 を準備 (プレート/shRNA; あたりスケール アップ Shrna の総数に従って): 最適な最小重要なメディアの 0.5 mL で 2 mg/mL ポリエチレンイミン (PEI) を 10 μ l 添加します。ピペッティングで混ぜるし、5 分間室温でインキュベートします。
- (ShRNA) あたりミックス 2 の準備: パッケージ化される shRNA ベクターの 4 μ g、VSV G 封筒ベクター (pMD2.G) の 1.5 μ g と 2.5 μ g 包装ベクトル (psPAX2) の最適な最小重要なメディアの 0.5 mL で混在します。
注: は、感染のネガティブ コントロールとして使用する包装で空レンチウイルスベクターを含みます。
- ミックス 2 の各因数にミックス 1 の 0.5 mL を追加、軽くピペッティングで混ぜます。20 分間室温で暗闇の中で孵化させなさい。
- 滴状形式でステップ 3.1.2 から各プレート上に混合物を適用します。ミックスに軽くプレートを旋回します。
- 次の日は、5 ml の新鮮な DMEM 10 のメディアを置き換えます。
- 初期のトランスフェクション後 48 時間は、上澄みを収集し、0.22 μ m フィルターを介してそれを実行します。前回復を最大限に DMEM 10 フィルターを濡れています。
- 約数量 6 ウェル プレートによく感染するために理想的にフィルター処理された上澄み。
- -80 ° c 保存用試料を凍結またはすぐに伝達を行います。
-
伝達およびルシフェラーゼ レポーター再活性化と、Xi に野生型 MeCP2 遺伝子の再活性化のための個々 のヘアピンのテストします。
- 朝は、1 × 105 Xi 6 ウェル プレートに細胞/ウェルをプレートします。
- 午後は、2 ml の新鮮な DMEM 10 レンチ ウイルス上清および polybrene の 5-10 μ G/ml を含むメディアを置き換えることによってプレートに感染します。空レンチウイルスベクター由来ウイルス上清をよくコントロールに感染します。
- 次の日は、DMEM 10 含む 1 mg/mL ピューロマイシン 2 mL でメディアを置き換えます。4 日間のカルチャです。
- 新鮮な DMEM 10 の 2 mL でメディアを交換し、回復のための 48-72 時間を許可します。
- 0.05% トリプシン-EDTA の 150 μ L で細胞を動員します。37 ° C で 2-5 分間インキュベートします。DMEM 10 1.5 mL で癒します。室温で 10 分間、15 ml の円錐管 500 × gで遠心分離し細胞を転送します。
- メディアを取り出し、ルシフェラーゼ アッセイ キットで提供される 100 μ L 換散バッファーに細胞を再懸濁します。室温で 5 分間インキュベートします。白 96 ウェル プレートとのキットに含まれているプロトコルを用いたルシフェラーゼ活性測定に lysates を転送します。肯定的な制御と感染陰性対照として空レンチウイルスベクター Xi 細胞 Xa セルを使用します。
注: 試金; 前に蛍光灯の光に白いプレートを公開することを避けるためこれは背景を削減し、アッセイの感度を上げます。アッセイ キットで提供されるプロトコル可能な限り暗闇の中で実行する場合に最も効果的であることがわかった。 - ヘアピンがアクティブな x 染色体に MeCP2 の発現レベルに影響を与えたかどうかを確認するのに tranduced Xi 細胞からの RNA を隔離し、量的な PCR を用いた野生型 MeCP2 (f: のみを増幅するプライマー MeCP2 の mRNA のレベルを測定5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3')。
- オプション:細胞は、ピューロマイシンを選択から回復した後、最終濃度 0.2 μ M の 5 字を追加してアッセイの感度を高めます。メディアを交換しなくても 72 時間細胞の培養や、商業ルシフェラーゼ アッセイ キットを用いたルシフェラーゼ活性のアッセイします。
- 沈黙の野生型 MeCP2 の再活性化を測定します。プロトコル手順 3.2.1 個々 のヘアピンを含むベクターを使用して、Xi に野生型 MeCP2 を抱く Xa 細胞に感染します。-3.2.4。細胞からの RNA を隔離し、量的な PCR を用いた野生型 MeCP2 のみを増幅するプライマー MeCP2 の mRNA のレベルを測定 (f: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3')。
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Representative Results
マウス腱線維芽細胞が収穫されたMeCP2 リュック HR/X X 上記からMeCP2雌マウス、HPV 16 virus7 から E6 と E7 遺伝子のレトロ ウイルスの伝達によって不死化制限の希釈を使用してクローンを作成およびテストルシフェラーゼ活性と野生型の MeCP2 タンパク質 (図 1 a および 1 b) の発現。ルシフェラーゼ活性は記者は、Xa、堅牢性と検出されない場合 Xi;ネイティブの MeCP2 表現は、相互のパターンを示した。ルシフェラーゼ活動 (Xi-8) クローンと堅牢な活動 (Xa-3) さらに実験のためにクローンを選びました。Xi 8 セルは 5 字と扱われた、ルシフェラーゼ活性の用量依存的誘導 (図 1) が見られました。
Xi-8 および Xa 3 細胞 hygromycin B への感受性は、3 と 6 日間にわたる選択を実行することによってテストされました。ルシフェラーゼ レポーターの発現パターンから期待どおりに Xi 8 細胞であったにもかかわらず、後者の展示 (図 2 a) 高用量の場合感度 Xa 3 セルより hygromycin B に敏感.後 Xi 8 セルに Xa 3 の 1: 100 ミックスの異なる露出の濃度 (図 2 b) Xi 8 セルに Xa 3 セルの成功した競争を示す hygromycin B、ルシフェラーゼ活性の時間依存の増加が観察されました。及び投与期間 hygromycin B 選択の Xa 3 セルに Xi 8 の優遇の阻害に基づく実験さらに選ばれました。
4 つの独立した画面は、 MeCP2サイレンシング Xi 8 細胞ラインおよびオープン バイオ システム ミールを使用しての規制当局を識別するために行われた-30-64,159 異なるヘアピンを含むベース shRNA ライブラリ MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP レトロ ウイルスにクローンを作成ベクトル。各画面で 20 10 cm プレートは、ターゲット ライブラリを約 100 カバー、プールの Shrna に感染していた。Hygromicin B を行った 6 日で、無細胞の小さなパッチが観測されました。セルは、追加の 24 〜 48 時間のために死ぬを続けています。回復したときセルをフェノール-クロロホルム法を用いた DNA 抽出のため収穫されました。画面ごとの総 DNA の収穫は約 20 μ g/プレート、プールされ、半分ヘアピンを増幅するプライマーを使用して 100 の PCR の反作用の間で分割だったPCR の製品、ビーズ精製され高スループット シーケンスを受けます。
事前と事後選択のサンプルは、事後選択サンプルでレベルが上がった現在任意のヘアピンが Xi を再アクティブ化し、こうして授与 hygromycin 抵抗遺伝子をターゲットと予想通りヘアピン濃縮を決定する比較しました。4 つのスクリーンの少なくとも 2 の濃縮ヘアピンのみ検証のためと考えられました。我々 の画面のすべての複製で最も豊かなヘアピンはあったターゲットにXIST、嘲りながら11でその重要な役割を持つ一貫性のある 4 つのヘアピンです。
画面の検証部分は Xi 8 細胞におけるルシフェラーゼ レポーターの活性化のためのヒットとして登録されているヘアピンを個別にテストを行った。MSCV ベースのレトロ ウイルス ライブラリを使用して画面が実施されたが検証を行ったレトロ ウイルスによる成果物の可能な検出を回避するレンチウイルスベクター (shRNA の個々 の pGIPZ のクローン) を使用します。
少なくとも 2 つの異なるヘアピン シーケンスの各候補者の遺伝子の標的にされ、ターゲット遺伝子のノックダウンは、リアルタイム定量 PCR (RT qPCR) によって確認されました。6 ウェル形式で最大 1 x 10 の6セルの試金、バック グラウンド発光 (図 2) を小さくすることによって 1:20,000 の範囲であることを推定した、非常に低周波活性化イベントを検出することができました。
個々 のヘアピンを使用して詳細な分析は、Xi のレポーターの再活性化で起因したそのノックダウン 30 遺伝子の同定につながった。中央 30 遺伝子の発光量が 2.8-fold さらに 7.1-fold 次 5 字治療に増幅された、ベースラインより上。5 字、野生型MeCP2 Xi からの再発現を確認する Xa 3 セルと組み合わせて、同じヘアピンが確かめられました。これ RT qPCR の実行によって達成された MeCP2 の野生型トラン スクリプトのみを増幅するプライマーを使用しています。
図 1。Xi に MeCP2 リュック時間レポーターの遺伝子を持つクローンの分離。
A) 代表的なホタル ルシフェラーゼ アッセイ不死化腱線維芽細胞は、(1-9) を複製します。非遺伝子組換え (NT) と遺伝子ヘテロ女性 (F) 主線維芽細胞は、それぞれ正と負のコントロールとして使用されました。B) 代理人の西部のしみ方 (A) のセルの MeCP2 タンパク質発現を示します。(図 1 a) ルシフェラーゼ活性と MeCP2 表現が相互表現パターンを示すことに注意してください。C) 5 字西 8 セルにおけるホタル ルシフェラーゼ活性の誘導。Xa 3 セル、Xa をレポーター遺伝子とは、肯定的なコントロールとして機能します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。Xi-8 および Xa 3 セルで hygromycin 抵抗の評価。
Xi 8 および Xa 3 細胞の) 相対成長が異なる hygromycin B レジメンで治療 (3 D = 3 日; 6 = 6 日) 未処理の細胞と比べて。10,000 Xa 3 および Xi-8 セル (1: 100 の比率で混合) hygromicin B の合計を露出させた後 B) ルシフェラーゼ活性濃縮 (25 μ g/mL) の日数を示します。暴露後ルシフェラーゼ活性は、濃縮を計算する曝露前レベルによって分かれていた。C) ホタル ルシフェラーゼ細胞における活性 Xi 8、5 字 (10 μ M) と、96 ウェルと 6 形式で試金されます。非遺伝子組換え (NT) 線維芽細胞は、陰性対照として使用されました。5 字は、それぞれ 96 ウェルと 6 形式でベースラインをルシフェラーゼ活性 7.2 86 倍を増加しました。(N = 3、* p < 0.001 * * p < 0.0001 学生の t テスト比較 5 字で扱われ、未処理の Xi 8 セル)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
私たちの最近の研究6ルシフェラーゼとマウス セルラインを生成、hygromycin 抵抗性遺伝子、Xi にMeCP2を融合し、ライブラリを導入 > 60,000 Shrna ターゲット > 25,000 の遺伝子。我々 有利さを見つけて 30 遺伝子がノックダウン授与生存 hygromycin B 選択で、 MeCP2と x 染色体のサイレンシングの制御における役割を示唆しています。これらの結果はあった個々 のヘアピンで報告されたセルラインを伝達とサイレント ルシフェラーゼ レポーターの再活性化の評価によって検証されました。
XISTを我々 の画面のすべての複製でトップ 4 つのヘアピンにターゲット発見には、嘲りながら11 XISTの極めて重要な役割を与えられた私たちのメソッドの強力な内部検証が用意されています。こうして私たちの方法12に対して追加の検証として、エピジェネティック制御とのつながりで嘲りながらでその規制の役割が記載されていない TGFβ スーパーファミリーは別としてすべて他の識別された遺伝子が機能的な家族に属していた,13,14します。 さらに、我々 も別画面で遺伝子以前 13 から 4 を使用して検出 Xi15にランダムに挿入される GFP のプロモーターに駆動される CMV。
適切な用量と hygromycin の期間を確立する B 選択のスクリーニング条件を最適化することで重大だった。私達の細胞ラインの感度が高い播種密度、依存していたし、されたレトロ ウイルス感染によって悪影響を受けます。増加量または選択範囲の長さも穏やかな選択ヘアピン濃縮の感度の低下に対し、Xa のレポーターと細胞の成長を抑制しました。複数の hygromycin B 投与レジメンとレポーター細胞播種量従って最終上映前にテストされました。また、shRNA ライブラリ MSCV レトロ ウイルスのベクトルは、ピューロマイシンを選択を使用して、正常に導入された細胞を豊かにする機会を提供、ただしピューロマイシン使用されませんでした実験でピューロマイシンと hygromyin B の連続使用両方の抗生物質の適切な投与量逆エスカレーション後も過剰な毒性で起因しました。
我々 の研究で識別されるすべてのヘアピンもより控えめな程度にとはいえサイレント ルシフェラーゼ レポーターを再開しました。これらの間欠的なイベントの検出を 2 x 10 の4セル 1 つ再活性化イベント Xi および Xa 細胞の混和材料のテストに基づいて推定した、我々 の画面の高感度で有効だった。復帰、5 字の共同アプリケーションの増加のような低レベルが嘲りながら12,13,16,17, タイトな転写制御の妨害に前述の難しさを証明して複数の調節機構の障害が重要な再活性化を達成するために必要になることを意味します。
注記のうち、私たちの画面で識別されるすべての 30 のヘアピンも Xi 解消抑圧への広範な影響を示す別の x 染色体座に位置する CMV 駆動レポーターの遺伝子が再アクティブ化。薬理学的または遺伝的操作は、レット症候群の治療に非常に有用証明できる、MeCP2 固有"reactivators"が存在するかどうかをテストするのにはさらなる研究が必要です。
私たちのスクリーニング システムでは、前述記者 x 染色体再活性化スクリーン12,17用のいくつかの利点を提供しています。CMV プロモーターによって駆動されているではなく当社記者カセットMeCP2の C 末端のノックは、ネイティブ X リンク プロモーターによって駆動されるため。このデザインは、 MeCP2遺伝子座固有レギュレータ、不死化線維芽細胞所見必要がありますニューロン、MeCP2 の目的のサイトの要約すること警告と、レット症候群のコンテキストで関連性の高いを識別を助けることができます。再アクティブ化します。Hygromycin 抵抗性遺伝子の再活性化イベントの肯定的な選択を有効にし確実スクリーンの感度を増加します。また、hygromycin 抵抗とホタルのルシフェラーゼ遺伝子を含むカセットが両方の大規模スクリーニング hygromycin B とルシフェラーゼ レポーターを使用してテスト/スクリーニング個々 ヘアピン正の選択を使用してできます。
要約すると、レギュレータMeCP2の哺乳類細胞におけるサイレンシングの x 染色体の識別のため堅牢で敏感な遺伝学的スクリーニング法を報告する.この方法論は小さい干渉の RNAs (Sirna) CRISPR をスクリーニングするために合わせることができるまたは小さい分子。このような試金は、レット症候群の場合など、サイレント遺伝子の機能的な遺伝子を再活性化に依存する治療法の確立に役立つかもしれない。
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Disclosures
博士・ レコは、フレッド ・ ハッチンソンがん研究センターの従業員としてこの記事に貢献しました。 見解は、彼自身と国立衛生研究所やアメリカ合衆国政府の見解を必ずしも表さない
Acknowledgments
優雅、スクリーンで使用される shRNA ライブラリを提供するメルボルン大学のロス ディキンズに感謝いたします。この作業によって、レット症候群の研究を信頼 (a. b.) 資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
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